Name: Hibridização In Situ de Fluorescência Infravermelha Óptica Fototérmica (OPTIR-FISH) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: Aprenda a técnica OPTIR-FISH para identificar células individuais e analisar seu metabolismo em nível de célula única. Este método avançado combina imagem infravermelha fototérmica com hibridização in situ por fluorescência.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo Abrangente para Identificação Celular e Análise Metabólica Usando OPTIR-FISH

<ol><li>Evers, T. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+metabolic+heterogeneity+by+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis.</a> Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).</li>
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<li>Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -Q., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-independent+methods+for+studying+environmental+microorganisms%3A+methods%2C+application%2C+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).</li>
<li>Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+metabolic+activities+in+single+cells%2C+with+emphasis+on+nanoSIMS%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS.</a> FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).</li>
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<li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+integration+with+other+imaging+modalities+for+greater+molecular+understanding+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues.</a> Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).</li>
<li>Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labelling+in+vibrational+spectroscopy%3A+a+technique+to+decipher+the+structure+of+surface+species%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Catal%22%5BJournal%5D)">Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species.</a> Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).</li>
<li>Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal-fluorescence+in+situ+hybridization+for+functional+analysis+and+genetic+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells.</a> Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+oligodeoxynucleotide+probes+for+the+major+subclasses+of+proteobacteria%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22System+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions.</a> System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+suite+of+16S+rRNA-specific+oligonucleotide+probes+designed+to+investigate+bacteria+of+the+phylum+cytophaga-flavobacter-bacteroides+in+the+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment.</a> Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).</li>
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<li>Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bond-selective+imaging+by+optically+sensing+the+mid-infrared+photothermal+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect.</a> Sci Adv. 7 (20), (2021).</li>
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<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsecond+fingerprint+stimulated+Raman+spectroscopic+imaging+by+ultrafast+tuning+and+spatial-spectral+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning.</a> Nat Commun. 12 (1), 3052(2021).</li>
<li>Fu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+non-fluorescent+molecules+by+photothermal+relaxation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy.</a> Nat Photon. 17, 330-337 (2023).</li>
<li>Tamamitsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+widefield+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared widefield nanoscopy.</a> arXiv. , (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>96%</td><td>Etanol ThermoScientific</td><td>T032021000</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de Cálcio</td><td>Crystran</td><td>CAFP10-0.35</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-Gluocose (U-13C6, 99%)</td><td>Cambridge Isotopic Laboratories</td><td>CLM-1396-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>formamida</td><td>ThermoScientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani caldo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Sais Mínimos 5x</td><td>SIGMA</td><td>M6030-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento OPTIR</td><td>Espectroscopia Fototérmica Corp.</td>Solução de Paraforaldeído LS <td></td><td>mIRage</td></tr><tr><td>, 4% em PBS</td><td>Solução de</td> poli-L-lisina <td>J19943-K2</td><td></td>da ThermoScientific</tr><tr><td>0,1% (p/v)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Tris(hidroximetil)aminometano, 99+%</td><td>ThermoScientific</td><td>A11379.18</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja Trypic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

hibridização in situ de fluorescência infravermelha Óptica fototérmica (optir-fish)

