Name: Modelo Alveolus-on-Chip Imunocompetente para Estudo das Respostas Imunes da Mucosa Alveolar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a desenvolver modelos alvéolo-on-chip imunocompetentes usando tecnologia de organ-on-a-chip com interface ar-líquido e perfusão endotelial. Este método avançado permite estudar respostas imunes da mucosa alveolar em infecções respiratórias com relevância fisiológica superior às culturas 2D tradicionais.

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H.K. e A.S.M. reconhecem o financiamento do Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, financiado pela linha de financiamento Strategic Networking da Leibniz Association. A M.A. e a A.S.M. foram apoiadas pelo projeto IGF IMPROVE financiado pelo Ministério Federal de Assuntos Econômicos e Energia com base em uma resolução do Bundestag alemão. A A.S.M reconhece ainda o apoio financeiro do Cluster of Excellence Balance of the Microverse sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.

As células HUVEC são isoladas dos cordões umbilicais e usadas até a passagem 4. Os monócitos primários são isolados de doadores saudáveis de sangue total. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário de Jena, Jena, Alemanha (3939-12/13). De acordo com a Declaração de Helsinque, todos os indivíduos que doaram células para o estudo deram seu consentimento informado.
1. Dia 1: Preparação do biochip
<ol><li>Os biochips estão disponíveis em diferentes tamanhos e modelos. Para experimentos aqui, use o modelo BC002. Coloque o biochip em uma placa de Petri de vidro, encha a placa e lave todas as cavidades com etanol estéril a 70% (EthOH). Incubar durante 45 min à temperatura ambiente. Em seguida, lave as cavidades 2x com ddH2O. Remova o ddH2O.</li>
	<li>Cubra a membrana do biochip de ambas as cavidades com solução estéril de colágeno IV (0,5 mg / mL em ácido acético 0,5 mM; use a concentração de 1:100 na solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco contendo magnésio e cálcio PBS (+/+)) lavando suavemente a solução de colágeno IV através de ambas as cavidades usando uma pipeta de 1.000 μL com pontas azuis. Incubar durante 15 min a 37 °C e 5% de CO2. NOTA: Recomenda-se o uso de uma pipeta de 1.000 μL com pontas de filtro azul (P1000) em todo o protocolo. O diâmetro da abertura da ponta do filtro cobre completamente a abertura das portas que conectam os canais, o que evita a inserção de bolhas de ar no chip.</li>
	<li>Após 30 min de incubação, lave as câmaras inferior e superior 2x com PBS estéril (+/+) para eliminar o colágeno e o ácido acético restantes.</li>
	<li>Prepare o meio EC adicionando 1:100 (v / v) Penicilina / Estreptomicina (10.000 U / mL). Encha a câmara superior de cada cavidade com 250 μL de meio EC e a câmara inferior com 150 μL de meio EC.</li>
	<li>Colha HUVEC de um frasco T25 confluente: Lave com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem PBS de magnésio e cálcio (-/-), adicione 1 mL de tripsina a 0,25% + 1 mM de EDTA em PBS (-/-) e incube por 3 min a 37 ° C. Interrompa a atividade da tripsina adicionando 5 mL de PBS (+/+) + 5% FCS e centrifugue a 350 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT) em um tubo cônico de 50 mL. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio EC.</li>
	<li>Use uma diluição serial de 1:10 ao realizar a contagem de células. Adicione 10 μL do pellet celular ressuspenso a 90 μL de meio celular. Combine as amostras com cuidado. Use um tubo de microcentrífuga com 10 μL de corante azul de tripano. Diluir a solução celular com azul de tripano (1:1) utilizando lâminas de câmara de contagem de células. Conte as células manualmente com uma Câmara de Neubauer ou com um contador de células automatizado. Determine a contagem de células e ajuste a concentração para 0,4 x 106 células por 200 μL.</li>
	<li>Substituir o meio de células endoteliais na câmara superior do biochip por 200 μL de meio EC contendo HUVECs suspensos. Pipete suavemente para evitar a formação de bolhas de ar nos canais ou câmaras. Coloque a placa de Petri de vidro com os biochips a 37 °C e 5% de CO2.</li>
</ol>2. Dia 2: Verificação da camada celular
<ol><li>No dia 2, verifique visualmente a confluência da camada de células HUVEC na câmara superior. Realizar a troca do meio na câmara superior com 300 μL de meio EC. Pipete suavemente para evitar o descolamento das células da membrana. Realizar troca de mídia diariamente após 24h. Coloque a placa de Petri de vidro com os biochips de volta a 37 °C e 5% de CO2.</li>
</ol>3. Dia 3: Preparação da câmara inferior
<ol><li>Verifique visualmente a confluência da camada de células endoteliais. Neste ponto, determine a presença de uma camada confluente e morfologia semelhante a paralelepípedos (Figura 1). Realizar a troca do meio na câmara superior com 300 μL de meio EC.</li>
	<li>Em seguida, prepare a câmara inferior para semear as células que formam a camada epitelial. Lave a câmara inferior suavemente com 150 μL do meio RPMI (adicione 1:100 (v / v) Penicilina / Estreptomicina (10.000 U / mL), 5% de soro fetal de vaca, 1 μM de dexametasona).</li>
	<li>Para a câmara inferior, semeie 0,5 x 106 células H441 suspensas em 200 μL de meio RPMI (RPMI) por cavidade.</li>
	<li>Coleta de células H441<ol><li>Lave as células com 5 mL de PBS (-/-) uma vez. Adicione 2 mL de tripsina a 0,25% + 1 mM de EDTA em PBS (-/-).</li>
		<li>Incubar as células durante 5 min a 37 °C e 5% de CO2. O tempo de incubação varia de acordo com a confluência da camada. Dentro de 5-7 min, as células devem se desprender completamente.</li>
		<li>Pare a atividade da tripsina com 10 mL de PBS (+/+) + 5% de FBS, colete as células e centrifugue a 200 x g por 4 min.</li>
		<li>Após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 1 ml de RPMI e contar.</li>
		<li>Semeie 0,5 x 106 células por câmara, pipetando suavemente a solução celular para a câmara inferior. Feche todas as portas e vire o biochip de cabeça para baixo para que as células possam se conectar à membrana PET. Manter o biochip de cabeça para baixo e incubar durante a noite numa incubadora de cultura de células a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Dias 4 - Dia 7: Manutenção das células e colheita de monócitos
<ol><li>Realize a troca diária de meio na câmara superior e inferior. Para a câmara superior, realizar a troca do meio com 300 μL de meio EC.</li>
	<li>Use 200 μL de RPMI+ (meio RPMI mais 1:100 (v/v) Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/mL GM-CSF, 10% de soro humano autólogo, 1 μM de dexametasona) para a câmara inferior. No dia 7, lave a câmara inferior com RPMI+ para preparar a cavidade para a semeadura de monócitos.</li>
