Name: Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a montar nucleossomos in situ para microscopia de força e fluorescência correlativa de molécula única. Este protocolo reduz o uso de reagentes e o tempo de preparação em DNA nativo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Reconstituição de nucleossomos in situ para estudos de molécula única

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+A+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+dynamics+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and dynamics are coming of age.</a> Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nucleosome+recognition+by+chromatin+factors+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes.</a> Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).</li>
<li>Fierz, B., Poirier, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biophysics of chromatin dynamics.</a> Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-molecule+techniques%3A+A+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: A laboratory manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Chua, G. N. L., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+force+met+fluorescence%3A+Single-molecule+manipulation+and+visualization+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions.</a> Annu Rev Biophys. , (2024).</li>
<li>Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+biological+single-molecule+applications+of+optical+tweezers+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy.</a> Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Opt Lett. 11, 288(1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+nucleosome+assembly+onto+oligomers+of+the+sea+urchin+5+S+DNA+positioning+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence.</a> J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).</li>
<li>Salt Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gradient+dialysis+reconstitution+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">gradient dialysis reconstitution of nucleosomes.</a> CSH Protoc. 2008, 5113(2008).</li>
<li>Leicher, R., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+interaction+between+chromatin+and+chromatin-associated+complexes+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers.</a> Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442, 772-778 (2006).</li>
<li>Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+positions+predicted+through+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleosome positions predicted through comparative genomics.</a> Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).</li>
<li>Chipev, C. C., Wolffe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+organization+of+Xenopus+laevis+oocyte+and+somatic+5S+rRNA+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo.</a> Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181, 1380-1394 (2020).</li>
<li>Vlijm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+assembly+and+handedness+dynamics+of+%28H3.3-H4%292+tetrasomes+to+canonical+tetrasomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes.</a> PLoS One. 10, e0141267(2015).</li>
<li>Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+nucleosome+assembly+by+histone+chaperone+NAP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1.</a> J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).</li>
<li>Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+chromatin+assembly+on+supercoiled+plasmid+DNA+by+nucleosome+assembly+protein-1+and+ATP-utilizing+chromatin+assembly+and+remodeling+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor.</a> J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).</li>
<li>Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+chaperone+Nap1+promotes+nucleosome+assembly+by+eliminating+nonnucleosomal+histone+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions.</a> Mol Cell. 37, 834-842 (2010).</li>
<li>Wu, R., Taylor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+analysis+of+DNA.+II.+Complete+nucleotide+sequence+of+the+cohesive+ends+of+bacteriophage+lambda+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA.</a> J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).</li>
<li>King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+structural+plasticity+of+stretched+DNA+under+torsional+constraint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint.</a> Nat Commun. 7, 11810(2016).</li>
<li>Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsionally+constrained+DNA+for+single-molecule+assays%3A+An+efficient%2C+ligation-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method.</a> Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).</li>
<li>Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+in+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers in single-molecule biophysics.</a> Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).</li>
<li>Diaz-Celis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+structural+transitions+during+mechanical+unwrapping+of+nucleosomes+and+their+disassembly+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+in+silico+dissection+of+the+interaction+between+Polycomb+repressive+complex+2+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).</li>
<li>Chua, G. N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+specify+MeCP2+function+at+methylated+DNA+and+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Brower-Toland, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+disruption+of+individual+nucleosomes+reveals+a+reversible+multistage+release+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).</li>
