Name: Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Aprenda a purificar vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano usando ultracentrifugação. Este protocolo padronizado melhora a eficiência da purificação para aplicações terapêuticas em entrega de genes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82202473).

A visão geral das etapas do protocolo é mostrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de mídia
<ol><li>Prepare um meio de cultura para ADSC sem exossomos usando 450 mL de meio de cultura basal, 50 mL de soro fetal bovino sem exossomos e 5 mL de antibióticos triplos.</li>
</ol>2. Ressuscitação e cultura de ADSCs
NOTA: Ressuscite ADSCs.
<ol><li>Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.</li>
	<li>Pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C previamente.</li>
	<li>Recupere 2 tubos de ADSCs congelados (P3) do nitrogênio líquido e agite-os em banho-maria a 37 °C com temperatura constante até que estejam totalmente descongelados. NOTA: A abertura do tubo do freezer não deve estar em contato com a água para evitar contaminação.</li>
	<li>Desinfete o tubo de criopreservação com álcool 75% e depois mova-o para a mesa ultralimpa. Aspirar a suspensão celular com uma pipeta e colocá-la num tubo de centrifugação de 15 ml.</li>
	<li>Coloque o tubo de centrífuga em uma centrífuga de baixa velocidade e centrifugue a 250 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Prepare quatro placas de cultura de 10 cm e coloque 9 mL de meio em cada prato. Marque o nome, o tipo de célula, a geração e a data experimental e, em seguida, pré-aqueça-os em uma incubadora termostática de células a 37 °C.</li>
	<li>Desinfete o tubo da centrífuga e mova-o para a mesa ultralimpa. Remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Adicione 4 mL de meio e agite suavemente a solução (1 x 105 células / mL) até que esteja uniformemente dispersa. NOTA: Tome cuidado para não eliminar o pellet celular ao extrair o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 1 mL de suspensão celular a cada placa. Agite a louça com um método cruzado. NOTA: Posicione a placa em uma superfície nivelada e agite-a em um padrão cruzado (movendo-a para cima, para baixo, para a esquerda e para a direita) por 5-6 repetições. Evite movimentos circulares, pois eles podem causar acúmulo de células no centro.</li>
	<li>Observe as células com ampliação de 40x com o microscópio óptico e, em seguida, coloque os pratos na incubadora. NOTA: O objetivo principal da observação das células é determinar se elas estão distribuídas uniformemente, pois a distribuição desigual afetará o crescimento subsequente.</li>
	<li>Prepare o meio de troca para as células.<ol><li>Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.</li>
		<li>Pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C previamente.</li>
		<li>Observe o estado da célula sob o microscópio óptico com ampliação de 40x. O nível de confluência é de aproximadamente 50%. NOTA: O nível de confluência é calculado como a razão entre a área ocupada pelas células e a área da superfície da placa de Petri depois que as células aderem à parede e se esticam totalmente.</li>
		<li>Transfira a placa de cultura para a mesa ultralimpa (nível de biossegurança 2) após a desinfecção e remova o meio.</li>
		<li>Enxágue cada placa de cultura duas vezes com 2 mL de solução de PBS suavemente.</li>
		<li>Adicione 10 mL de meio a cada prato. Transfira os pratos para a incubadora.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Coletando o sobrenadante ADSCs e extraindo os EVs
<ol><li>Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.</li>
	<li>Observe o estado da célula ao microscópio. O nível de confluência é de aproximadamente 80%.</li>
	<li>Transfira o prato para a mesa ultralimpa após a desinfecção. Recolha cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e coloque-o num tubo de centrifugação de 50 ml. NOTA: As células podem ser congeladas ou descartadas. Se a esterilidade não for necessária, as etapas a seguir podem ser executadas na mesa de operação. Neste ponto, o experimento pode ser pausado e reiniciado mais tarde. Se a experiência for interrompida, conservar o sobrenadante num frigorífico a 4 °C durante uma semana não superior a uma semana. O armazenamento de longo prazo não é recomendado, pois pode afetar a atividade dos VEs. A abordagem ideal é extrair EVs imediatamente.</li>
	<li>Centrifugue (300 x g, 10 min, à temperatura ambiente) para remover as células em suspensão. Recolher o sobrenadante com uma pipeta. NOTA: Não despeje. Deixe um pouco de sobrenadante para evitar que o pellet seja sugado.</li>
	<li>Centrifugar para remover os detritos celulares (2000 x g, 10 min, 4 °C) e, em seguida, continuar a recolher o sobrenadante com uma pipeta. NOTA: Os pontos-chave são os mesmos da etapa 3.4.</li>
	<li>Filtre o sobrenadante com uma membrana de 0,22 um para remover partículas grandes e detritos celulares. NOTA: Filtre o sobrenadante com 2 mL de PBS estéril para umedecer a membrana do filtro antes da filtração.</li>
	<li>Centrifugue na máquina de ultracentrífuga (10.000 x g, 30 min, 4 °C).</li>
	<li>Em seguida, centrifugue a 1,00,000 x g durante 70 min a 4 °C para remover o pellet e recolher o sobrenadante. NOTA: Os EVs obtidos foram purificados por centrifugação várias vezes para aumentar sua pureza. O pellet pode não ser visível a olho nu. Portanto, é crucial operar a pipeta suavemente e deixar um pouco de sobrenadante no fundo para evitar a coleta de pellets.</li>
	<li>Remova o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspender o pellet com PBS e centrifugar (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C). NOTA: O pellet pode não ser visível a olho nu. Portanto, ao aspirar o sobrenadante com uma pipeta, é fundamental removê-lo de forma suave e completa para maximizar a pureza dos EVs.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e obtenha o pellet EVs. Ressuspenda-o com 1 mL de PBS, transfira-o para um tubo de centrífuga de 1 mL e guarde-o em um refrigerador a 4 ° C para detecção subsequente. NOTA: O pellet pode não ser visível a olho nu. Consequentemente, ao aspirar o sobrenadante com uma pipeta, é crucial remover suave e completamente o sobrenadante para maximizar a pureza dos EVs. Se as amostras não forem necessárias por um longo período, armazene-as em uma geladeira a -80 °C.</li>
</ol>

