Name: Predição de Alvos de Proteínas e Validação de Compostos de Moléculas Pequenas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a prever e validar interações entre moléculas pequenas e alvos proteicos usando docking molecular e ensaio de deslocamento térmico celular. Este protocolo reduz custos e tempo experimental.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82004031) e pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2022NSFSC1303). Expressamos nossa grande gratidão a Jiayi Sun no Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Farmácia, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, pela assistência com western blot.

1. Baixando as estruturas de xanthatin e Keap1
<ol><li>Abra o banco de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), insira xanthatin (molécula pequena), pressione Pesquisar e clique em O primeiro resultado. Clique em Download e clique em Salvar em Estrutura 2D para salvar o composto no formato .sdf.</li>
	<li>Baixe a estrutura cristalina da proteína.<ol><li>Abra o banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org/), insira Keap1 e clique em Pesquisar. Clique em Humano em organismos populares na coluna da esquerda e, em seguida, clique em A primeira entrada chamada Q14145 na coluna da direita.</li>
		<li>Clique em Estrutura na função na coluna da esquerda, encontre a estrutura com o ID do PDB: 2FLU e clique em RCSB-PDB. Clique em Baixar arquivos e selecione Formato PDB para baixar a estrutura cristalina da proteína Keap1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Acoplamento molecular
<ol><li>Crie uma nova pasta chamada encaixe molecular na área de trabalho e salve as estruturas xanthatin (molécula pequena) e Keap1 (proteína) baixadas nesta pasta. NOTA: O nome e o caminho da pasta devem estar em inglês.</li>
	<li>Abra o software Maestro, clique em Arquivo, selecione Alterar diretório de trabalho, clique em Área de trabalho, clique duas vezes para selecionar a pasta de encaixe molecular recém-criada e clique em Escolher opções.</li>
	<li>Processamento de moléculas pequenas<ol><li>Clique nas opções Arquivo e importar estruturas, clique em Área de trabalho, clique duas vezes na pasta de encaixe molecular, clique em xanthatin Structure File e clique em Open para importar o arquivo de molécula pequena.</li>
		<li>Clique em Tarefas no canto superior direito do software e selecione a opção LigPrep . Use estruturas do espaço de trabalho; o restante dos parâmetros são os parâmetros padrão e clique em Executar para executar o processamento de moléculas pequenas.</li>
	</ol></li>
	<li>Processamento da estrutura da proteína<ol><li>Clique nas opções Arquivo e Importar estruturas , clique em Área de trabalho e clique duas vezes na pasta Encaixe molecular . Clique no arquivo Keap1 Protein Structure e, em seguida, clique em Open para importar o arquivo de estrutura da proteína.</li>
		<li>Clique em Tarefas no canto superior direito do software e selecione a opção Assistente de preparação de proteínas . Marque a caixa Antes de excluir águas além de 5 Å de grupos Het e insira um pH de 7,4+/- 0,0. Clique em Pré-processar, clique em Refinar e, em seguida, clique em Otimizar > Remover Águas > Minimizar.</li>
		<li>Clique na próxima tarefa quando a tarefa anterior for concluída. Clique em Tarefas e selecione a opção Mapa do site , use as configurações padrão para todos os parâmetros e clique em Executar.</li>
		<li>Clique nas opções Arquivo e Importar Estruturas , clique em Área de Trabalho, clique duas vezes na pasta de encaixe molecular e abra a pasta chamada sitemap_1. Clique no primeiro arquivo chamado Sitemap_1_out.maegz e, em seguida, clique em Abrir.</li>
		<li>Clique duas vezes no ponto para selecionar sitemap_1_protein na área de trabalho e, em seguida, clique em Sitemap_1_site_1 para selecioná-la . Clique em Tarefas e selecione a opção Geração de grade receptora . NOTA: Os locais de proteína previstos pelo mapa do site são classificados de acordo com a pontuação, com o local com maior pontuação em primeiro lugar.</li>
		<li>Selecione a opção Entrada em receptor, com os parâmetros restantes inalterados. Clique na Small White Ball na estrutura da proteína para gerar uma caixa de encaixe de tamanho padrão e altere o nome do trabalho para glide-grid_2FLU. Clique em Executar.</li>
	</ol></li>