<li>McCauley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+FACT+subunits+coordinate+to+catalyze+both+disassembly+and+reassembly+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes.</a> Cell Rep. 41, 111858(2022).</li>
<li>Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+force+on+mononucleosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Effect of force on mononucleosomal dynamics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-directed+replication+origin+licensing+independent+of+a+consensus+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence.</a> Nat Commun. 13, 4947(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+recognition+complex+harbors+an+intrinsic+nucleosome+remodeling+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).</li>
<li>Harada, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+nucleosome+translocation+by+RSC+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes.</a> Elife. 5, e10051(2016).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).</li>
<li>Rogge, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nucleosomal+arrays+from+recombinant+core+histones+and+nucleosome+positioning+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA.</a> J Vis Exp. (79), e50354(2013).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+nucleic+acid+binding+and+coacervation+by+linker+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1.</a> Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x tampão HR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>30 mM&nbsp; tris&nbsp; acetato pH 7,5, acetato de magnésio 20 mM, cloreto de potássio 50 mM, BSA 0,1 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>1x PBS (solução salina tamponada com fosfato)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>137 mM cloreto de sódio, 2,7 mM cloreto de potássio, 10 mM fosfato de sódio dibásico, 1,8 mM de fosfato de potássio monobásico&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0074-6</td><td>Uso para fazer acetato de tris</td></tr><tr><td>Biotina-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-BIOX-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-dATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-835-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-dCTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-956-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino Albumina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Dissolver em H2O e passar por um filtro de 0,22 um</td></tr><tr><td>Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye</td><td>Cytiva</td><td>PA23031</td><td>Maleimide funcionalizado Cy3 fluorophore</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-414-051</td><td>Centrífuga de bancada com</td></tr><tr><td>resfriamento Álcool etílico, Pure</td><td>Millipore Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9884</td><td>Dissolver em H2O a 0,5 M</td></tr><tr><td>Octâmero histona humana (H4, L50C; H2A, K119C)&nbsp;</td><td>N / A</td><td>N / A</td> As <td>proteínas histonas recombinantes e aquelas que abrigam mutações de marcação foram purificadas internamente conforme descrito anteriormente (ver refs. 33, 34, 35, 36). Resumidamente, histonas recombinantes foram expressas em células BL21 (De3) pLySS (Promega). Os corpos de inclusão foram isolados após sonicação e as histonas foram extraídas em condições de desnaturação. As histonas foram dialisadas em tampão A (ureia 7 M, cloridrato de tris 10 mM pH 8,0, cloreto de sódio 100 mM, EDTA 1 mM e 2-mercaptoetanol 5 mM), e a solução foi adicionada a uma coluna de gravidade carregada com Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). O fluxo foi então adicionado a uma coluna de gravidade carregada SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), e as histonas foram eluídas da coluna adicionando tampão A suplementado com cloreto de sódio 600 mM. Histonas que abrigam mutações de marcação (H4, L50C; H2A, K119C) foram purificados e depois conjugados ao fluoróforo desejado por meio de corantes funcionalizados com maleimida (Cytiva, Lumidyne) usando uma proporção molar de corante para proteína de 20:1 (ver refs. 33, 34). Os octâmeros de histona foram montados adicionando uma proporção molar igual de cada histona marcada com fluoróforo ou tipo selvagem sob condições de desnaturação, dialisados em um tampão com alto teor de sal contendo cloreto de sódio 2 M e, em seguida, purificados por cromatografia de exclusão de tamanho conforme descrito anteriormente (ver refs. 36, 37). Alternativamente, proteínas histonas individuais e octâmeros de histonas prontos podem ser comprados comercialmente (por exemplo, Epicypher).</td></tr><tr><td>Tampão de imagem</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>20 mM cloridrato de tris pH 8.0, 100 mM cloreto de sódio</td></tr><tr><td>Fragmento de Klenow (3' a 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>DNA Lambda (dam-, dcm-)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SD0021</td><td>Livre de metilação &lambda; DNA</td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne Technologies</td><td>9</td><td>Fluoróforo LD655 funcionalizado Maleimide</td></tr><tr><td>Histona ligante H1.4 (A4C)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Proteína recombinante purificada fabricada internamente (ver ref. 38)</td></tr><tr><td>LUMICKS C-Trap Dymo</td><td>LUMICKS</td><td>N/A</td><td>Configuração de armadilha dupla; materiais padrão para o instrumento fornecido pelo fabricante</td></tr><tr><td>Solução de acetato de magnésio</td><td>Millipore Sigma</td><td>63052-100ML</td><td>Use para fazer tampão HR</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Incluído com kit de fragmentos Klenow</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Dissolva em H2O e passe por um filtro de 0,22 um Cloreto</td></tr> de <tr><td>potássio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>Use para fazer tampão PBS e HR</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0662</td><td>Use para fazer PBS</td></tr><tr><td>S. cerevisiae Nap1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Nap1 foi purificado internamente conforme descrito anteriormente (ver refs. 33, 34). Alternativamente, o Nap1 pode ser comprado comercialmente (por exemplo, Active Motif).