Name: Modelo Intestino em Chip Imunocompetente para Análise das Respostas Imunes da Mucosa Intestinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a criar modelos intestino-em-chip imunocompetentes usando células primárias e fluxo microfluídico. Esta plataforma permite analisar respostas imunes à colonização microbiana e identificar alvos terapêuticos para doenças infecciosas.

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O trabalho foi apoiado financeiramente pelo Centro de Pesquisa Colaborativa PolyTarget 1278 (número do projeto 316213987) para V.D.W. e A.S.M. A.F. e A.S.M. reconhecem ainda o apoio financeiro do Cluster de Excelência "Balance of the Microverse" sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. Queremos agradecer a Astrid Tannert e ao Laboratório de Imagem e Biofotônica de Jena (JBIL) por nos fornecer acesso ao seu microscópio confocal de varredura a laser ZEISS LSM980. A Figura 1C e a Figura 2 foram criadas com Biorender.com.

Plataforma Intestino em Chip Aprimorada para Insight Imunológico

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<li>Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+natural+killer+cells+in+a+microfluidically+perfused+liver+on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 285(2023).</li>
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<li>Hoang, T. N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+aspergillosis-on-chip%3A+A+quantitative+treatment+study+of+human+aspergillus+fumigatus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection.</a> Biomaterials. 283, 121420(2022).</li>
<li>Kaden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+intravenous+caspofungin+administration+using+an+intestine-on-chip+reveals+altered+Candida+albicans+microcolonies+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity.</a> Biomaterials. 307, 122525(2024).</li>
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<li>Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+morphogenesis+controlled+by+transepithelial+morphogen+gradient+and+flow-dependent+physical+cues+in+a+microengineered+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip.</a> iScience. 15, 391-406 (2019).</li>
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<li>Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+membrane+properties+on+cell+growth+in+an+%27airway+barrier+on+a+chip%27%5BTitle%5D)+AND+%22Organs-on-a-Chip%22%5BJournal%5D)">The effect of membrane properties on cell growth in an 'airway barrier on a chip'.</a> Organs-on-a-Chip. 5, 10025(2023).</li>
</ol>

M.R. é CEO da Dynamic42 GmbH e detém participação acionária na empresa. A.S.M. é consultor científico da Dynamic 42 GmbH e detém participação acionária na empresa.