	<li>Semear 0,1 x 106 monócitos suspensos em 200 μL RPMI+ na câmara inferior.</li>
	<li>Colheita de monócitos<ol><li>Lave as células com 1 mL de PBS (-/-) e incube por 7 min a 37 ° C em PBS pré-aquecido (- / -) contendo 4 mg / mL de lidocaína + 5 mM de EDTA a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		<li>Colete as células e centrifugue a 350 x g por 7 min, ressuspenda as células em 1mL de RPMI+ e conte. Coloque as portas do biochip voltadas para baixo para que as células se prendam à membrana.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Dia 8: Perfusão do biochip
<ol><li>Neste ponto, certifique-se de que os biochips estejam prontos para serem conectados ao fluxo e perfundidos. Antes de iniciar a perfusão, prepare uma incubadora vazia e coloque a bomba peristáltica dentro.</li>
	<li>Perfusão dos biochips<ol><li>Antes de conectar o tubo esterilizado ao biochip, lave o tubo com 200 μL de PBS (+/+), seguido por 200 μL de meio EC. A tubulação tem um diâmetro interno de 0,5 mm, consistindo em lados mais longos (20 cm) e mais curtos (12 cm) divididos por duas rolhas de bomba peristálticas. Coloque a tubulação de lado e prepare os reservatórios para o meio.</li>
		<li>Efectuar a troca do meio nas câmaras superior e inferior, lavando-as com o respectivo meio de cultura celular recém-preparado.</li>
		<li>Insira o reservatório no lado de saída do biochip e conecte o reservatório com a tubulação à entrada do biochip (Figura 2). Conecte a tubulação ao reservatório e ao biochip para que haja uma perfusão média circular entre o reservatório e o biochip.</li>
		<li>Assim que tudo estiver conectado às portas, encha o reservatório com 500 μL de meio EC. Conecte o biochip com a tubulação em uma perfusão com uma vazão de 21 μL / min (Figura 2). Observe atentamente durante os primeiros 15 minutos de perfusão para a inserção de bolhas. Realize a troca média diariamente em ambas as câmaras.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Dia 9 - Dia 11: Estabelecendo uma interface ar-líquido
<ol><li>Pare a perfusão, esvazie os reservatórios e reabasteça com meio recém-preparado sob um gabinete de segurança estéril. Pipetar 500 μL de meio EC nos reservatórios e lavar suavemente a câmara inferior com 200 μL de RPMI+. Inicie a perfusão novamente com uma taxa de perfusão de 21 μL / min.</li>
	<li>Interface Ar-Líquido (ALI)<ol><li>Estabelecer o ALI desde o dia 12 até ao final da experiência (dia 14). Durante a cultura de LPA, exponha as células epiteliais ao ar.</li>
		<li>Para estabelecer a cultura ALI, prepare um novo meio vascular EC (adicionar 1:100 (v / v) Penicilina / Estreptomicina (10.000 U / mL), 10 ng / ml GM-CSF, 20% de soro humano autólogo, 1μM de dexametasona) para manter todos os tipos de células no chip. Neste ponto, o meio contém uma concentração mais alta de AS (20%).</li>
		<li>Abra os plugues na câmara inferior sob um gabinete de segurança estéril e absorva cuidadosamente o meio até que uma bolha de ar seja visível, conforme mostrado na Figura 3. Certifique-se de que todo o líquido do canal e da câmara seja removido e feche as portas com cuidado.</li>
		<li>Encher os reservatórios com meio EC (-/-) e continuar a cultura de perfusão com um caudal de 21 μL/min. Troque o meio apenas na câmara superior até o dia 14 e mantenha as células epiteliais na câmara inferior apenas com ar.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Dia 14: Colheita e análise de tecidos
<ol><li>Desconecte o biochip do fluxo. Desligue a tubulação e verifique no microscópio se há confluência celular. Devido ao ar na câmara inferior, as camadas celulares podem parecer confusas e difíceis de visualizar. Neste ponto, o modelo está pronto para mais experimentações.</li>
	<li>Fixação e coloração de tecido em biochip<ol><li>Lave as cavidades com PBS (+/+) para remover o meio de cultura celular. Pipetar 300 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% dissolvido em PBS (-/-) para a câmara superior e 200 μL na câmara inferior e incubar por 10 min em RT. NOTA: Ao trabalhar com produtos químicos de fixação, como PFA, use uma capela de exaustão. Colete e descarte os resíduos de acordo.</li>
		<li>Lave as câmaras 3x com PBS (+/+). Após a fixação, armazene os biochips a 4 °C ou use-os diretamente para coloração de imunofluorescência das células.</li>
		<li>Para permeabilização, pipetar 300 μL de Triton X-100 a 0,25% em PBS (+/+). Incubar por 30 min em RT.</li>
		<li>Após a incubação, lavar ambas as câmaras com PBS (+/+) e pipetar 300 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 3% em PBS (+/+) em ambas as câmaras. Incubar por 1 h em RT.</li>
		<li>Enquanto isso, prepare o painel de anticorpos para coloração por imunofluorescência. Para preparar o painel de anticorpos para a coloração por imunofluorescência, foi instalado um tubo com quantidade suficiente de 3% de BSA para diluir os anticorpos. Use 50 μL de diluições de anticorpos para cada membrana. Utilizar uma razão de diluição de 1:100 para os painéis de anticorpos primários e de 1:200 para os painéis de anticorpos secundários. Além disso, para o painel de anticorpos secundários, prepare DAPI em uma proporção de diluição de 1:2.000. Para anticorpos correspondentes, consulte (Tabela 1).</li>
		<li>Para acessar diretamente as células dentro do biochip, a folha de ligação deve ser removida. Para abrir as câmaras microfluídicas, faça um corte exato na parte externa da cavidade e remova a folha de ligação. Corte a membrana removendo as bordas seladas ao biochip com o bisturi. NOTA: Trabalhe com precisão e precisão durante esta etapa para evitar danos à membrana e ferimentos devido à nitidez do bisturi.</li>
		<li>Depois de separar a membrana do biochip, divida a membrana em duas partes. Recolha os pedaços de membrana com uma pinça e coloque-os em uma lâmina microscópica para coloração.</li>
		<li>Pipetar 50 μL de solução de anticorpos por peça de membrana. Incubar durante a noite a 4 °C, protegido da luz.</li>
		<li>Após a incubação, coloque a membrana em 500 μL de PBS (-/-) em uma placa de 24 poços e lave a membrana 3x por 5 min cada em PBS (+/+). Após a lavagem, pipetar 50 μL de solução de anticorpo secundário e incubar por 1 h em RT protegido da luz.</li>
		<li>Lave a membrana com PBS (+/+) 3x por 5 min cada. Enquanto isso, prepare e rotule as lâminas microscópicas para o experimento. Coloque uma gota do meio de montagem na corrediça e coloque a membrana correspondente. Repita esta etapa para todas as membranas. No final, coloque mais uma gota do meio de montagem na parte superior da membrana e use uma lamínula. Conservar a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

