Name: Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a produzir vetores AAV de alto rendimento usando células HEK293 em suspensão. Este protocolo reduz tempo e mão de obra, aumentando a produção de vetores virais para terapia gênica no sistema nervoso central.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do fundo de pesquisa da Academia Real de Artes e Ciências dos Países Baixos (KNAW) e uma bolsa da Start2Cure (0-TI-01). Agradecemos a Leisha Kopp por sua contribuição e conselhos na configuração do protocolo. As figuras foram criadas usando Biorender.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Royal Netherlands Academy of Sciences (KNAW) e estavam de acordo com a Lei Holandesa de Experimentação Animal sob o projeto número AVD8010020199126. Na Figura 1, uma visão geral esquemática do protocolo completo é fornecida. Da semeadura das células à purificação do AAV, o protocolo leva 6 dias para ser concluído.
1. Preparação dos reagentes
<ol><li>Purificação de plasmídeos<ol><li>Realizar extração de plasmídios conforme descrito pelo fabricante com alguns ajustes para garantir a esterilidade dos plasmídeos.</li>
		<li>Preparar etanol 70% usando água destilada estéril e etanol absoluto.</li>
		<li>Após a etapa de centrifugação do isopropanol, seque os plasmídeos na capela de fluxo e adicione etanol 70% estéril aos tubos. Após a precipitação do etanol, secar os plasmídeos na capela de fluxo e ressuspender o plasmídeo em água destilada estéril. Tome cuidado ao usar tubos de microcentrífuga esterilizados.</li>
		<li>Pegue uma alíquota para quantificação, análise de restrição e, se necessário, sequenciamento. É aconselhável verificar a integridade das repetições terminais invertidas (ITRs), pois as mutações podem ter um impacto negativo no rendimento. Ajustar a concentração da amostra para 1 μg/μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de tampão de lise Tween 10x<ol><li>Dissolver 30,3 g de tampão Tris e 2,033 g MgCl2,6H 2O em 400 mL de água destilada estéril, ajustar o pH para 8,0 e aumentar o volume total para 450 mL.</li>
		<li>Manter Tween 20 estéril, adicionar 50 mL de Tween 20 à solução tampão no exaustor e filtrar esterilizar usando um filtro a vácuo de 0,2 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluições de iodicxanol<ol><li>A solução de iodixanol é fornecida na concentração de 60%. Use a solução inicial para fazer soluções de 15%, 25% e 40%.</li>
		<li>Para solução a 15%, diluir 60 mL de solução a 60% com 48 mL de NaCl 5 M e 48 mL de PBS-MK (5x PBS com 5 mM MgCl2 e 12,5 mM KCl) e adicionar água destilada até 240 mL.</li>
		<li>Para solução a 25%, diluir 67 ml de solução a 60% e 32 ml de PBS-MK. Adicionar água destilada até 160 mL. Misture bem e adicione 1,6 mL de solução de vermelho de fenol.</li>
		<li>Para solução a 40%, diluir 160 ml de solução a 60% com 48 ml de PBS-MK e adicionar água destilada até 240 ml. Para a solução a 60%, adicionar 1 ml de vermelho de fenol a 100 ml de solução a 60%.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de sacarose a 5% PBS<ol><li>Adicionar 25 g de sacarose a um frasco de 500 mL de DPBS sem cálcio ou magnésio. Agite bem e filtre usando um filtro a vácuo de garrafa de 0,2 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de polietilenoglicol (PEG) 8000<ol><li>Dissolver 400 g de PEG 8000 e 24 g de NaCl em água destilada estéril e ajustar para um volume final de 1000 mL. Mexa com o aquecimento até dissolver completamente. Ajuste o pH para 7,4 usando papel pH.</li>
		<li>Esterilizar o filtro usando um filtro a vácuo de garrafa de 0,2 μM para obter uma solução de PEG 8000 a 40%. Observe que a filtração levará um tempo devido à viscosidade do armazenamento da solução a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultura de células de suspensão HEK293
<ol><li>Use lenços umedecidos embebidos em etanol 70% para limpeza. Limpar a coifa de biossegurança, preparar e limpar todos os materiais necessários para a cultura das células.</li>
