Name: Estratégias para melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas do trato gastrointestinal de frango (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Aprenda protocolos de isolamento de bactérias anaeróbicas do intestino de frangos para estudar interações microbianas e metabolismo de mio-inositol. Este método enriquece bancos de dados e avança a microbiologia avícola.

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<meta charset="utf8"></head><body>Estratégias de cultivo para diversidade microbiana não cultivada no trato gastrointestinal de galinhas

<ol><li>Wylensek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collection+of+bacterial+isolates+from+the+pig+intestine+reveals+functional+and+taxonomic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity.</a> Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).</li>
<li>Medvecky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+and+function+prediction+of+133+gut+anaerobes+isolated+from+chicken+caecum+in+pure+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Geno%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures.</a> BMC Geno. 19 (1), 561(2018).</li>
<li>Zenner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+immune+system+maturation+in+chickens+using+a+synthetic+community+of+cultured+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria.</a> mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).</li>
<li>Borda-Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+the+ileal+microbiota+of+phosphorus+and+calcium+utilization%2C+bird+performance%2C+and+gender+in+japanese+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail.</a> Animals. 10 (5), 885(2020).</li>
<li>Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+culture+through+selective+and+non-selective+conditions%3A+The+evolution+of+culture+media+in+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Micro+New+Infect%22%5BJournal%5D)">Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology.</a> New Micro New Infect. 34, 100622(2020).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hidden+pitfall+in+the+preparation+of+agar+media+undermines+microorganism+cultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).</li>
<li>Kawasaki, K., Kamagata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-catalyzed+hydrogen+peroxide+formation+from+agar%2C+gellan%2C+and+%CE%BA-carrageenan+and+recovery+of+microbial+cultivability+via+catalase+and+pyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate.</a> Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).</li>
<li>Kato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+previously+uncultured+slow-growing+bacteria+by+using+a+simple+modification+in+the+preparation+of+agar+media%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media.</a> Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).</li>
<li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).</li>
<li>Su, X. B., Ko, A. L. A., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulations+of+myo-inositol+homeostasis%3A+Mechanisms%2C+implications%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biol+Regul%22%5BJournal%5D)">Regulations of myo-inositol homeostasis: Mechanisms, implications, and perspectives.</a> Adv Biol Regul. 87, 2212-4926 (2023).</li>
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<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+origin+and+evolution+of+cellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms.</a> Prot Sci. 28 (11), 1947-1951 (2019).</li>
<li>Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+phytase+superdosing%2C+myo-inositol+and+available+phosphorus+concentrations+on+performance+and+bone+mineralisation+in+broilers%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Nutri%22%5BJournal%5D)">Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers.</a> Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).</li>
<li>Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+high+dose+of+microbial+phytase+and+myo-inositol+supplementation+on+growth+performance%2C+tibia+mineralization%2C+nutrient+digestibility%2C+litter+moisture+content%2C+and+foot+problems+in+broiler+chickens+fed+phosphorus-deficient+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets.</a> Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).</li>
<li>Weber, M., Fuchs, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+in+the+niche%3A+A+large-scale+genome-based+survey+reveals+inositol+utilization+to+be+widespread+among+soil%2C+commensal%2C+and+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbio+Spect%22%5BJournal%5D)">Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria.</a> Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).</li>
<li>Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+transcriptional+regulation+of+myo-inositol+operon+in+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens.</a> FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).</li>
<li>Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+binding+affinity+of+repressor+IolR+avoids+costs+of+untimely+induction+of+myo-inositol+utilization+by+Salmonella+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium.</a> Sci Rep. 7 (1), 44362(2017).</li>
<li>Yebra, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+gene+cluster+enabling+Lactobacillus+casei+BL23+to+utilize+myo-inositol%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).</li>
<li>Zhang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+iol+clusters+in+Lactobacillus+casei+strains%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains.</a> World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).</li>
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<li>Peterson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+media+on+transport+and+recovery+of+anaerobic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of media on transport and recovery of anaerobic bacteria.</a> Clin Infect Dis. 25, 134-136 (1997).</li>
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<li>Relman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+bacterial+16s+rRNA+amplification+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Diag+Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing.</a> Diag Mol Microbiol. , 489-495 (1993).</li>