	<li>Acoplamento molecular<ol><li>Clique em Tarefas e selecione a opção Encaixe de ligante . Selecione a grade do receptor como no arquivo e clique em Procurar. Clique em Área de trabalho, clique duas vezes na pasta de encaixe molecular, clique duas vezes no arquivo glide-grid_2FLU, clique em Glide-grid_2FLU.zip arquivo e clique em Abrir.</li>
		<li>Clique em Usar ligantes de arquivos > navegar > área de trabalho. Clique duas vezes na pasta de encaixe molecular, clique duas vezes no arquivo ligprep_1, clique em Ligprep_1-out.maegz file e clique em Abrir.</li>
		<li>Clique em Configurações e selecione a opção Precisão como XP (precisão extra), altere o nome do trabalho para glide-dock_XP_2FLU e clique em Executar.</li>
	</ol></li>
	<li>Exibir resultados do encaixe<ol><li>Clique nas opções Arquivo e Importar Estruturas , clique em Área de Trabalho e clique duas vezes na pasta Encaixe Molecular . Clique duas vezes no arquivo glide-dock_XP_2FLU , clique no arquivo glide-dock_XP_1_pv.maegz e clique em Abrir.</li>
		<li>Clique duas vezes no ponto para selecionar o ligante na área de trabalho e, em seguida, clique para selecionar sitemap_1_protein. Clique em Tabela, deslize para a extrema direita e exiba a pontuação em pontuação de encaixe.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualização de resultados 2D<ol><li>Clique duas vezes no ponto para selecionar o ligante na área de trabalho e, em seguida, clique para selecionar também sitemap_1_protein. Clique em Interação do ligante > Exibir e marque a caixa de legenda da LID .</li>
		<li>Clique em Arquivo, escolha Salvar captura de tela, insira 6000 na largura, desmarque a caixa de fundo transparente e clique em OK. Clique em Área de trabalho, nomeie o arquivo como 2D-xanthatin-2FLU e salve a imagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualização de resultados 3D<ol><li>Clique duas vezes no ponto para selecionar o ligante na área de trabalho e, em seguida, clique para selecionar também sitemap_1_protein.</li>
		<li>Clique em L na Seleção Rápida para selecionar moléculas pequenas e clique em Estilo. Clique na segunda linha no estilo para alterar o tamanho da ligação da molécula pequena e clique nos átomos de cor para alterar a cor da molécula pequena.</li>
		<li>Selecione a pequena molécula na figura, clique com o botão direito do mouse, selecione Expandir seleção e escolha 4 Å. Clique em Aplicar rótulos com estilo para exibir os rótulos.</li>
		<li>Clique na segunda linha do estilo para alterar o tamanho das ligações de aminoácidos e clique em Átomos de cor para alterar a cor dos aminoácidos.</li>
		<li>Clique em Avançar > Inverter, mantenha pressionada a tecla control e clique na posição do primeiro olho em estilo para mostrar apenas os aminoácidos com rótulos.</li>
		<li>Clique em Estilo > Fitas para mostrar a proteína como um estilo de fita e clique em Editar Fita em fitas para alterar a cor da fita.</li>
		<li>Clique em Alternar interações no canto inferior direito da tela, clique com o botão direito do mouse e desmarque contatos/conflitos.</li>
		<li>Pesquise por medida em tarefas, selecione Distância e clique nos dois átomos conectados pela linha pontilhada amarela (ligação de hidrogênio) na tela para medir os comprimentos das ligações de hidrogênio.</li>
		<li>Pressione e segure a roda do mouse para girar a proteína, ajuste a proteína para o centro da tela e certifique-se de que cada rótulo de aminoácido esteja visível.</li>
		<li>Clique em Área de trabalho > Salvar imagem como e clique na área de trabalho. Salve a imagem como 600dpi por padrão, nomeie o arquivo como 3D-xanthatin-2FLU, escolha o tipo de arquivo como formato tiff e salve a imagem.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cultura celular e preparação de amostras CETSA
<ol><li>Cultura de células<ol><li>Adicione 5 x 106 células RAW264.7 / mL em uma placa de cultura de 100 mm e incube com 6 mL de meio DMEM com 10% de FBS e 1% de solução antibiótica-antimicótica a 37 ° C, 95% de umidade e 5% de CO2. Prepare três pratos e faça o experimento quando as células atingirem 80% de confluência.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da amostra CETSA<ol><li>Aspire o meio antigo, adicione 2 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) aquecida à temperatura ambiente em cada prato e lave 2x.</li>
		<li>Adicione 2 mL de PBS a cada prato de células, misture as células e colete as células em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a 377 x g por 3 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com 2 mL de PBS contendo 1% de misturas de inibidores de protease de amplo espectro. Divida em tubos de microcentrífuga individuais com 1 mL de suspensão celular em cada um.</li>