	<li>Pré-aquecer 30 mL de meio de célula de suspensão a 37 °C em um tubo de cultura cônico de 50 mL. Recuperar células de produção viral de nitrogênio líquido. Descongele rapidamente as células em banho-maria a 37 °C. Pouco antes de o frasco para injetáveis ser completamente descongelado, limpe-o com um lenço embebido em etanol a 70% e transfira o frasco para injetáveis para a tampa de biossegurança. NOTA: Os detalhes das células de produção viral usadas aqui são fornecidos na Tabela de Materiais.</li>
	<li>Transfira rapidamente as células para o tubo de cultura cônico pré-aquecido de 50 mL. Células de cultura em incubadora de agitação a 37 °C, 80% de umidade, 8% de CO2, 200 rotações por min (RPM) e um diâmetro de agitação de 50 mm. Células de passagem, uma vez que a viabilidade está acima de 90% e a densidade celular está acima de 1-3 x 106 células/mL. OBS: A incubadora utilizada possui diâmetro de agitação de 50 mm; As condições de cultura devem ser ajustadas para um diâmetro de agitação diferente.</li>
	<li>Células de passagem 3-4 dias após o descongelamento. Verifique o(s) tubo(s) de cultura para se certificar de que não há sinais de contaminação; Por exemplo, o fungo aparecerá como um anel descolorido (preto ou verde).</li>
	<li>Preparar 400 μL de solução de azul de tripano a 0,4% por amostra utilizando uma stripette de 1 ml.</li>
	<li>Recupere rapidamente as células de suspensão da incubadora. Extrair imediatamente 500 μL do tubo utilizando uma stripette de 1 ml. Pipete suavemente para cima e para baixo.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de suspensão celular ao tubo azul de tripano preparado. Inverta suavemente o tubo para misturar; Não pipetar para misturar, pois isso levará à morte celular. Células de retorno à incubadora.</li>
	<li>Tomar 50 μL de suspensão de células tratadas com azul de tripano e aplicá-lo na lâmina do hemocitômetro. Conte o total de células viáveis e calcule a quantidade de suspensão celular e meio necessário para a passagem ou transfecção no dia seguinte.</li>
	<li>Meio quente na incubadora por 10-15 min. Adicione a suspensão celular ao meio aquecido e retorne à incubadora. Para células de passagem por 3 dias (ou seja, de segunda a quinta-feira), ajuste para 0,5 x 106 células/mL; para células de passagem por 4 dias (ou seja, de quinta-feira a segunda-feira), definido como 0,3 x 106 células/mL. NOTA: De acordo com o fabricante, as células de produção viral dobram a cada 26 h e devem estar entre 3,5 x 106 e 5,5 x 106 antes da passagem. As celas podem ser mantidas por até a passagem 20.</li>
</ol>3. Transfecção
<ol><li>Dia 1<ol><li>T24 h antes da transfecção, cultura 1 x 106 células por mL em 300 mL de meio.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2<ol><li>Meio quente, plasmídeos e reagente de transfecção à temperatura ambiente. Para os montantes a preparar, ver Quadro 1.</li>
		<li>Brevemente plasmídeos de vórtice e reagentes. Adicione plasmídeos ao meio preparado, vórtice. Adicione o reagente de transfecção e o vórtice brevemente. Não agite a mistura após esta etapa. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Enquanto isso, conte as células preparadas no dia 1. As células devem estar entre 2 e 2,5 x 106 células por mL e > 95% viáveis.</li>
		<li>Após a incubação, gota a gota, adicione a mistura de transfecção às células enquanto gira suavemente o tubo. Incubar por 72-96 h.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Colheita das células
<ol><li>Dia 5<ol><li>Adicionar 33 ml de tampão de lise celular 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), agitar suavemente e incubar a 37 °C durante 1,5 h com agitação.</li>
		<li>Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 60 min. Filtrar através de um filtro a vácuo de PES 0,45 μM para clarificar o lisado celular, deixando o lisado clarificado no recipiente do filtro. NOTA: Opcional após a filtração: colher 50 μL de amostra para PCR quantitativo (Q-PCR).</li>
		<li>Adicionar 90 mL de solução de PEG 8000 a 40% a 360 mL de lisado celular filtrado.</li>