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<li>Gilroy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+microbial+diversity+within+the+chicken+gut+microbiome+revealed+by+metagenomics+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture.</a> PeerJ. 9, e10941(2021).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+gut+metagenome+and+the+modulatory+effects+of+plant-derived+benzylisoquinoline+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids.</a> Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microbial+genomes+and+gene+catalog+of+the+chicken+gut+from+metagenomic+sequencing+of+high-fidelity+long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads.</a> GigaScience. 11, 116(2022).</li>
<li>Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-resolved+metagenomics+of+the+chicken+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome.</a> Front Microbiol. 12, 726923(2021).</li>
<li>Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+melanoidins+from+a+glucose-glycine+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Food+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system.</a> Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).</li>
<li>Ferrario, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+the+cecal+microbiota+of+feral+chickens+by+culturomic+and+metagenomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).</li>
<li>Crhanova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+culturomics+shows+that+half+of+chicken+caecal+microbiota+members+can+be+grown+in+vitro+except+for+two+lineages+of+clostridiales+and+a+single+lineage+of+bacteroidetes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes.</a> Microorganisms. 7 (11), 496(2019).</li>
<li>Rubio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacilli+counts+in+crop%2C+ileum+and+caecum+of+growing+broiler+chickens+fed+on+practical+diets+containing+whole+or+dehulled+sweet+lupin+%28lupinus+angustifolius%29+seed+meal%5BTitle%5D)+AND+%22British+Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal.</a> British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).</li>
<li>Bjerrum, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+composition+of+the+ileum+and+cecum+of+broiler+chickens+as+revealed+by+molecular+and+culture-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques.</a> Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>VWR</td><td>20104.334</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>VWR</td><td>97064-332</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Carl Roth</td><td>P726.1</td><td></td></tr><tr><td>Estação anaeróbica</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>A35 HEPA</td><td></td></tr><tr><td>Ácido butírico</td><td>Merck</td><td>8.0045.1000</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima de frango (Muramidase)</td><td>VWR</td><td>1.05281.0010</td><td></td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>VWR</td><td>97061-204</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>VWR</td><td>90000-908</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dipotássico</td><td>Carl Roth</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Legehennen/ Junghennenfutter</td><td>Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, D&uuml; sseldorf,</td> <td>Alemanha-MagAttract</td><td></td></tr> <tr><td>HMW DNA Kit</td><td>Qiagen</td><td>67563</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Gás misto (80% N2 (nível de qualidade 5.0), 15% CO2 (nível de qualidade 3.0) e 5% H2 (nível de qualidade 5.0))</td><td>Westfalen Gase GmbH,</td> <td>Alemanha-Mutanolisina</td><td></td></tr><tr><td>, recombinante (liofilizado)</td><td>A& A Biotecnologia</td><td>1017-10L</td><td></td></tr><tr><td>Mio-inositol</td><td>Carl Roth</td><td>4191.2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>ChemSolute</td><td>8418.01</td><td></td></tr><tr><td>Potássio dihidrogenofosfato</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiônico</td><td>Carl Roth</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2671</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A&nbsp;</td><td>Ribonuclease A (RNase A) QIAGEN&nbsp;</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>Resazurina de sódio</td><td>VWR</td><td>85019-296</td><td></td></tr><tr><td>Tioglicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102933</td><td></td></tr><tr><td>Peptona de soja, sem OGM, sem animais</td><td>VWR</td><td>97064-186</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Carl Roth</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Carl Roth</td><td>9139.2</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de vitaminas (suplemento)</td><td>VWR</td><td>968290NL</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Star Lab</td><td>07127/92930</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Carl Roth</td><td>9257.05</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-D-Frutose</td><td>VWR</td><td>53188-23-1</td><td></td></tr></tbody></table>

estratégias para melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas do trato gastrointestinal de frango

Strategies to Enhance Cultivation of Anaerobic Bacteria from Gastrointestinal Tract of Chicken

Monitoramento das condições anaeróbicas durante o transporte Devido à adição de resazurina sódica, a mudança na cor da solução de transporte para rosa antes da transferência da amostra para o tubo indica uma interrupção ou falha na manutenção das condições anaeróbicas. Assim, os tubos com mudança de cor foram impedidos de serem usados durante o transporte e apenas os tubos sem mudança de cor foram usados, como pode ser visto na Figura 2.
Análise dos resultados do sequenciamento A extração de DNA de isolados com dados de cromatograma com ruído de fundo excessivo ou interrupção na linha de base, pico com baixa intensidade de sinal, presença de picos múltiplos ou sobrepostos em uma única posição e alturas de pico inconsistentes foram repetidas usando cultura fresca e pura, pois indicam contaminação da amostra, amplificação desigual ou problema durante o processo de sequenciamento. Ao realizar a pesquisa BLAST no NCBI, a cepa que mostrou maior porcentagem de identidade e alta cobertura de consulta foi a cepa relacionada ao nosso isolado, levando à identificação do isolado.
Cultivo de um amplo espectro de bactérias anaeróbias O isolamento de bactérias anaeróbias resultou em mais de 600 isolados obtidos em cinco meios diferentes preparados e esterilizados em frascos separados. A identificação usando o gene 16S rRNA resultou em 15 gêneros diferentes de bactérias (Figura 4). Dentre o número total de isolados, mais da metade representa bactérias anaeróbias estritas e o restante são anaeróbios facultativos.