O protocolo apresentado detalha as etapas necessárias para gerar um modelo de intestino em chip imunocompetente. Descrevemos técnicas específicas e possíveis métodos de leitura, como microscopia de imunofluorescência, análise de citocinas e metabólitos, citometria de fluxo, análise genética e de proteínas e medição de permeabilidade.
O modelo descrito consiste em HUVECs primários, macrófagos derivados de monócitos e células dendríticas derivadas de monócitos co-cultivadas com uma camada 3D de células epiteliais intestinais representando aspectos de populações secretoras de muco, absortivas, enteroendócrinas e semelhantes a células de Paneth, conforme descrito anteriormente 6,14. Alguns pontos críticos precisam ser lembrados ao executar as etapas do protocolo. Em todas as etapas, a formação de bolhas de ar deve ser evitada dentro do sistema microfluídico. Portanto, sempre pipete ao contrário (pegue o volume da segunda parada e dispense apenas até a primeira parada) ao manusear o biochip ou a tubulação. Para evitar forças de alta pressão ou cisalhamento nas células dentro do biochip, sempre pipete suavemente e mantenha a câmara oposta fechada ao pipetar no biochip (por exemplo, ao trocar o meio na câmara superior, feche a câmara inferior com os respectivos plugues). O biochip permite a semeadura de células nos dois lados de uma membrana PET. Assim, o modelo pode ser configurado com estruturas semelhantes a vilosidades intestinais sob a membrana PET ou crescendo na membrana para cima. Dependendo do interesse de pesquisa, uma ou outra orientação das células tem certos benefícios em termos de interação física, como a ligação celular de células circulantes suspensas no meio de fluxo.
Devido ao fluxo do meio microfluídico, as células intestinais polarizadas formam um tecido tridimensional semelhante a estruturas semelhantes a criptas e vilosidades, que formam uma profunda barreira tecidual apical por uma densa rede de junções apertadas e junções aderentes6. Além disso, as células imunes inatas integradas aumentam a função da barreira intestinal e permitem a investigação detalhada das respostas de citocinas e células imunes a vários estímulos, incluindo respostas imunes específicas do doador 3,6. O modelo oferece uma plataforma fisiologicamente relevante para estudar comensais microbianos (por exemplo, Lactobacillus rhamnosus6) e patógenos (por exemplo, Candida albicans 6,8) do intestino humano. O modelo foi aproveitado para investigar mecanismos de alterações na composição microbiana intestinal e regulação da resposta imune da mucosa6. No estudo, demonstramos como recriar a tolerância imunológica fisiológica do lúmen intestinal e apoiar a colonização homeostática por microrganismos vivos. Além disso, a pré-colonização do lado luminal do modelo com o probiótico Lactobacillus rhamnosus reduziu a invasão tecidual de Candida albicans e limitou sua translocação para o compartimento vascular, semelhante à situação in vivo. O estudo provou o potencial do modelo para estudar interações microbianas, respostas imunes e mecanismos de patogenicidade do intestino sob condições fisiologicamente relevantes in vitro.
Ainda assim, esta plataforma de chip tem limitações, nomeadamente, a utilização de células intestinais derivadas do cancro, que não são totalmente capazes de representar o intestino humano, e a utilização de células endoteliais e imunitárias primárias. As condições de cultura hipóxica podem ser estabelecidas cultivando o modelo em uma incubadora de hipóxia sob condições perfundidas para refletir melhor a situação in vivo do intestino humano.
Em comparação com outras plataformas de OoC, como o modelo "gut-on-a-chip" publicado por Kim et al.14,15 o número inicial de células que formam o modelo de tecido apresentado é cerca de 10 vezes maior. Isso, por exemplo, permite a análise simultânea de até três painéis de coloração de imunofluorescência em um único experimento. O número maior de células simplifica ainda mais as análises de endpoints, incluindo citometria de fluxo, análise de western blot e outros ensaios padrão prontos para uso, que exigem sobrenadantes de cultura de células, como perfil de citocinas e medição de lactato desidrogenase (LDH). Obter várias leituras de um único experimento reduz os custos gerais e o tempo experimental. Soluções de hardware prontas para uso de um amplo espectro de fabricantes estão disponíveis devido à plataforma de biochip padronizada que apresenta interfaces e pegadas da indústria (formato de lâmina microscópica do chip, portas em formato luer lock e alinhadas na matriz de 96 poços). Isso também inclui muitas membranas de diferentes materiais e tamanhos de poros. O tamanho dos poros pode influenciar o crescimento celular e a integridade do tecido16, bem como a migração celular.
Em resumo, este protocolo apresenta um modelo detalhado e adaptável de intestino em chip que replica elementos cruciais do ambiente intestinal humano. Ele fornece uma plataforma escalável e eficaz para a realização de pesquisas extensas sobre a microbiota intestinal e o tecido intestinal do hospedeiro, com foco particular nas respostas imunes do hospedeiro e na fisiopatologia intestinal. Assim, o modelo é capaz de preencher a lacuna entre os modelos tradicionais in vitro e a biologia humana, tornando-se uma ferramenta essencial para estudos aprofundados sobre biologia intestinal.