Isolamento baseado em ultracentrífuga de vesículas extracelulares de ADSCs humanas

<ol><li>Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+Looking+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).</li>
<li>Xin, H., Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2FmiRNAs+as+mediating+cell-based+therapy+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke.</a> Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tissue+origin+effect+of+extracellular+vesicles+on+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration.</a> Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).</li>
<li>Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+adipose+tissue-a+potential+role+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+biological+effects+of+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+were+markedly+increased+by+low-intensity+ultrasound+stimulation+for+promoting+diabetic+wound+healing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing).</a> Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).</li>
<li>Mou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+human+adipose-derived+stem+cells+for+the+improvement+of+angiogenesis+and+fat-grafting+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application.</a> Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+bone+immobilized+with+human+adipose+stem+cells-derived+exosomes+promotes+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).</li>
<li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+inhibit+the+fibrosis+of+fibrotic+buccal+mucosal+fibroblasts+via+the+microRNA-375%2Ffoxf1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis.</a> Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).</li>
<li>Brezgin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+aspects+of+manufacturing+and+analytical+control+of+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles.</a> Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Character+comparison+of+abdomen-derived+and+eyelid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells.</a> Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).</li>
<li>Gan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+improve+liver+fibrosis+by+regulating+the+miR-20a-5p%2FTGFBR2+axis+to+affect+the+p38+MAPK%2FNF-%CE%BAB+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway.</a> Cytokine. 172, 156386(2023).</li>
<li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+and+imaging+of+exosomes+by+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (131), e56482(2018).</li>
<li>Han, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+exosomes+derived+from+hypoxia-preconditioned+adipose+mesenchymal+stem+cells+promotes+neovascularization+and+graft+survival+in+fat+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).</li>
<li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+from+blood+plasma%3A+Qualitative+and+quantitative+comparison+of+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+extracellular+vesicles+by+three-dimensional+dynamic+culture+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).</li>
<li>Eguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+with+cancer+stem+cell-like+properties+secrete+exosomes+and+HSP90+in+a+3D+nanoenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment.</a> PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm interesse financeiro a declarar.