A diversidade de isolados inclui oito cepas, demonstrando novas espécies taxonômicas relacionadas a membros das famílias Clostridiaceae, Lactobacillaceae e Oscillospiraceae (Tabela 5)25. Esses resultados destacam a importância da adesão às boas práticas na preparação de meios de cultura e no uso de diversos meios para o sucesso dos estudos de cultivo.
Isolamento direcionado A observação de colônias em meio de ágar mínimo sugere a presença potencial de bactérias anaeróbias capazes de utilizar o IM como fonte de carbono (Figura 5). Para confirmar conclusivamente essas descobertas em nível genético, uma análise abrangente por meio do sequenciamento do genoma completo pode ser realizada. Essa abordagem de sequenciamento permite a identificação de genes específicos associados ou que contribuem para o metabolismo do IM, incluindo iolA, iolB, iolC, iolD, iolE, iolF, iolG, iolH, iolI, iolJ, iolT e iolW.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig01.jpg"> Figura 1: Processo de amostragem e transporte de seções GIT para cultivo de bactérias anaeróbias. 1) As seções são fechadas antes do corte. As linhas pontilhadas indicam a posição de corte recomendada. 2) Transferência da seção amostrada para um tubo Hungate preenchido com solução de transporte. 3) Substituição da atmosfera de ar por injeção de solução de transporte para manter as condições anaeróbicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig02.jpg"> Figura 2: Ilustração de tubos de Hungate contendo amostras obtidas da seção de íleo de frango. A imagem demonstra o enchimento adequado dos tubos de Hungate com solução de transporte, garantindo a ausência de espaço aéreo e manutenção de cores consistentes em comparação com o controle sem amostra. A turbidez perceptível nos tubos de amostra é atribuída à dissolução da digesta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig03.jpg"> Figura 3: Etapas sequenciais na preservação de bactérias anaeróbias. 1) Colheita de biomassa de 24 h a 48 h de cultura axênica em solução isotônica. 2) Lavagem de células bacterianas pelo processo de centrifugação e remoção do sobrenadante para se livrar dos meios restantes. 3) Repetição do processo de lavagem. 4) Dissolução de pellets em meio de cultura e solução de glicerol a 50% seguida de armazenamento a -80 °C em criogeniais estéreis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig04.jpg"> Figura 4: Distribuição taxonômica de bactérias isoladas em nível de gênero. O gráfico de barras empilhadas mostra a diversidade de bactérias isoladas de cinco formulações de meios distintas, enfatizando o impacto benéfico do uso de diversas formulações de meios neste estudo. A formulação do meio está listada na Tabela 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig05.jpg"> Figura 5: Colônias bacterianas anaeróbicas em meio de ágar mínimo. Colônias bacterianas anaeróbias prosperando em meio de ágar mínimo após 24 h de incubação a 39 °C. O desenvolvimento de colônias sugere a potencial assimilação do mio-inositol como fonte primária de carbono, entre outras fontes de carbono. Duas diluições são apresentadas, (A) 10-1, revelando uma contagem de colônias que supera uma enumeração prática devido à sua abundância; e (B) 10-2, exibindo colônias contáveis e distinguíveis, facilitando a análise seletiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Mídia</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Peptonas de mídia</td>
			<td>Meios de polissacarídeos</td>
			<td>Meios curtos de ácidos graxos</td>
			<td>Meios de carboidratos</td>
			<td>Meio de bactérias sulfatoredutoras (SRB)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Fonte de C</td>
			<td>Dextrose 0,2%</td>
			<td rowspan="2">Ração para aves (2%)</td>
			<td rowspan="2">Ácido acético 0,17%, ácido isovalérico 0,01%, ácido propiônico 0,2%, ácido butírico 0,2%</td>
			<td rowspan="2">Dextrose 5%</td>
			<td rowspan="2">Na-DL-lactato, ácido ascórbico</td>
		</tr><tr><td>Amido 0,05%</td>
		</tr><tr><td>Fonte de N</td>
			<td>Aminoácidos de soja (1%)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aminoácidos de triptona e extrato de carne (0,1%)</td>
			<td>Aminoácidos de peptonas de soja (0,1%), (NH4)3 citrato (0,1%)</td>
			<td>NH4Cl (0,1%)</td>
		</tr><tr><td>Fonte de minerais</td>
			<td>K2HPO4 (0,05%)</td>
			<td>-</td>
			<td>K2HPO4 (0,05%)</td>
			<td>K2HPO4 (0,05%)</td>
			<td>K2HPO4 (0,05%)</td>
		</tr><tr><td>Ágar</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
		</tr><tr><td>Cofator (adicionado após a esterilização)</td>
			<td>Extrato de levedura (0,1%)</td>
			<td>-</td>
			<td>Mistura de vitaminas (0,01%)</td>
			<td>Mistura de vitaminas (0,01%)</td>
			<td>Extrato de levedura (0,01%)</td>
		</tr><tr><td>Inibidores</td>
			<td>nenhum</td>
			<td>nenhum</td>
			<td>Pré-adolescentes 80 (1%)</td>
