Name: Modelo de transplante de fígado total auxiliar heterotópico de rato utilizando uma hepaticouretorostomia para estudos de rejeição de aloenxerto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprenda o modelo de transplante hepático auxiliar heterotópico em ratos para estudar rejeição de aloenxerto. Este protocolo reduz a complexidade cirúrgica e o estresse animal comparado ao método ortotópico.

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<meta charset="utf8"></head><body>Transplante de fígado em ratos e análise da perviedade do aloenxerto

<ol><li>Lee, S., Edgington, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+liver+transplantation+utilizing+inbred+rat+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterotopic liver transplantation utilizing inbred rat strains.</a> Am J Pathol. 52 (3), 649-669 (1968).</li>
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<li>Kageyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+Injury+in+allogeneic+liver+transplantation%3A+A+role+of+CD4+T+cells+in+early+allograft+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion Injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury.</a> Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>3-0 Sutura de Seda</td><td>Ética</td><td>C013D</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Gravatas de seda</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Gravatas de seda</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>7-0 Gravatas de seda</td><td>Teleflex</td><td>103-s</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de poliamida 9-0</td><td>AROSurgical</td><td>T05A09N10-13</td><td>Preto</td></tr><tr><td>Bautery bipolar</td><td>Codman & Shurtleff Inc.</td><td>P.H. 234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina HCL</td><td>Hospira</td><td>409201232</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Adson-Brown</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11627-12</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Fórceps, Dumont Angulado</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11253-25</td><td>Médico #5/45 11 cm</td></tr><tr><td>Fórceps, Amarração de Sutura&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>18025-10</td><td>10 cm</td></tr><tr><td>Injeção de heparina sódica, USB</td><td>Fresenius Kabi</td><td>504015</td><td>10.000 unidades USP por 10 mL</td></tr><tr><td>Cânula de Hidrodissecção</td><td>Ambler Cirúrgico</td><td>1021E</td><td>27 gramas</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Dechra Vet. Produtos</td><td>17033-091-25</td><td></td></tr><tr><td>Cateter IV</td><td>Kendall</td><td>2619PUR</td><td>26 G x 3/4"</td></tr><tr><td>Sistema de Retração Magnética</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>18200-50</td><td></td></tr><tr><td>Micro Grampos</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>18055-05</td><td>6 milímetros</td></tr><tr><td>Micro Grampos</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>18055-06</td><td>4 milímetros</td></tr><tr><td>Aplicador de micro grampo</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>18057-14</td><td>14 cm</td></tr><tr><td>Micro porta-agulhas</td><td>S& T</td><td>C-14</td><td>14 cm</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Universal S3</td><td>Cabeça dupla</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Puralube</td><td>14590500</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação Polyimidi</td><td>Cole Parmer</td><td>95820-04</td><td>OD 0,0215", identificação 0,0195", parede 0,0010"</td></tr><tr><td>Salino</td><td>Baxter</td><td>281324</td><td>0,9% de cloreto de sódio</td></tr><tr><td>Tesoura de mola cirúrgica</td><td>S& T</td><td>SDC-15</td><td>Sem corte 14 cm</td></tr><tr><td>Tesoura de mola cirúrgica</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>15021-15</td><td>Vannas 14 cm</td></tr></tbody></table>

modelo de transplante de fígado total auxiliar heterotópico de rato utilizando uma hepaticouretorostomia para estudos de rejeição de aloenxerto

Heterotopic Auxiliary Whole Liver Rat Transplant Model Utilizing a Hepaticoureterostomy for Allograft Rejection Studies