		<li>Congele os tubos de microcentrífuga em nitrogênio líquido até que fiquem brancos sólidos, depois descongele imediatamente em banho-maria a 37 °C e repita 3x. Centrifugue a 12.000 x g a 4 °C por 10 min.</li>
		<li>Pegue dois tubos de microcentrífuga, um com 100 μM de xanthatin e outro com um volume igual de DMSO, e adicione 450 μL de sobrenadante centrifugado a cada tubo, incube a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Adicionar o sobrenadante dos dois tubos de microcentrífuga a 14 tubos de PCR a um volume de 60 μL/tubo e aquecer os tubos simultaneamente a diferentes temperaturas (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C e 63 °C) durante 3 min, com dois tubos de PCR a cada temperatura, para os grupos DMSO e xanthatin, respectivamente.</li>
		<li>Para o grupo não aquecido, retirar o sobrenadante de cada um dos dois tubos de microcentrífuga e adicionar 14 tubos de PCR, 7 para o grupo DMSO e 7 para o grupo xanthatína, num volume de 60 μL cada. Não aqueça as amostras aqui.</li>
		<li>Resfrie os tubos em temperatura ambiente para o grupo aquecido. Centrifugue todos os tubos (aquecidos e não aquecidos) a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e leve 48 μL de sobrenadante de cada tubo para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 12 μL de tampão de carga de proteína SDS-PAGE a cada tubo, vórtice para misturar bem e aqueça em banho-maria a 100 ° C por 5 min. NOTA: As amostras preparadas de CETSA devem ser armazenadas a -80 °C e testadas por western blot dentro de 1 semana.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Mancha ocidental
<ol><li>Preparação do gel SDS-PAGE<ol><li>Enxágue um prato de vidro longo e um curto com água ultrapura. Coloque as placas no clampslot e, em seguida, em uma placa transparente. Adicione água ultrapura e verifique o vazamento por 10 min.</li>
		<li>Adicione 8 mL de solução de gel inferior e 8 mL de tampão de gel inferior em um frasco cônico e misture agitando suavemente. Adicione 160 μL de promotor coagulante à solução de gel e misture bem. NOTA: O volume da camada inferior do adesivo não deve exceder a linha verde no clampranhura.</li>
		<li>Escorra a água ultrapura das placas e seque-as com papel de filtro. Adicione a solução de gel inferior preparada. Adicione 2 mL de álcool isopropílico e aguarde 20 min para solidificação.</li>
		<li>Pegue 2 mL de solução de gel superior e 2 mL de tampão de gel superior em um frasco cônico e misture agitando suavemente o frasco.</li>
		<li>Remova o álcool isopropílico da camada de gel e seque o excesso de álcool isopropílico com papel de filtro.</li>
		<li>Adicione 40 μL de promotor coagulante à solução de gel superior misturada, misture bem, adicione entre as placas de vidro longas e curtas e insira um pente de 1,5 mm com 15 orifícios, aguarde 20 min. NOTA: O pente deve ser inserido perpendicularmente à camada superior, sem bolhas de ar entre o pente e a solução.</li>
	</ol></li>
	<li>Eletroforese<ol><li>Adicione 1 L de água ultrapura a um copo, adicione um sachê de pó tampão de corrida SDS-PAGE, mexa bem com uma haste de vidro e adicione o gel preparado à unidade de eletroforese. Coloque a unidade na caixa e puxe o pente para fora.</li>
		<li>Descongele as amostras de marcador e CETSA à temperatura ambiente, vórtice e centrifugação. Adicionar 2,5 μL de marcador ao primeiro poço e 20 μL de amostras CETSA a cada um dos restantes poços de acordo com a sequência predeterminada. NOTA: As amostras CETSA foram adicionadas sucessivamente de acordo com o tratamento de temperatura descrito na etapa 3.2.6 de 45 °C a 63 °C; o grupo DMSO foi adicionado primeiro, depois o grupo xanthatina (Figura 1).</li>
		<li>Adicione a solução de eletroforese restante à unidade de eletroforese, feche a tampa e insira o eletrodo, pólo positivo com pólo positivo, pólo negativo com pólo negativo.</li>
		<li>Ligue o interruptor de alimentação e ajuste o voltage interruptor para 80 V para iniciar a eletroforese.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferir para a membrana<ol><li>Adicione 850 mL de água ultrapura, 100 mL de etanol anidro e 50 mL de tampão de transferência rápida a um béquer e mexa bem. Prepare placa de espuma, facas de plástico, pinças, bandejas e dispositivos de transferência de membrana.</li>
		<li>Corte a membrana de PVDF de acordo com o tamanho do gel, marque-a e mergulhe-a em metanol por 30 s para ativá-la.</li>