			<td>Menadiona (0,05%)</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Composição dos meios de cultura para ampla gama de isolamento bacteriano. Composição de cinco meios de ágar, cada um formulado exclusivamente com base nas variações na fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fonte de mineral e incorporação de cofatores e inibidores.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composição</td>
			<td>Quantidade (g/L)</td>
		</tr><tr><td>Peptona de caseína</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>Peptona de soja</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>Cloreto de sódio</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Hidrogenofosfato dipotássico</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>Mio-inositol</td>
			<td>2.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Composição do meio de enriquecimento. Formulação de meio projetada com uma mistura de ingredientes complexos para apoiar o crescimento de um amplo espectro de bactérias. A quantidade de cada ingrediente é especificada em g/L.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composição</td>
			<td>Meio de ágar mínimo (g / mL) / L</td>
			<td>Meio de caldo mínimo (g/mL)/ L</td>
		</tr><tr><td>L-cistina</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>Cloreto de sódio</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr><tr><td>Tioglicolato de sódio</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>Hidrogenofosfato de sódio di-hidratado</td>
			<td>0.53</td>
			<td>0.53</td>
		</tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td>
			<td>0.41</td>
			<td>0.41</td>
		</tr><tr><td>Cloreto de amônio</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td>
			<td>0.11</td>
			<td>0.11</td>
		</tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>Triptona</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>EDTA</td>
			<td>0.00773</td>
			<td>0.00773</td>
		</tr><tr><td>Solução de oligoelementos SL7</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Mistura de vitaminas</td>
			<td>0.2</td>
			<td>0.2</td>
		</tr><tr><td>Mio-inositol (20 mM)</td>
			<td>3.6</td>
			<td>3.6</td>
		</tr><tr><td>Ágar</td>
			<td>15</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>pH (usando 1 mM de HCl)</td>
			<td>6 ± 0,2</td>
			<td>6 ± 0,2</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Composição mínima do meio. O meio é formulado com mio-inositol como fonte primária de carbono.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Desnaturação Inicial</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>4 minutos</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td>Desnaturação</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Recozimento</td>
			<td>52 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30x</td>
		</tr><tr><td>Extensão</td>
			<td>68 °C</td>
			<td>Anos 90</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Extensão final</td>
			<td>68 °C</td>
			<td>10 minutos</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabela 4: Condições ideais para amplificação do gene 16S rRNA. Os parâmetros ideais de temperatura, duração e ciclagem a serem empregados no termociclador para amplificação eficiente do gene alvo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nova atribuição de taxonomia</td>
			<td>Tamanho do genoma</td>
			<td>Conteúdo do GC</td>
			<td>Região intestinal</td>
			<td>Adesão 16S </td>
		</tr><tr><td>Limosilactobacillus galli</td>
			<td>1861581</td>
			<td>50.43</td>
			<td>colheita</td>
			<td>OM760982</td>
		</tr><tr><td>Limosilactobacillus avium</td>
			<td>2158112</td>
			<td>48.49</td>
			<td>íleo</td>
			<td>OM760983</td>
		</tr><tr><td>Limosilactobacillus pulli</td>
			<td>1924125</td>
			<td>45.87</td>
			<td>íleo</td>
			<td>OQ831033</td>
		</tr><tr><td>Clostridium butanoliproducens</td>
			<td>3507657</td>
			<td>28.34</td>
			<td>colheita</td>
			<td>OQ831034</td>
		</tr><tr><td>Faecalispora anaeroviscerum</td>
			<td>2921858</td>
			<td>50.36</td>
			<td>íleo</td>
			<td>OM760984</td>
		</tr><tr><td>Limosilactobacillus viscerum</td>
			<td>1993658</td>
			<td>44.9</td>
			<td>íleo</td>
			<td>OM760986</td>
		</tr><tr><td>Ligilactobacillus hohenheimensis</td>
			<td>1381484</td>
			<td>50.47</td>
			<td>jejuno</td>
			<td>OM760988</td>
		</tr><tr><td>Limosilactobacillus difficilis</td>
			<td>1998683</td>
			<td>47.38</td>
			<td>íleo</td>
			<td>OQ832131</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 5. Identificação taxonômica de novas espécies bacterianas. As novas espécies bacterianas isoladas e identificadas do trato gastrointestinal de galinhas neste estudo são detalhadas juntamente com o tamanho do genoma, conteúdo de GC, seção e acesso ao gene 16S rRNA. Esta tabela foi modificada de25.

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