Estabelecendo um modelo Lung-on-Chip para estudos de infecção respiratória

<ol><li>Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immune+responses+to+infection+and+vaccination+in+the+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract.</a> Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).</li>
<li>Artzy-Schnirman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+lung-on-chip+platforms+for+inhalation+assays%3A+From+prospect+to+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharma+Biopharma%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline.</a> Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-organ+chip+with+matured+tissue+niches+linked+by+vascular+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow.</a> Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).</li>
<li>Deinhardt-Emmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+with+staphylococcus+aureus+after+primary+influenza+virus+infection+leads+to+damage+of+the+endothelium+in+a+human+alveolus-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model.</a> Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).</li>
<li>Schicke, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+lung+infection+results+in+down-regulation+of+surfactant+protein-a+mainly+caused+by+pro-inflammatory+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages.</a> Microorganisms. 8 (4), 577(2020).</li>
<li>King, S. D., Chen, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+on+surfactant+protein+a%3A+Cellular+function+in+lung+and+kidney+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).</li>
<li>Hoang, T. N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+aspergillosis-on-chip%3A+A+quantitative+treatment+study+of+human+aspergillus+fumigatus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection.</a> Biomaterials. 283, 121420(2022).</li>
<li>Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin%3A+An+important+functional+molecule+at+respiratory+barrier+between+defence+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction.</a> Front Physiol. 12, 720227(2021).</li>
<li>Van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cell+adhesion+molecule+e-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The cell-cell adhesion molecule e-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li>
</ol>

K.R. é CEO da Dynamic42 GmbH e detém participação acionária na empresa. A.S.M. é consultor científico da Dynamic 42 GmbH e detém participação acionária na empresa. Todos os outros autores não têm conflitos de interesse.