		<li>Limpe a barra de agitação com etanol 70% e adicione à amostra. Mexa no gelo ou na câmara fria a 300 RPM por 1 h. Incubar a 4 °C sem mexer durante a noite. NOTA: Foram testados tempos de incubação de 1 h a 72 h. Tempos de incubação mais longos têm um efeito negativo sobre a precipitação global de proteínas.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Purificação de iodicanol
<ol><li>Dia 6<ol><li>Transfira toda a amostra de volume de cultura precipitada de PEG para um tubo cônico grande e limpo e centrífuga a 2820 x g e 4°C por 15 min.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de PEG em 15 mL de DPBS com cálcio e magnésio. O pellet é difícil de ressuspender; Tire um tempo para fazer isso com cuidado.</li>
		<li>Transfira a peça ressuspensa para um tubo limpo de 50 mL. O PEG permanecerá nas laterais do tubo do biorreator. Adicione mais 10 mL, tomando o cuidado de reunir todo o precipitado de PEG. Transfira tudo para um recipiente de 50 mL para um volume total de 25-30 mL.</li>
		<li>Adicionar 40 μL de DNaseI (10 U/μL). Colocar na incubadora por 1 h 37°C. NOTA: Opcional após a incubação da DNase: tomar 50 μL de amostra para Q-PCR.</li>
		<li>Barras de agitação limpas que foram usadas para precipitação de PEG bem com solução de cloreto seguida de etanol 70%. Deixe as barras de agitação em etanol 70% para o próximo experimento.</li>
		<li>Preencher um tubo de polialômero de 25 mm x 89 mm usando uma pipeta de vidro Pasteur com 15,5 mL de lisado celular concentrado em cada tubo. Depois de adicionar o lisado celular, troque a pipeta de vidro Pasteur por uma nova.</li>
		<li>Adicionar soluções de iodixanol a 15%-60%: infundir suavemente 9 ml da solução de iodixanol a 15% sob o lisado celular. Em seguida, adicionar 5 mL das soluções de iodixanol a 25% e 40% e, por último, adicionar 5 mL da solução de iodixanol a 60%.</li>
		<li>Tampe o tubo usando uma seringa com DPBS +/+ para remover a maioria das bolhas de ar, tomando cuidado para não perturbar as camadas de iodixanol. Sele o tubo usando um topper de tubo elétrico.</li>
		<li>Centrifugar em rotor não oscilante por 1 h 10 min a 490.000 x g a 16 °C em uma ultracentrífuga. Retire da ultracentrífuga, monte os tubos em um fecho metálico e prepare os tubos de coleta. Abra o rotor no capô em caso de derramamentos durante a fiação.</li>
		<li>Preparar um tubo de 50 mL (para descartar o tubo rotor), um tubo de 15 mL (para coletar vírus), uma seringa de 5 mL e uma agulha de 30G e 19G por gradiente.</li>
		<li>Puncione um orifício na parte superior do tubo com uma agulha de 30G. Deixe a agulha no lugar. Coloque uma agulha 19G na seringa.</li>
		<li>Puncione cuidadosamente o tubo logo abaixo da interface de 40%/60%, que pode ser vista pelo indicador vermelho de fenol. Certifique-se de que o bisel da agulha está voltado para a camada de 40%.</li>
		<li>Retire a agulha 30G da parte superior do tubo usando a mão não dominante. Com a agulha chanfrada, extraia lentamente o vírus/iodixanol. O objetivo é extrair entre 3 mL e 4,5 mL. Cerca da metade do caminho e bem na camada de 40%/transparente, gire a agulha para que o bisel fique virado para baixo e continue a extrair para evitar a coleta da camada de proteína.</li>
		<li>Preparar o tubo de 50 mL com a mão não dominante, extrair cuidadosamente a agulha enquanto coloca o tubo no tubo de 50 mL e descartar. Diluir a suspensão de AAV/iodixanol 5x em DPBS enchendo até 15 mL.</li>
		<li>Transfira para um tubo de filtro centrífugo e centrífuga a 3428 x g, 4 °C por 10 min. Escoamento de descarte; Remova suavemente o suporte do filtro e coloque o recipiente inferior em uma garrafa de resíduos. Adicionar 15 mL de sacarose PBS-5% para filtrar e ressuspender.</li>
		<li>Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 20 min. Repita a troca de buffer pelo menos 3x. Armazenar vírus (~150-250 μL) a 4 °C (PHP. B variantes no máximo 3 meses) ou alíquota em alíquotas de 50 μL e armazenar a -80 °C a longo prazo. NOTA: PHP. As variantes do capsídeo B são sensíveis ao congelamento/descongelamento, por isso isso deve ser evitado.</li>
		<li>Realizar titulação conforme descrito em protocolo anterior10.</li>
	</ol></li>
</ol>