Atualmente, 29 pares de ratos foram utilizados para estabelecer o protocolo HALT-PVA, 17 transplantes singênicos e 12 transplantes alogênicos. Os fígados transplantados singênicos sobreviveram até o desfecho experimental designado de 8 ou 30 dias com uma taxa de sucesso de 70%, enquanto os fígados transplantados alogênicos sobreviveram até os desfechos designados de 3 ou 8 dias com uma taxa de sucesso de 50%. As falhas incluem ratos que morreram devido a complicações cirúrgicas e fígados auxiliares que falharam mesmo quando o receptor sobreviveu.
A duração média da operação foi de 130 min, com um tempo de isquemia fria de cerca de 35 min e um tempo de isquemia quente de menos de 25 min. Desde que não houvesse complicações intraoperatórias, os receptores acordavam e se tornavam ativos dentro de 10-20 minutos, começavam a beber e deambular dentro de 1 h e 24 h depois, eles se comportavam como ratos saudáveis normais.
Os enxertos hepáticos singênicos demonstraram excelente cor e permeabilidade do ducto biliar 30 dias após o transplante (Figura 3), enquanto a histologia da hematoxilina e da eosina (H&amp;E) mostrou estrutura normal dos hepatócitos, sem alterações parenquimatosas significativas nos pontos de tempo de 8 e 30 dias (Figura 4A,B). Após apenas 3 dias, a histologia dos transplantes alogênicos mostrou inflamação portal significativa (Figura 4C), enquanto os enxertos alogênicos de 8 dias demonstraram rejeição celular aguda com extensa infiltração linfocítica (Figura 4D).
Amostras de TxL alogênico e singênico representativo foram avaliadas por um patologista hepático certificado, e a rejeição foi pontuada usando o índice de atividade de rejeição do Esquema de Banff (RAI)12. A avaliação patológica determinou que não houve rejeição presente, com um RAI de Banff de 0, em transplantes singênicos de 8 e 30 dias, enquanto os aloenxertos de 8 dias foram severamente rejeitados com um escore de Banff RAI de 9 (Tabela 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático do procedimento HALT-PVA em ratos. A VP é arterializada com a artéria renal esquerda usando um stent, a IHVC é anastomosada término-terminal à veia renal esquerda e o ducto biliar é ligado ao ureter usando um stent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig02.jpg"> 
Figura 2: Procedimento cirúrgico. (A) Hidrodissecção da VP. Dissocie o PV do tecido conjuntivo circundante com uma agulha de hidrodissecção 27 G. (B) Inserção de stent arterial. O stent arterial é inserido em uma pequena abertura em forma de funil cortada na forquilha da bifurcação da artéria renal. (C) Alargamento da veia renal. Para corresponder à maior largura do IHVC doador para anastomose, um pequeno corte na boca do peixe é feito na face da veia renal do receptor após duas suturas de permanência. (D) Enxerto hepático perfundido imediatamente após a anastomose. O posicionamento da artéria renal e da conexão PV abaixo da veia renal e da CVHI é crucial para prevenir a trombose do enxerto. (E) Ratazana HALT-PVA in situ. O fígado auxiliar é posicionado contra a parede esquerda do abdômen antes de retornar os intestinos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig03.jpg"> 
Figura 3: HALT-PVA singênico 30 dias após o transplante. (A) Após 30 dias, o fígado auxiliar tem cor e textura semelhantes ao fígado nativo, enquanto (B) o ducto biliar e o stent PV permanecem pérvios e irrestritos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig04.jpg"> 
Figura 4: Histologia dos enxertos hepáticos auxiliares. Coloração H&amp;E de (A) enxertos singênicos pós-transplante de 8 dias e (B) 30 dias exibindo estrutura hepatócita normal, juntamente com enxertos alogênicos de (C) 3 dias e (D) 8 dias exibindo inflamação portal e infiltração linfocítica. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tx's alogênicos</td>
			<td>Inflamação do portal</td>
			<td>Lesão do ducto biliar</td>
			<td>Inflamação Endo Venosa</td>
			<td>Banff RAI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 dias (LT-34)</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 dias (LT-38)</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 dias (LT-20)</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 dias (LT-40)</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tx's singênicos</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 dias (LT-13)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 dias (LT-19)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 dias (LT-28)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 dias (LT-32)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Esquema de Banff. Índice de atividade de rejeição (RAI) de LTx's alogênicos e singênicos de ratos.

Modelo de transplante de fígado total auxiliar heterotópico de rato utilizando uma hepaticouretorostomia para estudos de rejeição de aloenxerto

Small animal transplant models are indispensable for organ tolerance studies investigating feasible therapeutic interventions in preclinical studies. Rat ...