O modelo alvéolo-em-chip representa um modelo de tecido multicamadas do alvéolo humano, integrando tipos de células essenciais do trato respiratório inferior, incluindo células epiteliais pulmonares, células endoteliais e macrófagos, cultivadas em um arranjo organotípico em um ALI com perfusão média do revestimento endotelial. Células de diferentes camadas expressam proteínas marcadoras celulares específicas, como a E-caderina, uma molécula de adesão dependente de cálcio das células epiteliais pulmonares, que é central no estabelecimento de barreiras epiteliais intercelulares 5,10. A E-caderina forma um elemento de barreira física e controla a resposta imunológica a patógenos e substâncias nocivas no meio ambiente10,11. As células epiteliais H441 expressam ainda mais a proteína surfactante A, que também é crucial na primeira linha de defesa do hospedeiro contra a infecção, mediando a atividade imunomoduladora e antibacteriana8. A integração de células imunes no modelo alvéolo aumenta sua complexidade celular, replicando melhor a resposta imune aos gatilhos inflamatórios, ou seja, durante a infecção. Nesse contexto, o modelo foi utilizado para estudar a coinfecção do vírus influenza A e do patógeno oportunista humano Staphylococcus aureus (S. aureus)5. No estudo, foi revelado um mecanismo de coinfecção na pneumonia em que a infecção viral das células epiteliais desencadeia uma resposta inflamatória significativa, o que causa danos consideráveis às células endoteliais, levando a uma perda da função de barreira. Em outro estudo, o modelo foi usado para demonstrar que a infecção por S. aureus reduz os níveis extracelulares de proteína surfactante-A (SP-A), um componente crucial da defesa imunológica nos pulmões, provavelmente devido a proteases bacterianas6. Embora a expressão de SP-A não seja diretamente afetada por S. aureus ou pelo vírus influenza A, ela é significativamente regulada negativamente pelo TNF-α, uma citocina altamente produzida em resposta a infecções bacterianas, especialmente na presença de macrófagos. Esses resultados sugerem que as mono e superinfecções bacterianas podem reduzir os níveis de SP-A no pulmão, potencialmente piorando o resultado da pneumonia bacteriana6. Além disso, o modelo de alvéolo tem sido usado para estudar a infecção fúngica do alvéolo por Aspergillus fumigatus e a eficácia de medicamentos antifúngicos, aproveitando a microscopia de alta resolução e a análise de imagem baseada em algoritmo em combinação com ensaios biológicos moleculares, incluindo coloração de imunofluorescência e perfil de citocinas7. A modelagem da aspergilose pulmonar invasiva no alvéolo no chip revelou funções-chave dos macrófagos humanos que poderiam inibir parcialmente o crescimento do fungo. Os macrófagos foram centrais na liberação de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, que se correlacionaram com um aumento do número de hifas fúngicas invasivas. Além disso, o estudo confirmou que a droga fungistática caspofungina limita efetivamente o crescimento fúngico e induz mudanças morfológicas na estrutura fúngica, alinhando-se com os achados de outros estudos. Esses estudos confirmam o potencial da plataforma modelo para identificar alvos celulares de infecção e testar drogas em concentrações clinicamente relevantes.
Existem vários aspectos que precisam ser considerados durante o estabelecimento do alvéolo no chip. A semeadura precisa de células é fundamental para obter uma distribuição celular uniforme e a formação de camadas. Certifique-se de que as células sejam semeadas na densidade apropriada para alcançar a confluência sem crescer demais, o que pode comprometer a integridade e a funcionalidade das camadas celulares. Durante o processo de estabelecimento do ALI, remova cuidadosamente o meio do lado apical e feche as portas para evitar contaminação. Manter as condições ideais de co-cultura, como temperatura, níveis de CO2 e composição do meio, é fundamental para a sobrevivência e interação das células endoteliais e epiteliais. Sempre execute as trocas de meio com cuidado para evitar perturbar as camadas celulares ou introduzir bolhas de ar. Pipete suavemente e certifique-se de que todos os equipamentos usados sejam estéreis para minimizar o risco de contaminação. Para evitar bolhas de ar, pipete lentamente e incline o cavaco durante as trocas médias para permitir que as bolhas escapem. Trabalhe em um ambiente limpo, estéril e controlado para minimizar a contaminação. Considere a complexidade e a precisão necessárias para estabelecer e manter o modelo 3D para experimentos subsequentes com o modelo. Se as camadas celulares não estiverem se formando corretamente, considere otimizar a densidade celular e os lotes de células, pois podem ocorrer diferenças no crescimento celular dependendo do doador e do lote.
Embora o modelo ofereça melhorias significativas em relação aos métodos existentes, também é essencial reconhecer que algumas limitações devem ser consideradas. Uma dessas limitações é a complexidade e o custo associados à operação do dispositivo microfluídico. A execução de modelos organ-on-chip requer equipamentos especializados e experiência em microfluídica para adotar o modelo alveolus-on-chip. Além disso, embora este modelo possa replicar com sucesso muitas das principais características do ambiente alveolar, ele não pode replicar totalmente todas as interações celulares e forças mecânicas encontradas in vivo. Por exemplo, o modelo não possui um sistema imunológico abrangente ou toda a gama de tipos de células no pulmão humano, o que pode afetar a precisão dos estudos de interação patógeno-hospedeiro.
Apesar dessas limitações, o modelo lung-on-chip oferece avanços em comparação com as culturas de células 2D tradicionais, como os sistemas Transwell. Ao incorporar uma interface ar-líquido, células endoteliais e epiteliais e componentes imunes em um tecido multicamadas dentro de um ambiente dinâmico e perfundido, o modelo representa uma abordagem fisiologicamente mais relevante para estudar a fisiologia pulmonar, doenças e respostas ao tratamento in vitro. Isso é crucial para avançar nossa compreensão das infecções respiratórias humanas e desenvolver terapias mais eficazes. A capacidade do modelo de manipular com precisão pistas biofísicas e bioquímicas representa uma característica importante para dissecar os mecanismos de progressão da doença e ação do medicamento. O uso de material celular humano pode reduzir ainda mais as diferenças relacionadas entre espécies observadas em experimentos com animais. A integração de múltiplas análises de biomarcadores também aumenta ainda mais a profundidade e a amplitude dos dados obtidos a partir de um único experimento, o que contribui para reduzir os custos da experimentação in vitro. Embora reconheça suas limitações, o modelo lung-on-chip representa um avanço significativo na pesquisa de doenças respiratórias, oferecendo uma alternativa mais precisa, ética e eficiente aos métodos tradicionais.