Produção simplificada e eficiente de AAV usando a cultura de suspensão HEK293

<ol><li>Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+of+administration+for+adeno-associated+viruses+carrying+gene+therapies+for+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases.</a> Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).</li>
<li>Pietersz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhP.B+Enhanced+adeno-associated+virus+mediated-expression+following+systemic+delivery+or+direct+brain+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Several+rAAV+vectors+efficiently+cross+the+blood%E2%80%93brain+barrier+and+transduce+neurons+and+astrocytes+in+the+neonatal+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22MolTher%22%5BJournal%5D)">Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system.</a> MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).</li>
<li>Goertsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+variants+with+brain-wide+transgene+expression+and+decreased+liver+targeting+after+intravenous+delivery+in+mouse+and+marmoset%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset.</a> Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li>
<li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((purification%2C+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> J Vis Exp. (143), e58960(2019).</li>
<li>Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+dual+promoter+adeno-associated+viral+vector+for+efficient+delivery+of+two+genes+to+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Thr%22%5BJournal%5D)">A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons.</a> Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).</li>
<li>Verhaagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+gene+therapy%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal gene therapy, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).</li>
<li>Nasse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addgene+AAV+data+hub%3A+A+platform+for+sharing+AAV+experimental+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data.</a> Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).</li>
<li>Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+using+suspension+HEK293+cells+and+continuous+harvest+of+vector+from+the+culture+media+for+GMP+FIX+and+FLT1+clinical+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector.</a> Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).</li>
<li>Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).</li>
</ol>

Uma amostra gratuita de TransIT foi fornecida pela Mirus para testes iniciais, após os quais o reagente foi comprado para uso posterior. Os autores não têm outros interesses financeiros concorrentes a relatar.

A administração sistêmica de AAV é uma poderosa ferramenta para a transferência gênica para o SNC; no entanto, a produção de AAV é um processo caro e trabalhoso. Com o uso de células de suspensão, a mão de obra e os plásticos são reduzidos em comparação com a cultura aderente de HEK293T em placas de 15cm2 . Além disso, os tubos cônicos implementados aqui são fáceis de manusear e maximizam o uso do espaço do laboratório. O protocolo foi montado por dois pesquisadores e, posteriormente, aplicado por outros no laboratório. Uma série de produções de três pesquisadores independentes produziu, em média, vetores suficientes por lote para injetar de 6 a 7 camundongos.
O uso de células de suspensão HEK293 já foi descrito anteriormente13,14. No entanto, a linhagem de células de suspensão descrita não está disponível gratuitamente para fins de pesquisa. Esse é um gargalo para os pesquisadores acadêmicos na aplicação dos métodos descritos. A linhagem de células de suspensão descrita neste protocolo está disponível gratuitamente para fins de pesquisa. A cultura de células em suspensão foi feita em tubos cônicos ao invés de Erlenmeyer para economizar espaço e tempo. Com a de Erlenmeyer, até 4 produções podem ser cultivadas simultaneamente, contra 12 produções que utilizam tubos cônicos. Os tubos cônicos podem ser transferidos diretamente para a centrífuga para a colheita.
Uma possibilidade alternativa para um sistema de cultura de células em suspensão é o sistema baculoviral. Uma vantagem do sistema baculo é que essas células e meios estão disponíveis publicamente e podem ser facilmente aplicados. Para os acadêmicos, repositórios como o Addgene estão disponíveis, contendo uma grande biblioteca de plasmídeos de transferência de AAV prontos para uso12. Embora estes também possam ter ressalvas, como ITRs defeituosos, eles servem como uma boa fonte para experimentos plug-and-play. A escolha foi feita para manter um sistema de produção baseado em HEK293, pois os plasmídeos disponíveis podem ser usados diretamente para a produção sem a transferência da construção para o baculovírus.
Para transfecção, a polietilenoimina é relativamente barata e é, portanto, o reagente de transfecção de escolha. Como alternativa, um novo método de transfecção (TransIt) foi avaliado para aumentar o rendimento dos vetores. Uma melhora de três vezes foi observada usando metade da quantidade de plasmídeos. Isso torna o TransIt um reagente de transfecção alternativo interessante quando estoques maiores são necessários. Uma limitação disso é o custo, tornando-o menos interessante para pequenos lotes.
Em resumo, aqui é apresentado um protocolo que pode ser usado para produzir AAV de alto rendimento em células de suspensão em um ambiente de laboratório acadêmico. São descritas ferramentas que podem ser usadas em um ambiente de laboratório acadêmico para produzir AAV com alto rendimento.