O principal escopo de nossa pesquisa é investigar os mecanismos por trás da tolerância imunológica após o transplante de fígado. Em seguida, investigamos métodos para diminuir a rejeição hepática e melhorar a sobrevida dos receptores de transplante hepático.A etapa mais difícil neste procedimento de transplante heterotópico é a anastomose término-terminal da veia cava hepática inferior à veia renal. Portanto, qualquer pessoa que se sinta confortável em realizar anastomose término-terminal de uma veia de 3 milímetros por qualquer método tem toda a habilidade técnica necessária para realizar esse procedimento.Os modelos ortotópicos de transplante de fígado de rato são operações tecnicamente desafiadoras que são complicadas por longos tempos de isquemia anepática e inferior do corpo, dificultando a recuperação do animal receptor. O modelo heterotópico de transplante hepático apresentado aqui elimina essas complicações. E não requer habilidades microcirúrgicas avançadas. A rápida recuperação do receptor, na ausência de qualquer tempo de isquemia anepática ou da parte inferior do corpo, é uma vantagem significativa do transplante hepático heterotópico sobre o transplante hepático ortotópico de ratos. Além disso, o estudo da rejeição após transplante hepático ortotópico geralmente depende da morbidade ou morte como desfecho experimental, o que não é o caso desse modelo heterotópico.A perfusão hepática ex vivo normotérmica é uma nova estratégia empolgante para armazenar fígados antes do transplante clínico. No entanto, faltam modelos animais de pequeno porte devido à alta demanda técnica de preparo de fígado para transplante após perfusão normotérmica. Portanto, nosso objetivo é usar nosso modelo de transplante hepático heterotópico para transplantar fígados com sucesso após perfusão normotérmica de maneira confiável e reprodutível.[Narrador] Depois de raspar e desinfetar o abdômen, coloque o rato doador anestesiado em decúbito dorsal em uma almofada de cirurgia aquecida. Após a incisão longitudinal, use cotonetes úmidos para retrair cuidadosamente o fígado e dissecar os ligamentos falciforme, triangular, hepatogástrico e hepatoduodenal. Cauterize os vasos paraesofágicos com pinças bipolares e divida ainda mais entre o lobo caudado lateral esquerdo e anterior. Usando pinças angulares ou porta-agulhas, disseque atrás da veia cava supra-hepática inferior ao diafragma. Em seguida, passe uma sutura de seda 5-0 sob a veia cava supra-hepática e dê um nó duplo frouxamente para uso posterior. Isole a veia cava infra-hepática do tecido retroperitoneal até a veia renal direita. Em seguida, ligue a veia adrenal direita com uma sutura de seda 6-0 o mais próximo possível da veia cava infra-hepática. Usando uma agulha de hidrodissecção de calibre 27, dissocie a veia porta do tecido conjuntivo circundante. Separe a veia porta das veias pilórica e esplênica ligando-as e dividindo-as com uma sutura de seda 7-0. Após o isolamento da artéria hepática comum, ligada com uma sutura de seda 6-0, e dividir a artéria perto de onde ela passa abaixo da veia porta. Ligue o ducto biliar com uma sutura de seda 5-0 na ramificação da artéria gastroduodenal, garantindo a preservação do tecido adiposo ao redor do ducto biliar. Usando uma tesoura de mola, faça uma pequena incisão na parede do ducto biliar proximal à ligadura. Insira um stent de tubo de poliamida no lúmen do ducto biliar e prenda-o com uma sutura de seda 6-0, deixando uma extremidade da sutura longa para uso posterior. Corte entre as ligaduras 5-0 e 6-0 para dividir o ducto biliar. Marque a parte superior da veia cava infra-hepática e da veia porta com uma caneta de corante cirúrgico para auxiliar no alinhamento dos vasos durante a anastomose. Em seguida, prenda a veia porta com uma pinça de microvasos o mais distal possível ao fígado. Insira uma seringa de 20 mililitros com uma agulha de calibre 26 na veia porta proximal à pinça e perfunda o fígado com 10 a 15 mililitros de solução salina heparinizada gelada, dividindo simultaneamente a veia cava infra-hepática usando uma tesoura de mola o mais próximo possível da veia renal direita. Para extirpar o fígado, disseque a veia porta proximal ao microclamp. Em seguida, aperte a sutura 5-0 previamente colocada ao redor da veia cava supra-hepática e disseque o diafragma para transeccionar a veia cava intratorácica. Continue dissecando os ligamentos restantes na parte de trás do fígado e divida a veia adrenal