O pulmão humano tem um papel marcante na respiração e na defesa imunológica, com interações complexas entre as respostas imunes da mucosa alveolar1. A capacidade dos alvéolos de criar uma resposta imune eficiente é vital para prevenir infecções pulmonares e garantir a saúde pulmonar. Como os pulmões estão constantemente expostos a uma ampla gama de riscos potenciais, incluindo bactérias, vírus, fungos, alergias e material particulado, entender as complexidades das respostas imunes da mucosa alveolar é fundamental para descobrir os mecanismos por trás de infecções respiratórias, distúrbios inflamatórios e tratamento de doenças pulmonares1.
Para estudar os processos relacionados à infecção e inflamação do trato respiratório in vitro, são necessários modelos que possam imitar fielmente o meio alveolar e as respostas imunes. A cultura de células 2D e os módulos animais têm sido usados há décadas como ferramentas essenciais para a pesquisa biomédica sobre a resposta imune pulmonar. No entanto, muitas vezes eles têm limitações em seu potencial de tradução para situações humanas. Os modelos lung-on-chip podem contribuir para preencher a lacuna entre os modelos tradicionais in vitro e in vivo e fornecer uma nova abordagem para estudar as respostas imunes específicas do ser humano 2,3. Os modelos de pulmão em chip podem imitar a interface ar-líquido, que é necessária para que as células pulmonares recapitulem as condições fisiológicas do trato respiratório e desenvolvam um modelo de tecido mais preciso e robusto. Essa técnica de cultura permite um exame preciso da diferenciação, funcionamento e respostas celulares a drogas ou estímulos relacionados a doenças in vitro2.
Neste estudo, apresentamos um modelo baseado em microfluídica do alvéolo humano como uma ferramenta eficaz para recapitular o meio alveolar humano, aplicando perfusão para imitar o fluxo sanguíneo e a estimulação biomecânica das células endoteliais e incorporando uma interface ar-líquido com células epiteliais expostas a uma fase aérea4. Desenvolvemos um alvéolo perfundido microfluídico em chip que imita a estrutura física e as interações biológicas do alvéolo humano, com foco particular na interface ar-líquido. Essa interface desempenha um papel crucial na diferenciação das células epiteliais respiratórias, o que é essencial para modelar com precisão o ambiente pulmonar. O modelo usa células epiteliais pulmonares distais humanas (H441) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), com macrófagos primários derivados de monócitos posicionados entre as camadas celulares. Essa configuração replica o intrincado arranjo celular do alvéolo e é fundamental para simular com precisão a interface ar-líquido, que é um fator significativo na função fisiológica do tecido pulmonar.
A lógica por trás do desenvolvimento do modelo se estende à integração de células imunes circulantes e residentes no tecido. Essa abordagem foi projetada para imitar com precisão a resposta inflamatória do hospedeiro a infecções respiratórias humanas, fornecendo um ambiente dinâmico para estudar as interações patógeno-hospedeiro. A presença de macrófagos permite o exame das respostas imunes imediatas e sua interação com patógenos, refletindo a primeira linha de defesa contra infecções respiratórias. Além disso, o design da plataforma do biochip facilita a manipulação conveniente e precisa de pistas biofísicas e bioquímicas, o que é crucial para replicar a função do alvéolo in vitro. Essa flexibilidade é fundamental para dissecar os fatores que contribuem para infecções humanas, permitindo que os pesquisadores ajustem as condições para refletir vários estados de doença ou testem possíveis intervenções terapêuticas. A compatibilidade da plataforma com várias tecnologias de leitura, incluindo microscopia avançada, análises microbiológicas e análise bioquímica de efluentes, aumenta sua utilidade. Esses recursos permitem uma avaliação abrangente da resposta tecidual a infecções, incluindo a avaliação do comportamento celular, proliferação de patógenos e a eficácia das respostas imunes.
Apresentamos um protocolo detalhado e técnicas para criar e utilizar um modelo de alvéolo humano em chip focado na replicação da interface ar-líquido e na integração de células imunes para estudar infecções humanas in vitro.