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

O fluxo de trabalho geral para análise metabólica microbiana de célula única com identificação genética por OPTIR-FISH é resumido em Figura 2. Os resultados representativos que demonstram a capacidade de imagem metabólica de célula única do OPTIR são mostrados em Figura 3. Este exemplo usou células de E. coli incubadas com 12C- ou 13C-glicose por 24 h. A incorporação de 13C em proteínas demonstrou causar um desvio significativo para o vermelho das amidas proteicas I e II (Figura 3A)17,18. Portanto, esses dois números de onda principais que representam o 12Proteína C (1656 cm-1, banda normal de amida I) e 13Proteína C (1612 cm-1, banda de amida I deslocada) foram selecionadas e as imagens OPTIR nesses dois números de onda foram adquiridas. As imagens de campo claro correspondentes também são mostradas para demonstrar a morfologia das células (Figura 3B,E). As bactérias em forma de bastonete podem ser claramente resolvidas no nível de uma única célula em imagens de campo claro e OPTIR, confirmando a alta resolução espacial da técnica OPTIR (Figura 3B-G). Para células incubadas com 12C-glicose (Figura 3B-D), uma intensidade mais alta em 1656 cm-1 foi observado, enquanto um maior 1612 cm-1 intensidade foi observada para as células incubadas com 13C-glicose (Figura 3E-G). Essa mudança de pico indica a incorporação de isótopos de carbono mais pesados na massa proteica17. A avaliação foi estendida para avaliar a capacidade do OPTIR-FISH em discriminar táxons bacterianos e suas atividades metabólicas em amostras multiespécies. Misturamos artificialmente duas espécies bacterianas que são predominantes no microbioma intestinal humano: E. coli e B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli células incubadas com 13A C-glicose foi hibridizada com uma sonda Gam42a-Cy5, visando o rRNA 23S de Gammaproteobacteria10. B. theta células incubadas com 12A C-glicose foi hibridizada com a sonda Bac303-Cy3, visando o rRNA 16S da maioria das espécies de Bacteroidaceae11. É muito difícil diferenciar as duas espécies com base nas imagens de campo claro, uma vez que ambas são em forma de bastonete (Figura 4A). Assim, a imagem de fluorescência multicolorida de sondas hibridizadas foi essencial para atribuir uma identidade taxonômica a cada célula bacteriana analisada (Figura 4B). Ao subtrair imagens OPTIR adquiridas em 1612 cm-1 de 1656 cm-1, notamos que um segmento de células nesta amostra bi-espécie apresentou valores de subtração positivos (Figura 4C), indicando a incorporação de 13Isótopos C. Com base nas condições de cultivo, atribuímos as células com valor de subtração positivo a serem E. colie o valor de subtração negativo a ser B. theta. A atribuição de espécies bacterianas é confirmada pelos resultados da imagem de fluorescência: as células que produzem valores de subtração positivos produzem contraste Cy5, que é específico para E. coli, e as células que produzem valores de subtração negativos produzem B. theta-contrastes específicos do Cy3. Em seguida, foi calculada a razão de substituição isotópica, neste caso, recém-sintetizada 13Proteína C de 13C-glicose (Figura 4D). Como esperado, uma diferença significativa na taxa de substituição isotópica entre as duas espécies bacterianas (teste t pareado, p = 9,74 x 10-33) foi observado. Este conjunto de dados ressalta a viabilidade de aplicar a plataforma OPTIR-FISH para estudar o metabolismo em um ambiente complexo onde várias espécies de amostras estão presentes.
<img alt="Análise microbiana; hibridização de fluorescência, marcação isotópica, imagem OPTIR, fenótipo de genótipo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Esquema para a plataforma OPTIR-FISH para identificação simultânea de espécies e análise do metabolismo. Diferentes membros da comunidade microbiana podem ser identificados pela ligação específica das sondas de RNA ribossômico microbiano por meio de hibridização in situ de fluorescência e detectados por imagens de fluorescência dos fluoróforos anexados. A atividade metabólica pode ser analisada por cultura com substratos isotópicos e detectada por imagens OPTIR. A imagem OPTIR detecta a mudança de espalhamento induzida pela absorção de IR, e o OPTIR é inerentemente compatível com ferramentas fluorescentes amplamente utilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama do processo de marcação isotópica: FISH microbiano, análise OPTIR, determinação de identidade, proporções." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Fluxo de trabalho geral para análise de célula única da atividade metabólica com identificação genética por OPTIR-FISH. (A) As células bacterianas foram cultivadas com substratos marcados isotopicamente. (B) A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi então realizada. (C) Preparação da amostra em lâmina transparente IR. (D) Imagens de campo claro identificam as regiões com densidade celular ideal. (E, H) A imagem de fluorescência multicolorida de diferentes fluoróforos FISH revela a identidade genética de células individuais conforme especificado por sondas FISH ou permanece desconhecida. (F, G) A imagem OPTIR multiespectral subsequente no pico normal e deslocado revela a incorporação isotópica na biomassa microbiana. Referenciando os espectros OPTIR para amostras não rotuladas e totalmente marcadas (coeficiente h), a contribuição relativa dos biocomponentes regulares (cr) e isotópicos (ci) pode ser quantificada. A síntese de proteínas a partir de substratos metabolizados marcados isotopicamente foi quantificada usando a "taxa de substituição isotópica". (I) Por OPTIR-FISH, uma análise de alto rendimento da atividade metabólica de espécies microbianas em uma população complexa pode ser obtida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Espectroscopia de E. coli usando 12C/13C-glicose; Espectros OPTRIR; imagens de campo claro e OPTIR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Espectros OPTIR representativos e resultados de imagem. (A) Espectros OPTIR para células de E. coli cultivadas com 12C-glicose (ciano) e 13C-glicose (laranja) cobrindo a região da amida I e amida II. Um pico claro de amida I com desvio para o vermelho (1656 cm-1 a 1612 cm-1) é observado para 13células cultivadas com C-glicose. Imagens representativas de campo claro e OPTIR de células de E. coli em amida I normal e banda de amida I deslocada sob condições de cultura de (BD) 12C-glicose e (EG) 13C-glicose. Barras de escala: 10 μm. Essa figura foi modificada com permissão de Bai et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Imagens de campo claro e microscopia FISH com subtração OPTIR, gráfico de quantificação de E. coli e B. theta." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Imagens representativas e resultados de quantificação de misturas bacterianas. As células de E. coli foram incubadas com 13C-glicose, seguida de hibridização com a sonda de oligonucleotídeos Gam42a-Cy5. As células B. theta foram incubadas com 12C-glicose, seguida de hibridização com a sonda de oligonucleotídeos Bac303-Cy3. (A) A imagem de campo claro mostra a morfologia da mistura celular. (B) A imagem de fluorescência em duas cores mostra a distribuição de E. coli (vermelho) e B. theta (verde). (C) O resultado da subtração OPTIR (1612 cm-1-1656 cm-1) mostra o metabolismo proteico das células bacterianas. (D) Quantificação da taxa de substituição isotópica representando a proteína 13C recém-sintetizada a partir da glicose 13C. (Teste t pareado: p = 9,74 x 10-33). Barras de escala: 10 μm. Essa figura foi modificada com permissão de Bai et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Hibridização In Situ de Fluorescência Infravermelha Óptica Fototérmica (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