Durante o processo experimental formal, vários pontos são cruciais para alcançar os melhores resultados experimentais. Com base em nossa experiência anterior, recomenda-se optar pela passagem 3-6 ADSCs, pois garantem o melhor estado celular possível. Antes do P3, os glóbulos vermelhos, as células endoteliais e outras células diversas podem não ter sido excluídos. Após P6, as células podem envelhecer gradualmente, o que pode afetar o estado dos EVs secretados. Em segundo lugar, o sobrenadante deve ser coletado quando o grau de confluência celular estiver entre 80% e 90% para garantir secreção suficiente do maior número possível de EVs. Para manter a pureza máxima dos EVs, os pesquisadores devem ser cautelosos durante as três primeiras centrifugações e garantir que nenhum resíduo líquido seja deixado para evitar a aspiração de impurezas e pellets. Durante as duas últimas centrifugações, certifique-se de que o sobrenadante seja completamente removido enquanto protege o pellet.
A ultracentrifugação é econômica e não requer tratamento adicional. Essa técnica tem sido amplamente utilizada em estudos de EV e tem demonstrado eficiência satisfatória na obtenção de EVs, conforme confirmado por experimentos de caracterização. No entanto, existem algumas desvantagens inevitáveis. Primeiro, a taxa de recuperação de EVs é baixa. Em segundo lugar, os EVs tendem a se agregar às vezes. Além disso, componentes não celulares podem ser isolados e algumas EVs podem se romper durante o processo, levando ao acúmulo de detritos 14,15,16. Para resolver esses defeitos, a maioria das pesquisas se concentra na purificação de EVs12,13. No entanto, este protocolo abrange todo o processo, desde a cultura de células até a purificação do exossomo, porque acreditamos que todo o processo afeta o status e a pureza dos EVs extraídos finais. É crucial seguir as diretrizes acima mencionadas durante a operação. Além disso, coletar mais sobrenadante e implementar cultura de células 3D pode ser benéfico, pois vários estudos demonstraram que a cultura 3D é mais eficaz em estimular a secreção de EVs em comparação com a cultura 2D17,18.
Este protocolo descreve o processo de extração de EVs de ADSCs usando ultracentrifugação. Ele fornece orientação prática e permite que os experimentadores evitem detalhes durante a operação, tanto quanto possível. Em resumo, o protocolo auxilia os experimentadores a melhorar a qualidade das amostras e serve como um lembrete de que não devemos nos concentrar apenas nos detalhes de cada etapa, mas também considerar o experimento como um todo.

A maioria das ADSCs é derivada do tecido adiposo e demonstrou promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos, incluindo miocárdio, osso e pele1. Pesquisas recentes sugerem que a função regenerativa das ADSCs pode ser devida ao contato intercelular e aos efeitos parácrinos das células2. O efeito parácrino é um meio importante para as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, e essa função é alcançada por meio de vesículas extracelulares (EVs).
Os EVs são estruturas de membrana de camada dupla produzidas pelas células, com um diâmetro variando de 40 nm a 160 nm (com uma média de cerca de 100 nm). Eles afetam diferentes funções celulares, como produção de citocinas, proliferação celular, apoptose e metabolismo 3,4. Numerosos estudos foram realizados sobre as funções dos ADSC EVs, incluindo a promoção da regeneração óssea, regeneração do tecido da mucosa oral, sobrevivência do tecido adiposo após o transplante de tecido e reparo de feridas cutâneas 5,6,7,8. O enorme potencial dos ADSC EVs na medicina regenerativa é evidente. Existem vários métodos para extrair e separar EVs do sobrenadante, como técnicas baseadas em centrifugação, precipitação, tamanho molecular, afinidade e microfluídica. O método de ultracentrifugação é amplamente considerado o padrão-ouro para isolar EVs9. O princípio fundamental da ultracentrifugação para separação de EV baseia-se no fato de que as partículas na amostra têm coeficientes de sedimentação variados, resultando em sua sedimentação e agregação em camadas de separação distintas. No entanto, um protocolo detalhado enfatizando as precauções durante a ultracentrifugação ainda não foi estabelecido.
Portanto, este estudo descreve objetivamente a cultura ADSC, a coleta de sobrenadantes e os procedimentos de ultracentrifugação de EVs e pontos-chave com um fluxo lógico de informações e linguagem clara e formal. Isso fornece uma referência valiosa para experimentos futuros.