<table><tbody><tr><td>ConsumíveisLâminas de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>câmara de contagem de células (Countess)</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Placas multipoços para cultura de células, 24 poços, Greiner</td><td>Bio-One</td><td>662 160</td><td></td></tr><tr><td>Placas multipoços para cultura de células estéreis, 6 poços, Greiner</td><td>Bio-One</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas (24x40mm; #1.5)</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes ecológicos</td><td>Dr. Schuhmacher</td><td>00-915-REW10003-01</td><td></td></tr><tr><td>Eppies 2.0</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Eppis 0.5</td><td>Sarstedt</td><td>72.699</td><td></td></tr><tr><td>Eppis 1.5</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Falcons 15mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188 271-TRI</td><td></td></tr><tr><td>Falcons 50mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261-TRI</td><td></td></tr><tr><td>Gaze swab</td><td>Noba</td><td>PZN 2417767</td><td></td></tr><tr><td>Luvas Nitril 3000</td><td>Meditrade</td><td>1280</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas</td><td>de microscópio Menzel-Gl&auml; ser</td><td>AAAA000001##12E</td><td></td></tr><tr><td>Placas Multipoços 24 Poços, estéreis</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 160</td><td></td></tr><tr><td>pipetas Pasteur (vidro) 150mm</td><td>Assistent</td><td>40567001</td><td></td></tr><tr><td>pipetas Pasteur (vidro) 230mm</td><td>Assistent</td><td>40567002</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo (PS, 5mL)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm</td><td>Sarstedt</td><td>85.1637.235</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis</td><td>Dahlhausen</td><td>11.000.00.715</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 10mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607 160-TRI</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 25mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760 160-TRI</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 2mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>710 160-TRI</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 50mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768 160-TRI</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 5mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606 160-TRI</td><td></td></tr><tr><td>S-Monovette, 7,5ml Z-Gel</td><td>Sarstedt</td><td>1.1602</td><td></td></tr><tr><td>S-Monovette, 9,0ml K3E</td><td>Sarstedt</td><td>02.1066.001</td><td></td></tr><tr><td>Softasept N</td><td>Braun</td><td>3887138</td><td></td></tr><tr><td>Frasco T25</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690 960</td><td></td></tr><tr><td>Pontas estéreis 10&micro; L</td><td>Greiner Bio-One</td><td>771 261</td><td></td></tr><tr><td>Pontas estéreis 1250&micro; L</td><td>Greiner Bio-One</td><td>750 261</td><td></td></tr><tr><td>Pontas estéreis 300&micro; L</td><td>Greiner Bio-One</td><td>738 261</td><td></td></tr><tr><td>Pontas não esterilizadas 10&micro; L</td><td>Greiner Bio-One</td><td>765 290</td><td></td></tr><tr><td>Pontas não esterilizadas 1000&micro; L</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739 291</td><td></td></tr><tr><td>Pontas não esterilizadas 200&micro; L</td><td>Greiner Bio-One</td><td>686 290</td><td></td></tr><tr><td>Pinças (Pr&auml; zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)</td><td>Roth</td><td>K343.1</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Descosept AF</td><td>Dr. Schuhmacher</td><td>N-20338</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Nordbrand-Nordhausen</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (3-5kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem fluorescente</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>20847.295</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Fluka</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Alconox</td><td>1304-1</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Dexametason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Lonza</td><td>BE17-513F</td><td></td></tr><tr><td>Solução EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E788S</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células Endoteliais</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células Endoteliais Mix de suplementos</td><td>Promocell</td><td>C-39225</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129-10g</td><td></td></tr><tr><td>H441</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-30</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647-15G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122 /-163</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>72400047</tr><tr><td>Coloração azul de tripano 0,4%</td> <td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > Anticorpos primários < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Caderina-5 / VE-Caderina (cabra)</td> <td>BD</td><td>610252</td><td></td></tr><tr><td>CD68 (coelho)</td> <td>Sinalização celular</td><td>76437</td><td></td></tr><tr><td>E-caderina (cabra)</td><td>R& D</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>SP-A (camundongo)</td><td>Abcam</td><td>ab51891</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos secundários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AF488 (camundongo anti-burro)</td><td>Invitrogen</td><td>R37114</td><td></td></tr><tr><td>AF647 (anti-rato burro)</td><td>Invitrogen</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>AF647 (anti-coelho burro)</td><td>Invitrogen</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 (burro anti cabra)</td> <td>jackson research</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>Microfluídico</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chip</td><td>Dynamic 42</td><td>BC002</td><td></td></tr><tr><td>Macho Luer Lock (pequeno)</td><td>ChipShop</td><td>09-0503-0270-09</td><td></td></tr><tr><td>Macho mini luer plugs, fileira de quatro, PP, verde</td><td>Microfluídico chipshop</td><td>09-0558-0336-11</td><td></td></tr><tr><td>Plugues luer mini macho, fileira de quatro, PP, opaco</td><td>Chipshop microfluídico</td><td>09-0556-0336-09</td><td></td></tr><tr><td>Plugues luer mini macho, fileira de quatro, PP, vermelho</td><td>Plugues microfluídicos chipshop</td><td>09-0557-0336-10</td><td></td></tr><tr><td>Cole</td><td>Parmer</td><td>GZ-45555-56</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório 4.5mL</td><td>ChipShop</td><td>16-0613-0233-09</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação</td><td>Dinâmica 42</td><td>ST001</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>5075 ELV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Heracell</td><td>150i</td><td></td></tr><tr><td>Countess contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Flowcytometer</td><td>BD</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-20 &deg; C)</td> <td>Freezer Liebherr</td><td>LCexv 4010</td><td></td></tr><tr><td>(-80 &deg; C)</td> <td>Heraeus</td><td>Herafreeze HFU 686</td><td></td></tr><tr><td>Geladeira</td><td>Liebherr</td><td>LCexv 4010</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>X3R</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Heidolph</td><td>Reax2000</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>REGLO Digital MS-4/12</td><td>ISM597D</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 10&micro; L</td><td>Eppendorf Research plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 100&micro; L</td><td>Eppendorf Research plus</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 1000&micro; L</td><td>Eppendorf Research plus</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 2.5&micro; L</td><td>Eppendorf Research plus</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 20&micro; L</td><td>Eppendorf Research plus</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 200&micro; L</td><td>Eppendorf Research plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Sartorius</td><td>6101</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Sartorius</td><td>TE1245</td><td></td></tr><tr><td>Bancada Estéril</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL-130</td><td></td></tr><tr><td>Banho de Água</td><td>Julabo</td><td>SW-20C</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apotome.2</td><td>Dispositivo de iluminação Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>HXP 120 C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer 5</td><td></td></tr><tr><td>Seccionamento óptico</td><td>Zeiss</td><td>ApoTome</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Eplax Vp232</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN </td><td>Zeiss</td><td></td><td></td> Edição Azul</tr></tbody></table>

modelo alveolus-on-chip imunocompetente para estudo das respostas imunes da mucosa alveolar

Immunocompetent Alveolus-on-Chip Model for Studying Alveolar Mucosal Immune Responses