optical-photothermal-infrared-fluorescence-situ-hybridization-optir

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Descrevemos aqui um simples fluorescência de hibridação in situ (FISH), o método para a localização de vírus e bactérias, em tecidos de plantas e de insectos. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de mRNA em toda montagem e cortes microscópicos.

Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

Este manuscrito apresenta um método detalhado para a geração X-cromossomo braço sondas e realizando fluorescência situ hibridação in (peixe) para examinar o estado da irmã coesão cromátide em prometafase e metáfase prendi  Drosófila ovócitos. Este protocolo é apropriado para determinar se a coesão de braço meiótica é intacta ou interrompidos em diferentes genótipos.

Uso de hibridização in situ de fluorescência (FISH) para monitorar o estado da coesão do braço em oócitos de Drosophila na prometáfase e na metáfase I

As tecnologias de edição de genes permitiram que os pesquisadores gerassem mutantes de zebrafish para investigar a função genética com relativa facilidade. Aqui, fornecemos um guia para realizar genotipagem e quantificação de embriões paralelos em sinais de hibridização in situ em zebrafish. Essa abordagem imparcial proporciona maior precisão em análises fenotípicas baseadas na hibridização do situ.

Genotipagem e Quantificação da Coloração de Hibridização in Situ em Zebrafish

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Óptico com resolução de microscopia fotoacústica (OR-PAM) é uma tecnologia emergente capaz de imagem absorção óptica...

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Aprenda a técnica OPTIR-FISH para identificar células individuais e analisar seu metabolismo em nível de célula única. Este método avançado combina imagem infravermelha fototérmica com hibridização in situ por fluorescência.

Hibridização In Situ de Fluorescência Infravermelha Óptica Fototérmica (OPTIR-FISH)

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