<table><tbody><tr><td>Filtro de Agulha Acrodisc de Supor Membrane</td><td>Acros Organics</td><td>4652</td><td>0.22 &mu; m</td></tr><tr><td>Meio Basal Para Cultura de Células</td><td>OriCell</td><td>BHDM-03011</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal Sem EXO + Suplemento de Cultura (Para Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano)</td><td>OriCell</td><td>HUXMD-05002</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>OLYMPUS</td><td>Lx70-S8F2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de Baixa Velocidade</td><td>Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.</td><td>SC-3612</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP Ultracentrífuga de mesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td> Solução de <td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina-gentamicina (100x)</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação e caracterização de vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) podem promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos. Pesquisas recentes sugerem que sua função regenerativa pode ser atribuída ao contato célula-célula e aos efeitos parácrinos celulares. O efeito parácrino é uma forma importante de as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, nas quais as vesículas extracelulares (EVs) desempenham um papel funcional como transportadoras. Existe um potencial significativo para ADSC EVs em medicina regenerativa. Vários estudos relataram a eficácia desses métodos. Vários métodos para extrair e isolar EVs são atualmente descritos com base em princípios como centrifugação, precipitação, tamanho molecular, afinidade e microfluídica. A ultracentrifugação é considerada o padrão-ouro para isolar EVs. No entanto, ainda não existe um protocolo meticuloso para destacar as precauções durante a ultracentrifugação. Este estudo apresenta a metodologia e as etapas cruciais envolvidas na cultura de ADSC, coleta de sobrenadante e ultracentrifugação EV. No entanto, embora a ultracentrifugação seja econômica e não exija tratamento adicional, ainda existem algumas desvantagens inevitáveis, como baixa taxa de recuperação e agregação de EV.

Primeiramente, as ADSCs foram caracterizadas e identificadas, incluindo sua morfologia10 e anticorpos de superfície. Com base na Figura 2A, é evidente que as ADSCs estão dispostas em forma de fuso e formam um vórtice após um crescimento denso. As células cultivadas foram diferenciadas em células adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas e coradas com Oil Red O, Alizarin Red e AlcianBlue 11. O experimento de diferenciação induzida e a citometria de fluxo validaram que eles são de fato ADSCs com potencial para diferenciação multidirecional. No entanto, 22% das células são CD45 positivas nos resultados, o que não afetará a conclusão, pois anticorpos positivos e negativos suficientes o suportam (Figura 2A, B).
Em seguida, a identificação dos EVs extraídos é essencial. Inclui principalmente três aspectos: morfologia, tamanho de partícula e proteínas marcadoras. Os resultados do MET revelam claramente a estrutura EV em forma de copo com uma membrana de bicamada12 (Figura 3A). NTA indica que os EVs têm uma distribuição de tamanho de partícula de cerca de 50-150 nm, com uma concentração de aproximadamente 1,6 x 1010 partículas/mL (Figura 3B). A análise de Western Blot também mostra que as proteínas marcadoras de EVs, incluindo CD9, CD63 e TSG10113, são expressas suavemente ( Figura 3C ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig01v2.jpg"> Figura 1: Visão geral das etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig02.jpg"> Figura 2: Caracterização das ADSCs. (A) A morfologia das ADSCs é fusiforme. As ADSCs foram cultivadas no meio para diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica, respectivamente. A diferenciação adipogênica foi identificada pela coloração Oil Red O. A diferenciação osteogênica e condrogênica foi confirmada pela coloração com Vermelho de Alizarina e Azul de Alcian, respectivamente. Barra de escala: 100 μm. (B) Análise de citometria de fluxo de ADSCs para marcadores de superfície MSC (CD90, CD105, CD29 e CD73) e marcadores específicos de células hematopoiéticas (CD31, CD34, CD45 e HLA-DR). A estratégia de gating: circule o grupo em branco primeiro. Com base nisso, circule CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 e HLA-DR sucessivamente de acordo com os anticorpos marcados de cada grupo. Essa figura é adaptada de Han, Y. D. et al.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig03.jpg"> Figura 3: Caracterização de EVs. (A) Os resultados do MET revelam claramente a estrutura EV em forma de copo da membrana de bicamada. Barra de escala: 200 nm. (B) NTA indica que os EVs têm uma distribuição de tamanho de partícula de cerca de 50-150 nm, com uma concentração de aproximadamente 1,6 x 1010 partículas/mL. (C) Detecção de expressões de TSG101, CD9 e CD63 em exossomos por Western blot. Essa figura é adaptada de Han, Y. D. et al.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve todos os procedimentos, desde a cultura de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) e coleta de sobrenadante até a extração de vesículas extracelulares (EVs) usando ultracentrifugação.

Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...

Nossa pesquisa se concentra na preparação e purificação de vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano. O problema que queremos resolver é como padronizar esse processo e melhorar a eficiência da purificação. Atualmente, existem muitas tecnologias usadas para extrair vesículas extracelulares, como ultracentrifugação, ultrafiltração, cromatografia de exclusão de volume, precipitação de polímeros, captura de imunoafinidade, tecnologia microfluídica e assim por diante.No entanto, a ultracentrifugação é reconhecida como um padrão-ouro, reconhecidamente. No futuro, vamos nos concentrar na aplicação de vesículas extracelulares como vetores, incluindo o transporte de MRNA, plasmídeos e outras pequenas moléculas e a transfecção em células.

purification-characterization-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este protocolo fornece um método livre de enzimas para isolar as células-tronco mesenquímicas de abdominoplastia e amostras lipoaspirate usando um método explant. A ausência de enzimas duras ou etapas de centrífuga fornece células-tronco clinicamente relevantes que podem ser usadas para estudos in vitro ou transferidas de volta para a clínica.

Um método sem enzimas para isolamento e expansão de células-tronco mesenchymal derivadas do adiposo humano

Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.

Um Método Simples de Filtração de Bancada para Isolar Pequenas Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Humanas

O presente protocolo descreve a centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos (exossomos e microvesículas) de CTMs humanas cultivadas. Outras aplicações desses EVs também são explicadas neste artigo.

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da classificação de vesículas extracelulares (EVs) liberadas por células estromais mesenquimais. Em particular, ele se concentra na configuração do instrumento e na otimização das condições de classificação. O objetivo é classificar as vesículas extracelulares, preservando suas características.

Configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares

O protocolo utiliza uma linha de camundongos repórter CD63-GFP específica para adipócitos para visualizar e quantificar a secreção de vesículas extracelulares derivadas de adipócitos (EVs) e demonstrar sua absorção por células progenitoras, revelando uma via paracrina no tecido adiposo.

Caracterização da secreção de vesículas extracelulares derivadas de adipócitos usando um modelo de camundongo repórter CD63-GFP In Vivo e In Vitro

Aqui, apresentamos um método padrão para isolar eficientemente células-tronco e adipócitos derivados do adiposo, caracterizado por redução de &gt;90% no tempo de processamento, alta viabilidade celular e ampla compatibilidade.

Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Este protocolo descreve o isolamento de derivadas de tecido adiposo a partir de células do estroma lipoaspirado e a criação de um defeito de 4 milímetros de tamanho crítico calvária em avaliar a regeneração óssea.

Reparação de um modelo de defeito crítico porte calvária Usando derivadas de tecido adiposo células do estroma colhidas lipoaspirado

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Aprenda a purificar vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano usando ultracentrifugação. Este protocolo padronizado melhora a eficiência da purificação para aplicações terapêuticas em entrega de genes.

Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano

Explorar mais vídeos