Apresentamos um modelo avançado de pulmão em chip imunocompetente projetado para replicar a estrutura e função alveolar humana. Este modelo inovador emprega um biochip perfundido microfluídico que suporta uma interface ar-líquido que imita o ambiente nos alvéolos humanos. A engenharia de tecidos é usada para integrar os principais componentes celulares, incluindo células endoteliais, macrófagos e células epiteliais, para criar um modelo de tecido representativo do alvéolo. O modelo facilita exames aprofundados das respostas imunes da mucosa a vários patógenos, incluindo vírus, bactérias e fungos, avançando assim nossa compreensão da imunidade pulmonar. O objetivo principal deste protocolo é fornecer detalhes para estabelecer este modelo de alvéolo em chip como uma plataforma in vitro robusta para estudos de infecção, permitindo que os pesquisadores observem e analisem de perto as complexas interações entre patógenos e o sistema imunológico do hospedeiro no ambiente pulmonar. Isso é alcançado por meio da aplicação de técnicas baseadas em microfluídica para simular as principais condições fisiológicas dos alvéolos humanos, incluindo fluxo sanguíneo e estimulação biomecânica das células endoteliais, além de manter uma interface ar-líquido crucial para a exposição realista das células epiteliais ao ar. O sistema modelo é compatível com uma variedade de ensaios padronizados, como coloração por imunofluorescência, perfil de citocinas e análise de unidade formadora de colônias (UFC)/placa, permitindo insights abrangentes sobre a dinâmica imunológica durante a infecção. O Alveolus-on-chip é composto por tipos de células essenciais, incluindo células epiteliais pulmonares distais humanas (H441) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), com macrófagos primários derivados de monócitos estrategicamente posicionados entre as camadas epitelial e endotelial. O modelo de tecido aumenta a capacidade de dissecar e analisar os fatores diferenciados envolvidos nas respostas imunes pulmonares in vitro. Como uma ferramenta valiosa, deve contribuir para o avanço da pesquisa pulmonar, fornecendo um modelo in vitro mais preciso e dinâmico para estudar a patogênese das infecções respiratórias e testar possíveis intervenções terapêuticas.

Um exame das alterações morfológicas e da expressão de proteínas marcadoras pode ser realizado usando coloração de imunofluorescência. Após co-cultivo por 14 dias, os lados vascular e epitelial são analisados quanto à expressão dos respectivos marcadores celulares. Este método é útil para estudar as interações e integridade dos componentes vasculares e epiteliais, o que é essencial para a modelagem da doença como uma leitura biológica funcional relacionada à infecção. A coloração por imunofluorescência pode ser apoiada pela quantificação de análises, avaliação morfológica e ensaios funcionais, incluindo liberação de citocinas, análise de efluentes de marcadores de morte celular, como liberação de LDH, e alteração na morfometria das células5. No lado vascular, a integridade e a morfologia das proteínas da junção celular endotelial, como a VE-caderina, podem ser estudadas para avaliar a confluência e a formação da barreira endotelial6 (Figura 4A). Após a perfusão, a camada de células endoteliais deve ser confluente com uma expressão claramente estruturada de VE-caderina nas bordas das células endoteliais. A parte inferior da membrana pode ser imunomarcada para marcadores epiteliais, como E-caderina e Surfactante Proteína A (SP-A)7. A expressão de SP-A, um componente-chave do surfactante pulmonar e uma mistura complexa de lipídios e proteínas, reduz a tensão superficial na interface epitelial ar-líquido e, assim, evita in vivo o colapso dos alvéolos durante a expiração e a manutenção da função pulmonar e das trocas gasosas adequadas 6,8. Em nosso modelo, as células epiteliais expressam SP-A após o tratamento com LPA e podem ser visualizadas por coloração por imunofluorescência (Figura 4B). A confluência e integridade da camada de células epiteliais podem ser confirmadas pela coloração por imunofluorescência para E-caderina, um importante marcador juncional epitelial das células epiteliais alveolares (Figura 4C). A presença de macrófagos pode ser confirmada por coloração por imunofluorescência para a proteína criadora de macrófagos CD686 (Figura 4C). Para estudar infecções virais, bacterianas ou fúngicas, encontre detalhes sobre os modelos de infecção fornecidos em Deinhardt-Emmer et al.6, Schicke et al.7 e Hoang et al.9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66602/66602fig01.jpg"> Figura 1: Imagem representativa de uma camada confluente de HUVECs no biochip no dia 3. A imagem mostra microscopia de campo claro com ampliação de 10x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66602/66602fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66602/66602fig02.jpg"> Figura 2: Configuração para a indução do alvéolo-em-chip e do LPA. (A) Imagem representativa da configuração de perfusão para o modelo alvéolo-em-chip e (B) uma imagem representativa da indução de um LPA na câmara absorvendo o meio e introduzindo ar nas células. A formação de uma bolha de ar dentro da câmara indica que as células estão expostas ao ar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66602/66602fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66602/66602fig03.jpg"> Figura 3: Visão geral esquemática do alvéolo no chip. Um protocolo detalhado para 14 dias de cultura indica etapas importantes para a semeadura e o crescimento das células dentro do biochip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66602/66602fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66602/66602fig04.jpg"> Figura 4: Coloração por imunofluorescência das camadas de células endoteliais e epiteliais. (A) Células endoteliais HUVEC expressando VE-caderina (laranja), (BC) células epiteliais H441 expressando (B) SP-A (vermelho) e (C) E-caderina (laranja), SP-A (vermelho) e CD68 (verde) expressão no lado epitelial. DAPI (azul) cora o DNA e indica os núcleos das células. A barra de escala representa 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66602/66602fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cavidade</td>
			<td>Células</td>
		</tr><tr><td>Cavidade Superior</td>
			<td>Endotelial (0,4 x 106)</td>
		</tr><tr><td>Cavidade Inferior</td>
			<td>Epitelial (0,5x106H441+ 1x105 monócitos)</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Visão geral da semeadura celular no biochip.

Os modelos de pulmão em chip superam as culturas 2D tradicionais, imitando a interface ar-líquido e a perfusão de células endoteliais, simulando o fluxo sanguíneo e a troca de nutrientes cruciais para estudos de fisiologia pulmonar. Isso aumenta a relevância da pesquisa pulmonar, oferecendo um ambiente dinâmico e fisiologicamente preciso para avançar na compreensão e no tratamento de infecções respiratórias.