previamente ligada. Coloque o fígado excisado em solução salina fria no gelo. Depois de barbear e desinfetar o abdômen, coloque o rato receptor anestesiado em decúbito dorsal em uma almofada de cirurgia aquecida. Após a incisão longitudinal, use cotonetes úmidos para retrair os intestinos para o lado direito do abdômen e cubra-os com gaze umedecida. Aplique gaze úmida adicional para cobrir o estômago, baço e fígado, expondo o rim esquerdo e os vasos renais. Usando uma agulha de hidrodissecção de calibre 27 e uma pinça de ponta romba, separe a veia renal esquerda da artéria renal, removendo cuidadosamente a gordura e o tecido conjuntivo de ambos os vasos. Usando uma pinça bipolar, cauterize todos os microramos laterais, isolando a veia e a artéria renal entre a aorta ou veia cava e o rim. Depois de isolar as veias gonadal e adrenal, use seda 6-0 para ligá-las temporariamente proximalmente à veia renal. Mobilizou o ureter no polo inferior e ligou com sutura de seda 6-0. Clampeie primeiro a artéria renal e depois a veia renal, com um clamp de microvasos o mais próximo possível da aorta e da veia cava. Passe a artéria renal usando uma tesoura de mola logo após a bifurcação do vaso e divida a veia renal a meio caminho entre a veia cava e o rim. Mobilize o rim esquerdo do tecido conjuntivo circundante e remova-o. Lave os cotos da artéria renal e da veia renal com solução salina heparinizada para remover todo o sangue restante. Usando uma tesoura de mola, faça um pequeno corte na bifurcação da artéria renal para criar uma abertura em forma de funil. Em seguida, insira um stent de 8 milímetros cortado de um cateter de calibre 26 e prenda-o com uma sutura de seda 6-0, deixando uma extremidade da sutura longa. Apresente o fígado do doador e posicione-o com a veia porta, a veia cava infra-hepática e o ducto biliar voltados para a veia e artéria renal esquerda do receptor. Usando uma sutura de náilon 9-0, instalou duas suturas em lados opostos da conexão da veia renal da veia cava infra-hepática. Em seguida, use uma tesoura de mola para fazer uma pequena incisão em boca de peixe na face da veia renal até que a largura corresponda à veia porta infra-hepática do doador. Com uma sutura de seda 9-0, anastomose a veia porta infra-hepática hepática de ponta a ponta à veia renal com nove ou 10 suturas contínuas nas paredes frontal e posterior do vaso. Confirme se a localização da artéria renal está abaixo da veia porta infra-hepática. Em seguida, insira o stent previamente colocado na artéria renal na veia porta do fígado e prenda-o com uma sutura de seda 6-0, deixando uma extremidade da sutura longa para se prender ao fio oposto na artéria. Junte as extremidades para evitar que cada uma escorregue do stent. Sequencialmente, remova os microclamps da veia renal e, em seguida, da artéria renal. Durante a reperfusão hepática, use gaze e cotonetes para aplicar uma leve pressão ao redor da região da anastomose até que uma anastomose sem vazamento seja alcançada. Remova as ligaduras temporárias previamente colocadas nas veias supra-renais e gonadais. Mobilize cuidadosamente aproximadamente 10 milímetros na extremidade do ureter esquerdo do tecido conjuntivo circundante, deixando uma quantidade significativa de tecido adiposo aderido. Com uma tesoura de mola, faça uma pequena incisão na parede do ureter proximal à ligadura 6-0 colocada anteriormente. Insira o stent de poliamida previamente fixado ao ducto biliar na pequena incisão feita na parede do ureter. Prenda o stent com uma sutura de seda 6-0 e amarre uma extremidade com o fio longo no lado do ducto biliar do stent, juntando as duas extremidades firmemente. Retorne os intestinos à sua posição natural e irrigue com dois a 3 mililitros de solução salina. Finalmente, feche o abdômen em camadas. A partir do segundo dia após a cirurgia, injete heparina por via subcutânea em receptores de transplante alogênico diariamente. 30 dias após o transplante, os enxertos hepáticos singênicos exibiram cor e permeabilidade do ducto biliar ideais. A histologia da hematoxilina e da eosina mostrou estrutura normal dos hepatócitos, sem alterações parenquimatosas significativas em intervalos de 8 e 30 dias. Por outro lado, os transplantes alogênicos demonstraram inflamação portal significativa já 3 dias após o transplante e rejeição celular aguda caracterizada por extensa infiltração linfocítica na marca de 8 dias.

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