		<li>Despeje a solução de transferência na bandeja, coloque e abra os grampos de transferência e coloque uma esponja e três camadas de papel de filtro de transferência.</li>
		<li>Pare a eletroforese e abra a tampa da caixa de eletroforese. Pegue o dispositivo de eletroforese, despeje a solução de eletroforese e remova a placa. Coloque a placa na placa de espuma, retire-a suavemente com uma faca de plástico e corte o gel para visualizar claramente o marcador de proteína e as proteínas-alvo.</li>
		<li>Segure um lado do marcador com uma pinça, lave-o em uma bandeja contendo a solução transmembrana e coloque-o sobre papel de filtro. Mergulhe a membrana de PVDF ativada na solução de transferência, segure o lado rotulado com uma pinça e cubra o gel com a face voltada para baixo. NOTA: O lado marcado com membrana de PVDF é a parte frontal e preste atenção ao fato de que nenhuma bolha é gerada durante o processo de colocação.</li>
		<li>Coloque duas camadas de papel de filtro de transferência e uma camada de esponja na membrana de PVDF, cubra e prenda os clipes de transferência e coloque-os no tanque de transferência. NOTA: Cor preta do clipe de transferência para a cor preta do slot de transferência.</li>
		<li>Adicione a solução transmembrana restante ao transmembrana, cubra com a tampa, positivo para positivo, negativo para negativo.</li>
		<li>Ajuste a corrente para 400 mA, o tempo para 30 min e pressione Executar para iniciar a transferência da membrana à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueio<ol><li>Adicione 2 L de água ultrapura a um frasco de vidro, adicione um sachê de pó TBS e, em seguida, adicione 2 mL de Tween para fazer a solução TBST. Pese o pó de BSA para preparar uma solução de BSA a 5% com TBST e adicione 6 mL de solução de BSA à caixa de incubação.</li>
		<li>Pare a transferência da membrana e abra o clipe de transferência. Prenda o lado marcador da membrana de PVDF e coloque-o na caixa de incubação. Coloque a caixa de incubação em um agitador e bloqueie por 1.5 h em temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubação de anticorpo primário<ol><li>Prepare o anticorpo primário (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes) com solução de BSA a 5% a 1:1000, recicle a solução de BSA na caixa da incubadora e adicione 6 mL de anticorpo primário à caixa de incubação. Coloque a caixa de incubação em uma caixa de espuma com bolsas de gelo e mantenha-a em uma coqueteleira durante a noite.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubação de anticorpos secundários<ol><li>Colete o anticorpo primário na caixa de incubação no dia seguinte, adicione 6 mL de solução de TBST e coloque-o em um shaker para lavar por 5 min.</li>
		<li>Despeje a solução TBST lavada e adicione fresca para lavar; repita 5x e prepare o anticorpo secundário com solução de BSA a 5% a 1:5000.</li>
		<li>Despeje a solução de TBST e adicione 6 mL de anticorpo secundário à caixa de incubação. Coloque a caixa de incubação em um shaker e incube por 1.5 h em temperatura ambiente.</li>
		<li>Colete o anticorpo secundário (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes), adicione 6 mL de solução de TBST e coloque-o em um shaker para lavar por 5 min. Despeje a solução TBST lavada e adicione fresca para lavar; repita 5x.</li>
	</ol></li>
	<li>Expondo as tiras<ol><li>Guarde a solução TBST no final da última lavagem. Pegue volumes iguais de reagentes quimioluminescentes A e B, agite e misture bem. Proteja a solução da luz.</li>
		<li>Abra o sistema de imagem de gel, clique em Amostras, verifique a calibração, aguarde a conclusão da calibração e, em seguida, clique em Marcador, verifique a calibração.</li>
		<li>Pegue o lado marcador da tira com uma pinça e mergulhe totalmente na solução reagente quimioluminescente. Prenda um lado do marcador para colocar a tira voltada para baixo no gerador de imagens, feche a tampa do gerador de imagens, clique em Exposição e defina o tempo de exposição para 1 s. NOTA: O desenvolvedor deve cobrir completamente a faixa e o desenvolvimento deve estar em um ambiente escuro.</li>
		<li>Clique em Salvar, nomeie a imagem e salve-a como um arquivo .tif. Analise a densidade óptica do western blot. Os valores de cinza de cada temperatura no grupo DMSO foram comparados com os valores de cinza de 45 °C, e os valores de cinza de cada temperatura no grupo xanthatin foram comparados com os valores de cinza de xanthatin a 45 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