Modelo Alveolus-on-Chip Imunocompetente para Estudo das Respostas Imunes da Mucosa Alveolar

We introduce an advanced immunocompetent lung-on-chip model designed to replicate the human alveolar structure and function. This innovative model employs ...

Desenvolvemos modelos in vitro fisiologicamente relevantes para responder a questões mecanicistas em infecções humanas. Nosso foco está na resposta imune do hospedeiro. Quando usamos este modelo para dissecar a complexa interação do patógeno com o hospedeiro para identificar alvos moleculares e celulares para opções terapêuticas em infecções humanas.Trabalhando em um modelo de chip como o modelo pulmão no chip, equilibrado pela complexidade lógica com necessidades específicas de pesquisa, oferecendo insights sobre a regulação da resposta humano-hospedeiro. Este sistema imita a composição celular in vivo e a estrutura 3D, fornecendo condições mais definidas e alto rendimento do que os experimentos com animais. Na tecnologia lung-on-chip, um dos principais desafios é selecionar os tipos de células certos que imitam a funcionalidade complexa do pulmão para os resultados do estudo de infecção.Além disso, estender o cronograma do experimento além dos modelos tradicionais in vitro é crucial. Alavancar é a capacidade barata de manter a viabilidade celular com fluxo contínuo de nutrientes para observação mais longa, o experimento também é necessário. Desenvolvemos o modelo de base microfluídica do alvéolo humano como uma ferramenta eficaz para imitar o ambiente alveolar humano.Isso foi conseguido pela aplicação de perfusão para imitar o fluxo sanguíneo e também por uma estimulação mecânica nas células endoteliais. E também integrando a interface ar-líquido para as células epiteliais, expondo-as ao ar. O próximo passo é estender esse modelo para uma plataforma mais avançada, como o modelo baseado em células-tronco pluripotentes induzidas.Ao fazer isso, pretendemos aproximar a medicina personalizada da aplicação, particularmente no contexto de testes de medicamentos antivirais e como uma ferramenta para pesquisa biomédica e desenvolvimento farmacêutico.

immunocompetent-alveolus-on-chip-model-for-studying-alveolar-mucosal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Embora o estudo in vitro das interações patógeno-hospedeiro permita a caracterização de respostas imunes específicas, modelos in vivo são necessários para observar os efeitos de respostas complexas. Usando a exposição a Candida albicans seguida de infecção pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, estabelecemos um modelo murino de interações microbianas envolvidas na patogenicidade da pneumonia associada à ventilação mecânica.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Apresentado aqui é um protocolo para isolamento do monócito sanguíneo humano primário, bem como sua diferenciação em macrófagos e células dendríticas e montagem com células epiteliais em um modelo pulmonar humano multicelular. Respostas biológicas de coculturas compostas de células imunes diferenciadas de monócitos recém-isolados ou descongelados, após exposição a estímulos proinflamatórios, são comparadas.

Modelo Alveolar Humano Multicelular Composto por Células Epiteliais e Células Imunes Primárias para Avaliação de Riscos

Nosso protocolo detalhado descreve a criação e o uso do modelo avançado de intestino em chip, que simula a mucosa intestinal humana com estruturas 3D e vários tipos de células, permitindo uma análise aprofundada das respostas imunes e funções celulares em resposta à colonização microbiana.

Modelo Intestino em Chip Imunocompetente para Análise das Respostas Imunes da Mucosa Intestinal

Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Listeria monocytogenes é um organismo modelo para estudar as respostas imunológicas e suscetibilidade genética para as bactérias intracelulares em camundongos. Este método permite que sejam medidos carga bacteriana e gerar uma única célula suspensões de fígado e do baço de ratos para análise FACS para determinar mudanças em células do sistema imunológico devido à infecção por Listeria.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Nós descrevemos o isolamento rápido de murinos primários células tipo II alveolares epiteliais (AECII) por meio de seleção por citometria de fluxo negativo. Estes AECII mostram viabilidade e pureza elevados e são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares relativas ao seu papel em condições respiratórias, tais como doenças auto-imunes ou infecciosas.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

A coinfecção humana é difícil de replicar in vitro. No entanto, os parasitas da malária humana podem ser facilmente cultivados in vitro, assim como as células mononucleares do sangue periférico humano recém-isoladas naturalmente infectadas com o HIV. Isso fornece um excelente modelo para estudar as respostas imunes precoces aos parasitas da malária no contexto da coinfecção pelo HIV.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Este protocolo descreve como para inocular ratinhos C57BL / 6J com a estirpe de Listeria monocytogenes EGD (L. monocytogenes) e para medir o interferão-γ (IFN-γ) respostas de células assassinas naturais (NK), as células T assassinas naturais (NKT), e adaptativa linfócitos T após a infecção. Este protocolo descreve como também a realização de estudos de sobrevivência de ratinhos após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico.

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

Este protocolo descreve uma técnica não-invasiva para a amostragem de líquido imperturbado mucosa das vias aéreas superiores. Ele pode ser usado para realizar a quantificação dos níveis na vivo de mediadores de proteína, tais como citocinas e quimiocinas, em indivíduos de todas as idades.

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

Aprenda a desenvolver modelos alvéolo-on-chip imunocompetentes usando tecnologia de organ-on-a-chip com interface ar-líquido e perfusão endotelial. Este método avançado permite estudar respostas imunes da mucosa alveolar em infecções respiratórias com relevância fisiológica superior às culturas 2D tradicionais.

Modelo Alveolus-on-Chip Imunocompetente para Estudo das Respostas Imunes da Mucosa Alveolar

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