O vírus adenoassociado (AAV) foi descoberto em 1965 e, desde então, tem sido usado em uma infinidade deaplicações1. Os AAVs têm sido aplicados em pesquisas em neurociência para estudar genes e funções neuronais, mapear neurocircuitos ou produzir modelos animais para doenças2. Tradicionalmente, isso é feito injetando-se diretamente no local de interesse, pois a maioria dos sorotipos naturais não atravessa a barreira hematoencefálica ou necessita de uma dose alta para fazê-lo 1,2,3.
Com a descoberta da AAV. PHP.B4 e capsídeos de próxima geração, como AAV. PHP.eB5 e AAV. CAP-B106, é possível atingir o sistema nervoso central (SNC) com uma simples injeção sistêmica. O mapeamento espacial revela as células alvo do AAV. PHP.eB a nível celular 6,7. Em combinação com promotores/potencializadores específicos, esses capsídeos oferecem amplas oportunidades para neurocientistas estudarem genes e função cerebral por meio da liberação não invasiva de AAV 4,8.
Enquanto uma dose mais baixa é necessária para AAV. PHP.eB (tipicamente 1 a 5 x 1011 Cópias do Genoma (GC)/rato) em comparação com AAV9 (4 x10 12 GC/rato)7, ainda é necessário produzir mais vetor em comparação com as estratégias de injeção direta (tipicamente 1 x 109 GC/μL injecção). A maioria dos sorotipos naturais pode ser produzida utilizando o sistema clássico de cultura celular aderente em combinação com a purificação do iodixanol 9,10,11,12. Para AAV. PHP.eB isso implica um processo trabalhoso para cultivar e transfectar células para obter vetores suficientes para um experimento8. Portanto, desenvolveu-se a produção de AAV em cultura de células de suspensão em tubos cônicos. Os tubos cônicos, com capacidade de até 300 mL, são compactos, economizando espaço na incubadora e plásticos. As células de suspensão são muito mais fáceis de cultivar e manusear em grandes quantidades do que as células aderentes em placas de 15 cm. Os componentes de transfecção do protocolo permanecem os mesmos. Portanto, plasmídeos previamente utilizados com o sistema aderente podem ser facilmente utilizados neste protocolo baseado na produção em células de suspensão. O protocolo foi transferido com sucesso para outros pesquisadores no laboratório e usado com sucesso para vários capsídeos e construtos.

<table><tbody><tr><td>Tubo de Polipropileno Redondo Quick-Seal de 39 mL, 25 x 89 mm - 50Pk</td> Adaptador <td>de 342414</td><td></td><td>Coulter Beckman</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 600 mL, para rotor S-4x1000,&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5920701002</td><td></td></tr><tr><td>Placa Adaptadora se encaixa em 16 biorreatores de 600 ml</td><td>Infors HT / TPP</td><td>587633</td><td></td></tr><tr><td>Tampas à prova de aerossóis, para baldes redondos de 750 mL</td><td>eppendorf</td><td>5820747005</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, baldes redondos e adaptador 15 mL / 50 mL tubos cônicos</td><td>eppendorf</td><td>5948000315</td><td></td></tr><tr><td>Água Destilada</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>15230147</tr><tr><td>DNase I recombinante, sem RNase</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I recombinante, sem RNase Roche</td><td></td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, cálcio, magnésio</td><td>Gibco</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Unidades de filtro PES descartáveis 0,2</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>FB12566504</tr><tr><td>Unidades de Filtro PES Descartáveis Fisherbrand 0,45</td> Suporte <td>de FB12566505</td><td></td><td>Fisher</td></tr><tr><td>para tubos de cultura de 50 ml também se encaixa no tubo de falcão</td><td>Infors HT / TPP</td><td>31362</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para tubo de cultura de células de 600 ml</td><td>Infors HT / TPP</td><td>66129</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Minitron 50 mm</td><td>Infors HT</td><td>500043</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAX Meio de Produção</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>A3583401</tr><tr><td>N-Tray Universal</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>31321</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep - Iodixanol</td><td>Serumwerk bernburg</td><td>1893</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Cloridrato de Polietilenomina Linear de Grau de Transfecção (MW 40,000)</td><td>Poly-sciences</td><td>24765-100</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Fenol vermelho&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72420100</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilenoglicol) 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-VirusGEN</td><td>Mirus</td><td>Mir 6706</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>5250061</td><td></td></tr><tr><td>Biorreatores TubeSpin-50ml</td><td>TTP</td><td>87050</td><td></td></tr><tr><td>Biorreatores TubeSpin-600ml</td><td>TTP</td><td>87600</td><td></td></tr><tr><td>Células de Produção Viral</td><td>Gibco</td><td>A35347</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 MWCO 100 000</td><td>Cytvia</td><td>28932363</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão hek293