Validando a interação Xanthatin-Keap1 com o acoplamento e o CETSA

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A identificação de alvos de doenças e a descoberta e desenvolvimento de medicamentos estão intimamente interligadas27. Ao visar precisamente alvos específicos, os candidatos a medicamentos podem ser desenvolvidos para tratar doenças específicas de forma mais eficaz, minimizando simultaneamente os efeitos colaterais associados aos medicamentos28,29. Os alvos mais comumente usados são alvos de proteínas30. No entanto, a identificação de alvos proteicos especiais representa um imenso desafio devido à extensa diversidade de proteínas dentro das células30,31. Neste artigo, adotamos uma abordagem que combina docking molecular com CETSA para identificar e validar alvos proteicos. Os resultados revelaram uma interação direta entre a xanatina e a proteína Keap1. A integração de tecnologia computacional e experimentos biológicos também pode ser empregada na investigação de outros medicamentos e alvos proteicos para verificar a presença de uma interação direta entre o medicamento e o alvo. Essa abordagem, que combina previsão com verificação, reduz efetivamente o consumo de tempo e os custos econômicos. Além disso, os instrumentos e materiais experimentais são fáceis de obter e o processo de operação não é complicado. Finalmente, as amostras CETSA são fáceis de preparar e testar pelo método western blot, o que garante a reprodutibilidade das amostras.
Em nossa experiência, existem vários aspectos críticos que requerem atenção especial durante os procedimentos experimentais. Em primeiro lugar, é essencial selecionar a estrutura cristalina da proteína resolvida pela análise de raios-X ao escolher a estrutura da proteína antes do acoplamento molecular. Em segundo lugar, a densidade celular e o tempo de congelamento/descongelamento são fatores cruciais nos experimentos do CETSA. As células na fase de crescimento logarítmico devem ser selecionadas para experimentos CETSA, pois seu estado de crescimento é estável e tem impacto mínimo nos resultados experimentais. Durante o congelamento e descongelamento repetidos das células, o tempo deve ser bem controlado com nitrogênio líquido usado para congelamento até obter uma forma sólida branca, seguido de descongelamento imediato à temperatura ambiente antes dos ciclos de congelamento subsequentes. Por fim, os experimentos de western blot devem ser concluídos imediatamente após a preparação das amostras do CETSA para evitar a degradação da proteína.
O docking molecular e o CETSA são técnicas bem estabelecidas que desempenham um papel crucial no campo do desenvolvimento de medicamentos. O docking molecular é fundamental para prever interações em nível molecular entre compostos e seus alvos, oferecendo informações valiosas sobre possíveis modos de ligação10,11. O CETSA, por outro lado, concentra-se na avaliação do impacto dos medicamentos na estabilidade térmica das proteínas e serve como uma ferramenta para validar as interações medicamento-proteína17. Embora o CETSA seja um método relativamente simples de verificação, também é uma maneira de baixo rendimento usando western blot para o estudo do deslocamento térmico do complexo droga-proteína, e não deve ser a única técnica utilizada. Além disso, as etapas do CETSA são complicadas e qualquer erro de etapa durante a operação pode ter um grande impacto nos resultados. Além disso, o método CETSA não pode determinar o local de ligação específico e o modo de ligação do composto ao alvo da proteína e não pode indicar se a ligação é covalente ou não covalente 17,18,23. Além do ensaio de deslocamento térmico, outros tipos de ensaio energético, como a precipitação de proteínas dependente de pH (pHDPP), também podem ser usados para o estudo das interações ligante-proteína32. Além disso, o perfil de proteoma térmico é um método baseado em energia para revelar interações ligante-proteína, permitindo análise de alto rendimento e em larga escala das interações proteína-droga, combinando proteômica com CETSA33.
Além disso, a ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR) pode fornecer análises qualitativas e quantitativas adicionais34,35. Ele não apenas determina a existência de interações entre um medicamento e seu alvo, mas também mede os parâmetros de afinidade e os parâmetros cinéticos dessas interações intermoleculares, oferecendo uma compreensão mais abrangente.
Além do ensaio de deslocamento térmico, a precipitação de proteínas dependente de pH (pHDPP) também pode ser usada para o estudo das interações ligante-proteína32. O docking molecular é um método de simulação baseado em físico-mecânica para prever interações entre pequenas moléculas e biomoléculas. Este método visa obter a ligação otimizando a conformação e orientação de pequenas moléculas para produzir a melhor complementaridade entre elas e as biomoléculas. A previsão de alvos utiliza técnicas de inteligência artificial para prever os locais de ligação entre pequenas moléculas e biomoléculas. As duas abordagens têm diferenças importantes na aplicação do método e na precisão da previsão. Aplicação do método: o docking molecular é usado principalmente para design e otimização de medicamentos, fornecendo uma base teórica para a descoberta de novos medicamentos. A previsão de alvos, com a ajuda de inteligência artificial mais avançada, é mais frequentemente aplicada à triagem de alto rendimento e à descoberta rápida de compostos principais para melhorar a eficiência da descoberta de medicamentos. Precisão da previsão: Como o docking molecular é baseado em simulações físicas, sua precisão de previsão é maior, mas o custo computacional também é relativamente alto. Embora a previsão de alvos tenha um custo computacional menor, a precisão da previsão depende da abundância de dados de treinamento e seleção de modelos.