</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>241245</td><td>Dissolver em H2O a 3 M</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>Use para fazer PBS e tampão de imagem</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9763</td><td>Use para fazer</td></tr><tr><td>PBS SPHERO Partículas revestidas com biotina (3.0-3.4 &micro; m)</td> <td>Spherotech</td><td>TP-30-5</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop 2000 / 2000c Espectrofotômetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>NanoDrop</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Dissolva em H2O e ajuste para pH apropriado; use para fazer tampão de imagem e acetato de tris</td></tr></tbody></table>

montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Usando a configuração descrita na etapa 3 (Figura 1A), a formação de nucleossomos ao longo da corda de DNA foi visualizada como o aparecimento de focos fluorescentes vermelhos em uma varredura 2D (Figuras 1B, à esquerda) ou trajetórias ao longo do tempo em um quimógrafo (Figura 1B, à direita). Os nucleossomos devidamente embrulhados produziram trajetórias de fluorescência que permaneceram estacionárias ao longo do tempo dentro do limite de difração da detecção confocal (~ 300 nm). Notavelmente, vários nucleossomos formados próximos uns dos outros sob o limite de difração não podem ser resolvidos espacialmente e aparecem como focos ou trajetórias mais brilhantes. No entanto, as etapas de fotobranqueamento de trajetórias nucleossômicas individuais foram analisadas e frequentemente mostraram eventos de fotobranqueamento de 1 etapa (Figura 1C) ou 2 etapas (Figura 1D), o que indica que os focos continham principalmente mononucleossomos, dada a taxa de marcação de aproximadamente 70% da proteína H4 nesta amostra. Além disso, com base na contagem média de fótons para um único fluoróforo LD655 nesta condição experimental, o número de cópias H4 marcadas em cada trajetória do nucleossomo foi estimado e mostrou que os loci do nucleossomo predominantemente (&gt;75%) continham 1 ou 2 cópias H2A marcadas (Figura 1E), novamente consistente com a noção de que eles foram carregados principalmente como mononucleossomos espacialmente separados. Os outros focos mais brilhantes continham mais de 3 cópias de H4 marcado, provavelmente representando vários nucleossomos dentro do limite de difração.
A formação de nucleossomos também foi monitorada por um aumento na tensão ao longo da corda quando as posições dos OTs permaneceram constantes à medida que mais DNA foi enrolado em octâmeros de histonas (Figura 1B, abaixo). Na ausência de Nap1, os octâmeros de histonas ainda podem se ligar ao DNA, mas permanecem principalmente desembrulhados, pois a tensão associada quando as posições OT foram mantidas permaneceu constante (Figura 1F). É possível que a ligação não específica de octâmeros de histonas ao DNA ocorra mesmo na presença de Nap1. Em outro experimento, foi realizado o mesmo protocolo para formar nucleossomos contendo H2A marcado com Cy3, que produziu resultados semelhantes aos realizados com H4 marcado com LD655 (Figura 1G), indicando a montagem de octâmeros intactos em nucleossomos.
Usando a configuração descrita na etapa 4 (Figura 2A), o desembrulhamento do nucleossomo foi visualizado ao longo do tempo em um quimógrafo à medida que a distância da corda aumentava (Figura 2B). Foi relatado anteriormente que os octâmeros de histonas geralmente permanecem ligados ao DNA após serem desembrulhados30,31 e, portanto, as trajetórias fluorescentes geralmente persistem mesmo em altas tensões. O desempacotamento do nucleossomo também foi monitorado na curva FD associada (Figura 2C). As características quantificáveis da curva FD incluem a força na qual o(s) nucleossomo(s) se desenrolam (ver "Transição F" na inserção da Figura 2C), bem como o comprimento do DNA que foi liberado do octâmero da histona (ver "ΔL" na inserção da Figura 2C), que existe em múltiplos de ~ 24 nm, consistente com o desembrulhamento independente das voltas internas do DNA de nucleossomos individuais27, 30. Esses parâmetros podem ser usados para estimar o número de nucleossomos formados em cada corda ou para análise adicional a jusante da mecânica dos nucleossomos. Como tal, o número de rupturas de giro interno obtidas de experimentos de tração mecânica foi comparado com o número estimado de cópias H4 marcadas em cada trajetória do nucleossomo com base na intensidade do monômero, o que mostrou que os números são amplamente consistentes (exemplos mostrados nas Figuras 2D-G). No entanto, observou-se que eles não combinam perfeitamente devido à eficiência marcada de ~ 70% da proteína H4 na amostra e qualquer ligação residual de histona independente de Nap1 ao DNA, conforme mostrado na Figura 1F. Finalmente, como esperado, esticar as amarras de DNA nuas ligadas ao Nap1 (sem histonas) não gera transições induzidas por força (Figura 2H), indicando que o Nap1 sozinho não distorce significativamente o DNA.