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

Os vetores virais adenoassociados (AAVs) são uma ferramenta notável para a investigação do sistema nervoso central (SNC). Capsídeos inovadores, como o AAV. PHP.eB, demonstram extensa transdução do SNC por injeção intravenosa em camundongos. Para obter transdução comparável, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x10 11 cópias do genoma/camundongo) é necessário em comparação com a injeção direta no parênquima do SNC. Em nosso grupo, a produção de AAV, incluindo AAV. O PHP.eB baseia-se em células HEK293T aderentes e no método de tripla transfecção. Alcançar altos rendimentos de AAV com células aderentes envolve um processo trabalhoso e intensivo em material. Essa restrição motivou o desenvolvimento de um protocolo para cultura de células em suspensão em tubos cônicos. Os AAVs gerados em células aderentes foram comparados com o método de produção em suspensão. Foram comparadas culturas em suspensão utilizando os reagentes de transfecção Polietilenimina ou TransIt. Os vetores AAV foram purificados por ultracentrifugação com gradiente de iodixanol seguido de troca e concentração de tampão com filtro centrífugo. Com o método aderente, obteve-se uma média de 2,6 x 1012 cópias do genoma (CG) no total, enquanto o método de suspensão e Polietilenimina produziram 7,7 x10 12 GC no total, e TransIt produziu 2,4 x 1013 GC no total. Não há diferença na eficiência de transdução in vivo entre vetores produzidos com aderência em relação ao sistema de células de suspensão. Em resumo, um protocolo de produção AAV baseado em células HEK293 de suspensão é introduzido, resultando em uma quantidade reduzida de tempo e mão de obra necessária para a produção de vetores, enquanto alcança rendimentos 3 a 9 vezes maiores usando componentes disponíveis de fornecedores comerciais para fins de pesquisa.