As proteínas são macromoléculas altamente importantes nos organismos vivos e possuem uma gama diversificada de funções únicas dentro das células, como composição da membrana, formação do citoesqueleto, atividade enzimática, transporte, sinalização celular e envolvimento em mecanismos intracelulares e extracelulares 1,2,3. As proteínas manifestam suas funções biológicas principalmente por meio de interações específicas com uma variedade de moléculas, incluindo outras proteínas, ácidos nucléicos, ligantes de moléculas pequenas e íons metálicos 1,4. Os ligantes são pequenos compostos moleculares que se ligam especificamente às proteínas de um organismo. A interação entre proteínas e ligantes ocorre em locais específicos da proteína, chamados de locais de ligação, também conhecidos como bolsas de ligação5. Na pesquisa em química medicinal, o foco está na identificação de proteínas-chave que estão claramente associadas a doenças, que servem como alvos para drogas6. Portanto, obter uma compreensão profunda dos locais de ligação entre proteínas e ligantes é de extrema importância na promoção da descoberta, design e pesquisa de medicamentos 7,8.
O docking molecular é uma ferramenta computacional amplamente utilizada para estudar a ligação proteína-ligante, que emprega as estruturas tridimensionais de proteínas e ligantes para explorar seus modos de ligação primários e afinidades ao formar complexos estáveis 9,10,11. A aplicação da tecnologia de docking molecular originou-se na década de 1970. Com base no princípio de emparelhamento de fechadura e chave e utilizando os algoritmos do software de acoplamento molecular, pode-se determinar a interação entre compostos e alvos moleculares analisando os resultados do encaixe. Essa abordagem permite a previsão de locais de ligação ativos para o composto e a molécula alvo. Consequentemente, facilita a identificação de uma conformação de ligação ideal (aqui chamada de modelo de ligação) para interações ligante-receptor, o que é crucial para a compreensão da mecânica desses engajamentos moleculares 12,13,14,15. Embora o docking molecular forneça previsões valiosas baseadas em computador das interações ligante-receptor, é importante observar que essas são descobertas preliminares. Consequentemente, uma verificação experimental adicional é essencial para confirmar essas interações.
O ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA), inicialmente proposto pela equipe de pesquisa de Pär Nordlund em 2013, serve como um método para validar as interações entre drogas e proteínas-alvo. Esta técnica testa especificamente a estabilidade térmica das proteínas-alvo induzidas pela ligação de drogas, fornecendo uma abordagem prática para confirmar interações moleculares 16,17,18. Essa abordagem é baseada no princípio fundamental de que a ligação ao ligante inicia uma mudança térmica dentro das proteínas-alvo e é aplicável a uma ampla gama de amostras biológicas, incluindo lisados celulares, células vivas intactas e tecidos19,20. O CETSA apóia o envolvimento direto do alvo de pequenas moléculas em células intactas, detectando a estabilização termodinâmica de proteínas devido à ligação do ligante e ligando a resposta fenotípica observada ao composto alvo21,22. Dentre as várias metodologias derivadas do CETSA, o Western Blot-CETSA (WB-CETSA) é considerado uma abordagem clássica. Após a preparação da amostra usando o método CETSA, a análise de western blot é utilizada para detectar alterações na estabilidade térmica da proteína alvo. Isso permite a determinação precisa das interações fármaco-proteína dentro dos sistemas celulares17,23.
A xanthatina é um composto bioativo isolado da planta Xanthium L. com propriedades como anti-inflamatória, que tem sido utilizada na medicina tradicional chinesa para tratar doenças como sinusite nasal e artrite24,25. A proteína 1 associada a ECH semelhante a kelch (Keap1) é um componente do complexo proteico de múltiplas subunidades Cullin-RING E3 ubiquitina ligase baseado em Cullin3 e um importante regulador da homeostase redox intracelular, que influencia a intensidade e a duração da resposta inflamatória modulando o estado redox intracelular26. Neste estudo, primeiro utilizamos o docking molecular para investigar a interação entre xanthatin (pequena molécula) e proteína Keap1, com o objetivo de prever seu modo de ligação. Posteriormente, empregamos o método CETSA para validar essa interação, avaliando o impacto da xanthatina na estabilidade térmica da proteína Keap1.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m Membrana de fluoreto de polivinilideno</td><td>Millipore</td><td>PR05509</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anidro</td><td>Produtos químicos Chron</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>BioFroxx</td><td>4240GR100</td><td></td></tr><tr><td>Misturas de inibidores de protease de amplo espectro</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1193</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de quimioluminescência aprimorado</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH anticorpo</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imaging Instrument</td><td>E-BLOT</td><td>Touch Imager Pro</td><td></td></tr><tr><td>Gradient PCR</td> instrument <td>Biometra TADVANCED</td><td>Biometra Tadvanced 96SG</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> <td>de congelamento de alta velocidadeBeckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase conjugada affiniPure anticorpo de cabra</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico&nbsp;</td>Zen BioScience Co. do anticorpo Keap1 dos <td>produtos químicos</td><td>67-63-0</td><td></td>de Chron</tr><tr><td></td><td>, Ltd</td><td>R26935</td><td></td></tr><tr><td>Banho do metal</td><td>Analytik Jena</td><td>TSC</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Chron dos produtos químicos</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Ncmblot tampão de transferência rápida (20&times;)</td><td>NCM Biotech Co., Ltd</td><td>WB4600</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Easy OneStep PAGE gel de preparação rápida kie</td><td>Epizyme Biotech Co., Ltd</td><td>PG212</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de proteína de cor prestained</td><td>Biosharp&nbsp;</td><td>BL741A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Eletroforese de Blotting de Proteínas</td><td>Bio-Rad</td><td>MiniPROTEAN&Ograve; Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 célula</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>C7505</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 meio específico da célula</td><td>Procell Life Science& Technology Co., Ltd</td><td>CM-0597</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de carregamento de proteína SDS-PAGE</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1112-10</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE pó de buffer de corrida</td><td>Servicebio</td><td>G2018</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponado pó salino</td><td>Servicebio</td><td>G0001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioFroxx</td><td>1247ML100</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Memmert</td><td>WNE10</td><td></td></tr><tr><td>Purificador de água</td><td>Millipore</td><td>Milli- IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>Xanthatin</td><td>ChemConst Biotechnology Co., Ltd</td><td>CONST210706</td><td></td></tr></tbody></table>