Empregando a configuração descrita na etapa 5 (Figura 3A), a ligação da histona ligante H1 à cromatina foi visualizada como o aparecimento de focos fluorescentes verdes ao longo da corda da cromatina (Figura 3B). Notavelmente, os nucleossomos ligados a H1 geraram trajetórias de duas cores (veja as setas brancas na Figura 3B) que pareciam estacionárias ao longo do tempo. Além disso, foram observadas trajetórias de difusão de H1 através de regiões de DNA livre de nucleossomos (ver estrelas verdes na Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig01.jpg"> Figura 1: Formação de nucleossomos in situ mediada por Nap1. (A) Esquema da configuração experimental descrita no protocolo de formação de nucleossomos in situ mediado por Nap1 (etapa 3). Um par de contas foi opticamente preso no cap. 1, e uma única molécula de DNA λ foi amarrada entre as contas por meio da ligação biotina-estreptavidina no cap. 2. A corda foi então movida para o cap. 4, contendo octâmeros de histonas marcados com LD655 (vermelho) e Nap1 para formação em tempo real de nucleossomos em todo o DNA. (B) Varredura 2D representativa (esquerda) e quimógrafo (direita) de uma corda de DNA contendo nucleossomo marcada com LD655-H4. A leitura de força associada (inferior) mostra um aumento na força imediatamente à medida que a corda é movida para o cap. 4 quando as posições OT são mantidas constantes, indicando o envolvimento do nucleossomo. Trajetórias mais brilhantes significam vários nucleossomos adjacentes localizados dentro do limite de difração de ~ 300 nm. (C) Exemplo de quimógrafo mostrando um evento de fotobranqueamento de 1 etapa (seta branca) de um nucleossomo contendo LD655-H4. (D) Exemplo de quimógrafo mostrando um evento de fotobranqueamento de 2 etapas (setas brancas) de um nucleossomo contendo LD655-H4. (E) Frequência relativa do número de H4 marcados com LD655 por trajetória estimada a partir de sua intensidade de fluorescência. (F) Quimógrafo representativo de uma corda ligada a octâmeros de histonas na ausência de Nap1. A leitura de força associada (inferior) permanece inalterada, mesmo quando os octâmeros de histonas se ligam ao DNA. (G) Quimógrafo representativo de uma corda de DNA contendo nucleossomo marcada com Cy3-H2A. A leitura da força associada (inferior) mostra um aumento na força imediatamente à medida que a corda é movida para o cap. 4 (contendo octâmeros e Nap1), pois os nucleossomos são formados quando as posições OT são mantidas constantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig02.jpg"> Figura 2: Ensaio de desempacotamento de nucleossomos. (A) Esquema da configuração experimental descrita no protocolo de desempacotamento de nucleossomos (etapa 4). A corda de DNA contendo nucleossomos foi movida para o cap. 3 contendo um tampão de imagem livre de proteínas, onde a distância entre os esferões foi aumentada e os nucleossomos foram desembrulhados. (B) Quimógrafo representativo de uma corda de DNA contendo nucleossomos puxada para altas forças, aumentando gradualmente a distância entre as contas. A diminuição na intensidade da fluorescência em direção ao cordão inferior foi provavelmente devido ao DNA se inclinar ligeiramente fora do foco de varredura da linha. (C) A curva FD associada mostrando transições induzidas por força de desembrulhamento de giro interno ocorrendo entre 8-37 pN. A inserção mostra uma visão ampliada de um exemplo de transição para a qual a distância desembrulhada (ΔL = ~ 24 nm para o giro interno do DNA de nucleossomos individuais) e a força de transição (Transição F) podem ser registradas e analisadas posteriormente. Para esta corda, 26 nucleossomos foram desembrulhados e a corda se rompeu a ~ 65 pN, conforme indicado pela linha pontilhada branca no quimógrafo. (D, E) Exemplo LD655-H4 corda contendo nucleossomo puxada para altas forças onde o número de H4 por trajetória é estimado por meio da intensidade de fluorescência (indicada no quimógrafo, D) e o número de nucleossomos envoltos é estimado por meio do tamanho da mudança de distância induzida pela força (indicado na curva força-distância associada, E). (F, G) Outro exemplo como em (D,E). (H) Amarras de DNA (n = 5) puxadas para altas forças após serem incubadas em um canal contendo apenas Nap1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig03.jpg"> Figura 3: Visualizando a interação proteína-cromatina. (A) Esquema da configuração experimental descrita no protocolo de visualização da ligação da proteína à cromatina (etapa 5). A corda de DNA contendo nucleossomos foi movida para o cap. 5, contendo 10 nM de histona de ligação marcada com Cy3 H1 (verde). (B) Quimógrafo representativo de duas cores de ligação de H1 a uma corda de DNA contendo nucleossomo. Os eventos de colocalização do nucleossomo H1 são indicados com setas brancas. A trajetória do nucleossomo não ligado é denotada com a seta magenta. As moléculas H1 que se difundem no DNA nu são denotadas com estrelas verdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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