A maioria dos laboratórios acadêmicos utiliza células HEK293T aderentes para a produção de AAV 8,9. Embora isso funcione relativamente bem quando pequenas quantidades de AAV são necessárias para injeção direta, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x 1011 GC/mouse) é necessário para obter transdução semelhante com capsídeos sistêmicos, como AAV. PHP.eB.
Nesse protocolo, foi estabelecida a produção de AAV utilizando células HEK293 em suspensão cultivadas em tubos cônicos. As culturas em pequena escala podem ser feitas em tubos de 50 mL e em grande escala em tubos de 600 mL. Para agitadores específicos (consulte Tabela de Materiais), um rack pode ser usado no qual até 16 tubos grandes podem ser cultivados simultaneamente. Esse rack é usado em combinação com insertos especiais para tubos de 50 mL (Figura 2A). Esse sistema oferece um ganho significativo de tempo para o segmento de cultivo e transfecção deste protocolo. O arranjo inicial da produção foi feito com construtos repórteres para luciferase e proteína fluorescente verde (GFP)10,11. Paralelamente, a construção da GFP foi produzida em placas de 12,15cm2, conforme descrito em protocolo previamentepublicado12. Em média, um rendimento total de 7,7 x10 12 GC foi obtido usando polietilenimina (PEI) e 2,4 x10 13 GC usando TransIt (Figura 2B). Para o PEI, trata-se de uma melhoria de quase 3 vezes; para o TransIt, é uma melhora de 9,2 vezes em relação aos títulos obtidos com cultura aderente (2,6 x 1012). Quando usado para transfectar células de suspensão, o TransIt proporciona uma melhora de aproximadamente 3 vezes no rendimento em comparação com o PEI (Figura 2B).
Posteriormente, o desempenho dos vetores AAV foi testado in vivo. Os vetores GFP foram produzidos com PEI e TransIt e comparados com os vetores GFP produzidos com o sistema aderente clássico. 4 semanas após a injeção, camundongos (6 semanas C57BL/6 fêmeas pesando 20-25 g) foram sacrificados, e a expressão de GFP no cérebro de camundongos foi avaliada por histologia (Figura 3A). A análise comparativa foi feita em cortes sagitais do cérebro. Não foi observada diferença no padrão de transdução do vírus produzido por esses métodos de produção (Figura 3B). A atividade da luciferase dos vetores produzidos por ambos os métodos também foi avaliada. A transdução foi medida in vivo por 3 semanas; o padrão de expressão ao longo do tempo é semelhante, independentemente do reagente de transfecção utilizado (Figura 4).
Em seguida, o protocolo foi testado e implementado por outros membros da equipe (Tabela 2). A produção de outros capsídeos com PEI foi bem sucedida, obtendo-se um rendimento médio de 3,5 x10 12 vetores GC. Para a produção de capsídeo B10, uma melhoria de 3 vezes pode ser alcançada usando TransIt versus PEI. Para outro projeto, várias construções embaladas em AAv.PHP.eB deram um rendimento médio de 3,7 x 1012, o que é suficiente para injetar 7 camundongos por via intravenosa a uma dose de 5 x 1011 GC por camundongo. Esses resultados ilustram que o protocolo pode ser utilizado com sucesso por vários pesquisadores para vários capsídeos e combinações de construtos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática da produção. No dia 1 (D1), as células são cultivadas em tubos de 300 mL. No dia 2 (D2), as células são transfectadas com os plasmídeos relevantes. No dia 5 (D5), as células são colhidas e lisadas com tampão de lise de tween 10x. Após a lise, os restos celulares são removidos por centrifugação. Posteriormente, o lisado celular é filtrado para remover grandes proteínas, e o vírus AAV é precipitado usando Polietilenoglicol (PEG) 8000. No dia 6 (D6), a purificação e concentração do iodixanol são realizadas. O concentrado de PEG do dia anterior é tratado com DNase e posteriormente colocado através de um gradiente de iodixanol. Os vetores purificados são posteriormente dessalinizados e concentrados usando um filtro centrífugo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig02.jpg"> Figura 2: Configuração da incubadora e rendimento dos AAV. (A) As células de produção viral são cultivadas em uma incubadora de agitação com um diâmetro de agitação de 50 cm. Esta incubadora é equipada com uma placa adaptadora para tubos de 600 mL e insertos especiais para tubos de 50 mL produzidos pelo departamento de mecatrônica. (B) Após a configuração inicial, o repórter constrói usando polietilenoimina (PEI; 7,7 x10 12 GC total, n=5) ou TransIt (2,4 x10 13 GC total, n=5) como método de transfecção e comparado com os rendimentos obtidos com o método aderente clássico (2,6 x10 12 GC total, n=5), como descrito em Verhaagen et al.12. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig03.jpg"> Figura 3: Padrão de expressão da GFP após avaliação in vivo . (A) Representação esquemática de uma construção vetorial típica de AAV contendo o promotor ubíquo CMV potencializador imediato-precoce, promotor de β-actina de frango e local aceptor de emenda de β-globina de coelho (CAG) seguido de proteína fluorescente verde (GFP), o elemento regulador pós-transcricional (WPRE) do vírus da hepatite de Woodchuck (WHV) e uma cauda de poliadenilação (pA)13. Aqui, camundongos fêmeas com 6 semanas de idade (n=3) receberam uma injeção na veia caudal contendo 5 x10 11 cópias genômicas totais (gc)/camundongo. Após 4 semanas da injeção, os camundongos foram sacrificados e os cérebros analisados por histologia. (B) Representação representativa do padrão de transdução em cortes sagitais, usando células de HEK293T aderentes e células de suspensão com reagente de transfecção de polietilenoimina (PEI) ou TransIt, um padrão de transdução semelhante é observado independentemente do método de produção utilizado. Barra de escala = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig04v2.jpg"> Figura 4: Atividade semelhante da luciferase, independentemente do método de transfecção. (A) Representação esquemática do construto usado contendo o promotor ubíquo CMV intensificador imediato-precoce, promotor de β-actina de frango e local aceitador de emenda de β-Globina de coelho (CAG) luciferase (LUC) com um tag V5 e uma cauda de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (BGHpA), 5 x10 11 GC total/camundongo (n=3) foi injetado através da veia caudal, atividade luciferase na área cranial (circundado em vermelho, em imagem de exemplo) como imagem bioluminescente foi medida semanalmente. (B) A atividade bioluminescente foi medida como unidades de luminescência relativa (RLU) representadas como uma barra azul para a produção de PEI e uma barra marrom para TransIt. Nenhuma diferença significativa na atividade da luciferase na área cerebral selecionada foi observada entre os grupos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig04largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Parâmetros de transfecção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/table%201_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Rendimentos do protocolo implementado. Protocolo de suspensão utilizado por outros pesquisadores para a produção do AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/table%202_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...