predição de alvos de proteínas e validação de compostos de moléculas pequenas

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound

As proteínas são fundamentais para a fisiologia humana, sendo seus alvos cruciais na pesquisa e no desenvolvimento de medicamentos. A identificação e validação de alvos proteicos cruciais tornaram-se parte integrante do desenvolvimento de medicamentos. O docking molecular é uma ferramenta computacional amplamente utilizada para investigar a ligação proteína-ligante, especialmente no contexto de interações entre drogas e proteínas-alvo. Para a verificação experimental da ligação e para acessar a ligação do medicamento e seu alvo diretamente, é utilizado o método de ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA). Este estudo teve como objetivo integrar o docking molecular com o CETSA para prever e validar interações entre drogas e alvos de proteínas vitais. Especificamente, previmos a interação entre xanthatina e a proteína Keap1, bem como seu modo de ligação por meio de análise de docking molecular, seguida de verificação da interação usando o ensaio CETSA. Nossos resultados demonstraram que a xanthatina pode estabelecer ligações de hidrogênio com resíduos de aminoácidos específicos da proteína Keap1 e reduzir a termoestabilidade da proteína Keap1, indicando que a xanthatina pode interagir diretamente com a proteína Keap1.

A análise de docking molecular previu a interação entre xanthatin e proteína Keap1. A Figura 2 demonstra a formação de ligações de hidrogênio entre a xanateína e os resíduos de aminoácidos Gly-367 e Val-606 da proteína Keap1, com um comprimento de ligação de hidrogênio de 2,17 Å para Gly-367 e 2,13 Å para Val-606. Além disso, a pontuação de encaixe calculada de -5,69 kcal / mol significa uma boa afinidade de ligação entre a xanthatina e a proteína Keap1.
O método CETSA mostrou que a ligação à xanthatina alterou a estabilidade térmica da proteína Keap1, confirmando a interação entre a xanthatina e a proteína Keap121. A Figura 3 indica que a xanthatina muda notavelmente a estabilidade térmica da proteína Keap1 dentro da faixa de temperatura de 48 ° C a 57 ° C, em comparação com o grupo DMSO. Para garantir uma carga igual da amostra, em primeiro lugar, a densidade de inoculação celular na qual realizamos os experimentos foi consistente; em segundo lugar, as amostras de células do grupo DMSO e do grupo xanthatin foram bem misturadas nas placas de cultura de células e, em seguida, foram igualmente distribuídas em dois tubos de microcentrífuga, o que garantiu a quantidade consistente de amostras de células, e, o volume de sobrenadante adicionado a cada tubo de PCR foi de 60 μL e, por último, o volume de cada amostra carregada no Western blot foi de 20 μL, o que garantiu uma carga igual para amostras aquecidas. A degradação de proteínas em amostras de cerca de 51 °C deve-se principalmente a mudanças na estrutura da proteína e reações químicas aceleradas causadas por altas temperaturas. Os resultados acima demonstram que a xanthatina pode se ligar diretamente à proteína Keap1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig01.jpg"> Figura 1: Ordem de carregamento do western blot. As temperaturas da esquerda para a direita foram 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C e 63 °C.  A primeira faixa foi adicionada com um marcador; duas pistas foram usadas para cada temperatura; a primeira pista foi o grupo DMSO e a segunda foi o grupo xanthatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig02.jpg"> Figura 2: Interação entre xanthatin e proteína Keap1 (PDB: 2FLU). (A) A representação 2D da xanthatin ligada a Keap1. (B) A visualização 3D da xanthatina e da proteína Keap1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig03.jpg"> Figura 3: Efeito da xanthatina na estabilidade térmica da proteína Keap1. A) Os efeitos da xanthatina na estabilidade térmica do Keap1 foram detectados pela CETSA. (B) As densidades ópticas de Keap1 foram normalizadas para aquelas obtidas a 45 ° C. Os dados são representados como média ± DP. A análise estatística foi realizada por análise de variância one-way (one-way ANOVA). n = 3. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, p &lt; 0,001, p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O experimento usado aqui mostra um método de docking molecular combinado com ensaio de deslocamento térmico celular para prever e validar a interação entre pequenas moléculas e alvos proteicos.

