Name: Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 16 s
Description: Aprenda microscopia intravital de dois fótons em pulmão transplantado de camundongo para estudar mecanismos imunes em lesão de isquemia-reperfusão. Esta técnica revela interações celulares dinâmicas em tempo real.

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<meta charset="utf8"></head><body>Monitoramento em tempo real da dinâmica celular em transplante de pulmão de camundongo

<table><tbody><tr><td>0,75% de iodopovidona</td><td>Aplicare</td><td>NDC 52380-0126-2</td><td>Para desinfetante</td></tr><tr><td>cateter IV 20G</td><td>Terumo</td><td>SROX2025CA</td><td>Para tubo endotraqueal (ETT)</td></tr> <tr><td>Fita de seda de 1 polegada</td><td>Durapore</td><td>3M ID 7100057168</td><td>Para fixar o mouse na posição</td></tr><tr><td>Lente objetiva longa de imersão em água 20x</td><td>Cola</td><td></td> Olympus N20X-PFH <td></td></tr><tr><td>3M Vetbond</td><td>Medi-Vet.com</td><td>10872</td><td>Para colar lamínula no pulmão</td></tr><tr><td>655 nm pontos quânticos não direcionados</td><td>ThermoFisher</td><td>Q21021MP</td><td>Para rotulagem de vasos sanguíneos</td></tr><tr><td>etanol 70%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EX0281</td><td>Para desinfetante</td></tr><tr><td>Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen</td><td>McKesson</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Black O ring (2 cm)</td><td>Loja de ferragens</td><td>N/A</td><td>Para imagens personalizadas Parafuso da câmara</td></tr><tr><td>(2)</td><td>Loja de ferragens</td><td>N/A</td><td>Para câmara de imagem personalizada</td></tr><tr><td>Porca de aperto manual de latão (2)</td><td>Loja de ferragens</td><td>N/A</td><td>Para câmara de imagem personalizada</td></tr><tr><td>Buprenorfina 1,3 mg/mL</td><td>Fidelis Saúde Animal</td><td>NDC 86084-100-30</td><td>Para controle da dor</td></tr><tr><td>Camaleão titânio-safira laser pulsado de femtossegundo</td><td>Coerente</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura (24 mm x 50 mm)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1202F63</td><td>Para câmara de imagem personalizada</td></tr><tr><td>Grampo de mosquito curvo (1)</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de aquecedor de canal duplo</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina (1)</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>15040-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio vertical de estágio fixo</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Gaze (cortada em 1 cm x 3 cm)</td><td>McKesson</td><td>476709</td><td>Para colocar sob o pulmão esquerdo</td></tr><tr><td>Graxa de alto vácuo</td><td>Dow Corning</td><td>N/A</td><td>Para colar a lamínula na placa superior</td></tr><tr><td>Isoflurano 1%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina 100 mg/mL</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Chapa metálica (3 cm x 7 cm)</td><td>Loja de ferragens</td><td>N/A</td><td>Para câmara de imagem personalizada</td></tr><tr><td>Aplicadores pontiagudos com ponta de algodão</td><td>Solon</td><td>56225</td><td>Para manipular o pulmão e para dissecção sem corte</td></tr><tr><td>Tosquiadeira Power Pro Ultra</td><td>Oster</td><td>078400-020-001</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos Puralube Vet</td><td>Medi-Vet.com</td><td>11897</td><td>Para evitar a dessecação dos olhos</td></tr><tr><td>Ventilador para pequenos animais</td><td>Harvard Aparelho</td><td>55-0000</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps reto (1)</td> <td>Ferramentas de ciência fina</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Driver de obturador de três canais</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D3</td><td>Scanner ressonante</td></tr><tr><td>motor de passo óptico xyz</td><td>Prior Scientific</td><td>OptiScan II</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 20 mg / mL</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Para controle da dor</td></tr></tbody></table>

microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Após 1 h de armazenamento isquêmico frio a 4 °C, transplantamos ortotopicamente o pulmão esquerdo de um camundongo B6 para um B6. LysM-GFP camundongo4 e, em seguida, foi realizada imagem intravital de dois fótons, conforme descrito acima. Realizamos exames de imagem em dois momentos pós-transplante - 2 h (Figura 3A) e 24 h (Figura 3B). Os vasos sanguíneos são marcados em vermelho pelos pontos q injetados imediatamente antes da imagem. Além disso, podemos visualizar monócitos que ocuparam q-dots em 24 h4. Neutrófilos derivados do receptor marcados em verde podem ser vistos infiltrando-se no enxerto pulmonar no vídeo correspondente 24 h após o transplante (Vídeo Suplementar 1). Os alvéolos podem ser visualizados como crateras escuras devido ao SHG do colágeno (setas brancas na Figura 3). Observamos que 24 h pós-transplante, há mais neutrófilos no pulmão em comparação com 2 h pós-transplante (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig01.jpg"> Figura 1: Preparação do camundongo para imagens de dois fótons. (A) Pele reaberta sobre a toracotomia esquerda. (B) Excisão de pele e tecidos moles sobre o tórax esquerdo. (C, D) Costelas presas por 10 s antes de se dividir. (E) Costelas esquerdas da3ª à 5ª ressecadas para criar uma janela medindo ~ 0,8 cm craniocaudalmente x 1,0 cm ântero-posteriormente. (F) Pulmão esquerdo elevado para fora do tórax esquerdo e colocado em uma tira de gaze. (G) Uma câmara de imagem com uma janela de imagem sobrepõe-se ao pulmão esquerdo. (H) A câmara de imagem colocada na platina do microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig02.jpg"> Figura 2: Configuração da câmara de imagem. (A) A câmara de imagem colocada na platina do microscópio. (B) Vista ampliada do mecanismo do parafuso com mola para prender a placa superior sobre o pulmão esquerdo. (C) Frente e verso da placa superior com O-ring e lamínula aplicados. As linhas brancas representam a área onde a graxa a vácuo é aplicada para aderir a lamínula à placa superior. O círculo cinza representa um anel de cola para aplicar na lamínula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig03.jpg"> Figura 3: Imagem intravital de dois fótons de transplante de pulmão esquerdo de camundongo de B6 para B6. Camundongo LysM-GFP com armazenamento isquêmico a frio de 1 h. A imagem é realizada em (A) 2 h e (B) 24 h após o transplante. Vermelho representa pontos q. Verde representa neutrófilos de B6. Destinatário do LysM-GFP. O azul representa SHG de alvéolos ricos em colágeno. As setas brancas mostram os espaços aéreos alveolares. A barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Placa superior com dois resistentes conectados para fornecer aquecimento adicional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo Suplementar 1: Imagem de lapso de tempo de dois fótons do pulmão esquerdo de camundongo transplantado de B6 para B6. Camundongo LysM-GFP com 1 h de armazenamento isquêmico frio, realizado 24 h após o transplante. Vermelho representa pontos q. Verde representa neutrófilos do receptor LysM-GFP. O azul representa a segunda geração harmônica de alvéolos ricos em colágeno. A barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

intravital-two-photon-microscopy-of-the-transplanted-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de "nichos" dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Este protocolo descreve a intravital imagem de ratos transgênicos expressando marcadores fluorescentes específicos de célula. Intravital imagem fornece um método não-invasivo para observações de alta resolução em animais vivos usando windows implantáveis, através do qual a visualização microscópica de processos é possível. Este método é especialmente útil para estudar processos longitudinais.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

O protocolo introduzido aqui permite a caracterização da capacidade pulmonar localizador de linfócitos humanos primários sob condições inflamatórias em vivo. Infiltração pulmonar de enviaram transferidas células imunes humanas em um modelo do rato da inflamação alérgica pode ser fotografada e quantificada por microscopia de fluorescência de luz-folha de tecido pulmonar quimicamente limpo.

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação cirúrgica de uma janela óptica permanentemente habitante para o tórax murino, que permite imagens intravitais de alta resolução do pulmão. A permanência da janela torna-a adequada ao estudo de processos celulares dinâmicos no pulmão, especialmente aqueles que estão evoluindo lentamente, como a progressão metastática das células tumorais disseminadas.

Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão

Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.

Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro do camundongo

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

A terapia celular oferece uma intervenção promissora para a fibrose pulmonar usando células progenitoras para reparar tecidos danificados e melhorar a função pulmonar. Como a imagem desempenha um papel fundamental no rastreamento da integração celular, descrevemos o rastreamento in vivo guiado por imagens de partículas magnéticas da terapia celular para fibrose pulmonar em um modelo de camundongo.

Rastreamento in vivo guiado por imagem de células progenitoras epiteliais pulmonares distais transplantadas para fibrose pulmonar usando imagens de partículas magnéticas

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

Aprenda microscopia intravital de dois fótons em pulmão transplantado de camundongo para estudar mecanismos imunes em lesão de isquemia-reperfusão. Esta técnica revela interações celulares dinâmicas em tempo real.

Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

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