Nosso laboratório usa vetores virais como uma plataforma para entregar genes terapêuticos ao sistema nervoso lesado. Recentemente, numerosos vetores virais não invasivos que são capazes de atravessar a barreira hematoencefálica foram desenvolvidos. O uso desses vetores requer altos títulos e, portanto, um processo de produção aprimorado.A implementação do nosso procedimento de célula de suspensão HEK293 torna este protocolo AAV menos trabalhoso em comparação com outros sistemas baseados em células aderentes, ao mesmo tempo em que ganha maiores rendimentos de vetores AV. Não existem tratamentos para reparar os danos no sistema nervoso central. Nosso objetivo é utilizar vetores virais não invasivos para estimular o reparo do sistema nervoso central.A vantagem desse protocolo é que agora podemos produzir vetores virais de alto rendimento, o que nos permite realizar a entrega de genes terapêuticos não invasivos ao sistema nervoso central lesado. Nosso trabalho atual abrirá o caminho para o desenvolvimento de terapia gênica não invasiva para múltiplas doenças neurodegenerativas, como esclerose múltipla, Parkinson e doença de Alzheimer.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Recombinante adeno-associated virus (rAAVs) vetores estão se tornando cada vez mais valioso...

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Um protocolo para geração de vetores adenovirais de alta capacidade sem todas as sequências codificadoras virais é apresentado. A clonagem de transgenes contidos no genoma do vetor é baseada em endonucleases homing. A amplificação do vírus em células produtoras cultivadas como células aderentes e em suspensão depende de um vírus auxiliar que fornece genes virais em trans.

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 1013 vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção de adenovírus usando o sistema pAdEasy. A tecnologia inclui a recombinação dos plasmídeos pAdEasy-1, a embalagem e amplificação do adenovírus, a purificação das partículas adenovirais do meio de cultura e lise celular, a titulação viral e o teste funcional do adenovírus.

Um método eficiente para a produção de adenovírus

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

O vírus adenoassociado recombinante (rAAV) é amplamente utilizado para liberação clínica e pré-clínica de genes. Um uso subestimado para rAAVs é a transdução robusta de células cultivadas sem a necessidade de purificação. Para pesquisadores iniciantes no rAAV, fornecemos um protocolo para clonagem de transgênico, produção bruta de vetores e transdução de cultura celular.

Expressão de Transgenes em Células Cultivadas Usando Vetores Virais Adenoassociados Recombinantes Não Purificados

À medida que o campo da terapia gênica continua a evoluir, há uma necessidade crescente de métodos inovadores que possam enfrentar esses desafios. Aqui, é apresentado um método único, que agiliza o processo de geração de vetores AAV de alto rendimento e alta pureza usando uma plataforma de fábrica de células, atendendo aos padrões de qualidade para estudos in vivo .

Um procedimento simplificado e padronizado para gerar vetores de vírus adeno-associados de alto título e alta qualidade utilizando uma plataforma de fábrica de células

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

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Neste vídeo, descrevemos um método para imagens de células vivas de células em divisão assimétrica órgão sensorial progenitoras e células epidérmicas em...

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Aprenda a produzir vetores AAV de alto rendimento usando células HEK293 em suspensão. Este protocolo reduz tempo e mão de obra, aumentando a produção de vetores virais para terapia gênica no sistema nervoso central.

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

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