Predição de Alvos de Proteínas e Validação de Compostos de Moléculas Pequenas

Proteins are fundamental to human physiology, with their targets being crucial in research and drug development. The identification and validation of ...

Nossa pesquisa se concentra em alvos proteicos, previsão e validação de pequenos compostos moleculares. O experimento usado aqui mostra um método de docking molecular combinado com ensaio de deslocamento térmico semelhante para prever e validar a interação entre pequenas moléculas e alvos proteicos. Essas etapas do CETSA são complicadas e quaisquer erros de etapas durante a operação podem ter um grande impacto nos resultados.Nosso protocolo combina previsão com verificação, reduzindo efetivamente o consumo de tempo e os custos econômicos. Além disso, os instrumentos e materiais experimentais são fáceis de aceitar. Finalmente, as amostras CETSA são fáceis de preparar em teste, o que garante a produtibilidade das amostras.

protein-target-prediction-and-validation-of-small-molecule-compound

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Diretrizes para computador baseado caracterização estrutural e funcional da proteína usando o pipeline I-TASSER é descrito. A partir de seqüência de proteína de consulta, os modelos 3D são gerados usando vários alinhamentos threading e iterativo simulações de montagem estrutural. Inferências funcionais são posteriormente elaborado com base em correspondências às proteínas com estrutura conhecida e funções.

Um protocolo para Computer-Based Estrutura de Proteínas e de Previsão de Função

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Este estudo teve como objetivo apresentar uma estratégia para identificar interações medicamentosa-peptídeos. A estratégia envolve o biopanning de peptídeos curtos que reconhecem drogas com base em um biosensor de microequilísã de quartzo-cristal (QCM), seguido de análise bioinformática para avaliação quantitativa das informações obtidas para o reconhecimento de medicamentos e anotação dos locais de ligação medicamentosa em proteínas.

Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

O presente protocolo descreve uma estratégia integrada para explorar os principais alvos e mecanismos de Fructus Phyllanthi contra hiperlipidemia baseada na predição de farmacologia de rede e verificação metabolômica.

Predição de Farmacologia de Rede e Validação Metabolômica do Mecanismo de Fructus Phyllanthi contra Hiperlipidemia

Descrevemos uma metodologia baseada na diversificação de sequências para estimar as preferências de aminoácidos de sítios de ligação multiespecíficos em interações proteína-proteína (PPIs). Nessa estratégia, milhares de potenciais ligantes peptídicos são gerados e rastreados in silico, superando assim algumas limitações dos métodos experimentais disponíveis.

Predição computacional de preferências de aminoácidos de domínios de ligação peptídica potencialmente multiespecíficos envolvidos em interações proteína-proteína

Este protocolo bilíngue fornece um fluxo de trabalho computacional de descoberta de fármacos avaliando as interações proteína-ligando das Quinases Tipo Polo 1 a 3 (PLK1–3) e das propriedades de Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção, Toxicidade e Estabilidade (ADMET-S) de moléculas naturais provenientes de bancos de dados.

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Este artigo apresenta um protocolo para a construção de um modelo de farmacoforo de consenso integrando características moleculares de vários ligantes. Este método é aplicável aos esforços de descoberta de medicamentos direcionados a qualquer alvo biológico com conformações conhecidas de ligação ao ligante, permitindo a identificação dos principais recursos de interação para triagem virtual e design racional de medicamentos.

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Controle difuso nocivos inibitório, somação temporal e teste de hiperalgesia ferida são demonstradas na paciente obstétrica. Estes testes avaliam mecanismos inibitórios e excitatórios de processamento da dor e são aqui utilizados para avaliar a analgesia endógena em diferentes pontos temporais durante a gravidez eo período pós-parto para ajudar a revelar risco individual s para a dor persistente.

Um paradigma experimental para a Previsão da dor pós-operatória (PPOP)

Nós descrevemos um modelo de rato do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), que revela as alterações persistentes na função neuroendócrina eo atraso de longo prazo, resposta de medo exagerado, característico de pacientes com TEPT. O modelo animal e os métodos descritos aqui são úteis para correlacionar biomarcadores em núcleos do cérebro, que são mecanicista, mas não pode ser medido em pacientes com biomarcadores em células brancas do sangue periférico, os quais podem.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Aprenda a prever e validar interações entre moléculas pequenas e alvos proteicos usando docking molecular e ensaio de deslocamento térmico celular. Este protocolo reduz custos e tempo experimental.

Predição de Alvos de Proteínas e Validação de Compostos de Moléculas Pequenas

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