Os sistemas Organ-on-Chip (OoC) representam uma técnica emergente de cultura de células 3D que é capaz de preencher a lacuna entre a cultura de células 2D convencional e os modelos animais. As plataformas OoC geralmente consistem em um ou mais compartimentos contendo células específicas do tecido cultivadas em uma ampla variedade de andaimes, como membranas ou hidrogéis1. Os modelos são capazes de mimetizar uma ou mais funções organotípicas definidas. As bombas permitem a perfusão microfluídica contínua do meio de cultura celular para remoção de resíduos celulares, fornecimento de nutrição e fatores de crescimento para melhor diferenciação celular e recriação de condições essenciais in vivo. Com a integração de células imunes, os sistemas OoC podem mimetizar a resposta imune humana in vitro2. Até o momento, uma ampla gama de órgãos e unidades funcionais foi apresentada1. Esses sistemas incluem modelos da vasculatura3, pulmão4, fígado 2,5 e intestino6 que podem ser facilitados para testes de drogas 5,7 e estudos de infecção 6,8.
Apresentamos aqui um modelo de intestino humano em chip integrando células epiteliais humanas formando uma topografia 3D organotípica de estruturas semelhantes a vilosidades e criptas combinadas com um revestimento endotelial e macrófagos residentes no tecido. O modelo é cultivado em um biochip perfundido microfluidicamente no formato de uma lâmina microscópica. Cada biochip consiste em duas cavidades microfluídicas separadas. Cada cavidade é dividida por uma membrana porosa de tereftalato de polietileno (PET) em uma câmara superior e inferior. A própria membrana também serve como andaime para as células crescerem de cada lado. Os poros da membrana permitem a diafonia celular e a migração celular entre as camadas celulares. Cada câmara pode ser acessada por duas portas fêmeas do tamanho de uma fechadura luer. Opcionalmente, uma porta adicional do tamanho de uma trava mini-luer pode fornecer acesso à câmara superior ou inferior (Figura 1).
A plataforma OoC oferece uma série de leituras que podem ser obtidas a partir de um único experimento. O intestino em chip é adaptado para combinar cultura de células 3D perfundidas, análise de efluentes e microscopia de fluorescência para avaliar a expressão de marcadores celulares, taxas de metabolização, resposta imune, colonização e infecção microbiana e função de barreira 3,6,8. O modelo inclui células imunes residentes no tecido e contato direto de microrganismos vivos com o tecido hospedeiro, o que é um benefício em comparação com outros modelos publicados9. Além disso, as células epiteliais se auto-organizam em estruturas tridimensionais que fornecem uma interface fisiologicamente relevante para a colonização com uma microbiota viva6.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 poços preta, fundo transparente</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000631</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Roth</td><td>3738.4</td><td>Produtos químicos</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure, burro, anti-rato IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>715-545-150</td><td>Anticorpo secundário Coloração vascular e coloração epitelial</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure, burro, anti-coelho IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>711-605-152</td><td>Coloração epitelial de anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647, burro, anti-coelho IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A31573</td><td>Anticorpo secundário Coloração vascular</td></tr><tr><td>Axiocam ERc5s câmera</td><td>Zeiss</td><td>426540-9901-000</td><td>Equipamento técnico</td></tr> Médio <tr><td>basal MV, sem fenol vermelho</td><td>Promocell</td><td>C-22225</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Biochip</td><td>Dynamic 42</td><td>BC002</td><td>Consumíveis microfluídicos</td></tr><tr><td>BSA fração V</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>Consumíveis de cultura celular</td></tr><tr><td>C2BBe1 (clone de Caco-2)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td>Fonte de célula epitelial</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Produtos químicos</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Heracell</td><td>150i</td><td>Equipamento técnico</td></tr><tr><td>Colágeno IV da placenta humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td>Consumíveis para cultura de células</td></tr><tr><td>Lamínulas (24 x 40 mm; #1.5)</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>15747592</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure, burro, anti-cabra IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>705-165-147</td><td>Anticorpo secundário Coloração vascular</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure, burro, anti-rato IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>712-165-150</td><td>Anticorpo secundário Coloração epitelial</td></tr><tr><td>Descosept PUR</td><td>Dr.Schuhmacher</td><td>00-323-100</td><td>Consumíveis de cultura celular</td></tr><tr><td>Glicose alta DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-062</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>DMEM glicose alta sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Solução de EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células endoteliais</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Mistura de suplementos de meio de crescimento de células endoteliais</td><td>Promocell</td><td>C-39225</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Etanol 96%, não desnaturado</td><td>Nordbrand-Nordhausen</td><td>410</td><td>Produtos químicos</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>invitrogen</td><td>10270106</td><td>Cultura de células consumíveis</td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (3-5 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td>Produtos químicos</td></tr><tr><td>Meio de montagem fluorescente</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Produtos químicos</td></tr><tr><td>Gentamicina (10mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td>Consumíveis de cultura celular</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Consumíveis de</td></tr> <tr><td>cultura celularHistopaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Hoechst (bisbenzimida) H33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Coloração epitelial</td></tr><tr><td>Holotransferrina (5mg/mL) Transferrina, Holo, Plasma Humano</td><td>Millipore</td><td>616397</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>GM-CSF recombinante humano</td><td>Peprotech</td><td>300-30</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Humano recombinante M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>Consumíveis de cultura celular</td></tr><tr><td>Dispositivo de iluminação</td><td>Zeiss</td><td>HXP 120 C</td><td>Configuração do microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>Microscópio de varredura a laser</td><td>Zeiss</td><td>CLSM980</td><td>Configuração do microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>Cloridrato de lidocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>Consumíveis de cultura celular</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo (LPS)</td> <td>Sigma</td><td>L2630</td><td>Consumíveis de cultura celular</td></tr><tr><td>Toalhetes Loftex</td><td></td><td>1250115</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Tubos de fixação baixa (PS, 5 mL)</td><td>Consumíveis Falcon</td><td>352052</td><td>Adaptador</td></tr><tr><td>Luer para a tampa superior (M)</td><td>Mo Bi Tec</td><td>M3003</td><td>Consumíveis microfluídicos</td></tr><tr><td>Mini plugues luer macho, fileira de quatro, PP, opaco Loja de</td><td>chips microfluídica</td><td>09-0556-0336-09</td><td>Consumíveis microfluídicos</td></tr><tr><td>MEM Solução de aminoácidos não essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Roth</td><td>8388.2</td><td>Microscópio de produtos químicos</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer 5</td><td>Configuração do microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Menzel</td><td>MZ-0002</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Monoclonal, camundongo, anticorpo CD68 humano ( KP1)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>Anticorpo Primário Coloração</td></tr><tr><td>Vascular Monoclonal, rato, anti-humano E-Caderina anticorpo (DECMA-1)</td> <td>Sigma-Aldrich, Millipore</td><td>MABT26</td><td>Anticorpo Primário Coloração Epitelial</td></tr><tr><td>Multiskan Go leitor de placas</td><td>Thermo Fisher</td><td>51119300</td><td>Equipamento técnico</td></tr><tr><td>Soro normal de burro</td><td>Biozol</td><td>LIN-END9010-10</td><td>Produtos químicos</td></tr><tr>Configuração do <td>microscópio de fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>ApoTome</td> de <td>seccionamento óptico</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Plugues de consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td></td><td>Cole Parmer</td><td>GZ-45555-56</td><td>Consumíveis microfluídicos</td></tr><tr><td>Policlonal, caprino, anticorpo VE-caderina humana R</td><td>& D Systems</td><td>AF938</td><td>Anticorpo Primário Coloração Vascular</td></tr><tr><td>Policlonal, coelho, anti-humano Anticorpo de Fator Von Willebrand</td><td>Dako</td><td>A0082</td><td>Anticorpo Primário Coloração</td></tr><tr><td>Vascular Policlonal, coelho, anti-humano Anticorpo ZO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>Anticorpo Primário Coloração Epitelial</td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Eplax Vp232</td><td>Configuração do microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>Microscópio primovert</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td>Equipamento técnico</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica Reglo ICC</td><td>Ismatec</td><td>ISM4412</td><td>Equipamento técnico</td></tr><tr><td>SAHA (Vorinostat)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>SML0061-25MG</td><td>Produtos químicos</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Fluka</td><td>47036</td><td>Produtos</td></tr><tr><td>químicos S-Monovette, 7,5 mL Z-Gel</td><td>Sarstedt</td><td>01.1602</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>S-Monovette, 9,0 mL K3E</td><td>Sarstedt</td><td>02.1066.001</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Tanque 4,5 mL</td><td>ChipShop</td><td>10000079</td><td>Consumíveis microfluídicos</td></tr><tr><td>Coloração azul de tripano 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Consumíveis de cultura de células</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>11538876</td><td>Consumíveis para cultura de células</td></tr><tr><td>Tubulação</td><td>Dynamic 42</td><td>ST001</td><td>Consumíveis microfluídicos Pinças</td></tr><tr><td>(Pr&auml; zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)</td><td>Roth</td><td>K343.1</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Aglutinina de Gérmen de Trigo (WGA)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>W32464</td><td>Coloração Epitelial</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td>Consumíveis de cultura de células, meio de células hematopoiéticas</td></tr><tr><td>Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, Greiner estéril</td><td>Bio-One</td><td>662 160</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, estéril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Zen Blue Software</td><td>Zeiss</td><td>Versão 3.7</td><td>Microscopia</td></tr></tbody></table> Software

modelo intestino em chip imunocompetente para análise das respostas imunes da mucosa intestinal

Immunocompetent Intestine-on-Chip Model for Analyzing Gut Mucosal Immune Responses

Um modelo avançado de intestino em chip recriando estruturas epiteliais 3D organotípicas semelhantes a vilosidades e criptas foi desenvolvido. O modelo imunocompetente inclui células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), células epiteliais intestinais Caco-2, macrófagos residentes no tecido e células dendríticas, que se auto-organizam dentro do tecido, espelhando características da mucosa intestinal humana. Um aspecto único desta plataforma é sua capacidade de integrar células imunes primárias humanas circulantes, aumentando a relevância fisiológica. O modelo foi projetado para investigar a resposta do sistema imunológico intestinal à colonização e infecção bacteriana e fúngica. Devido ao seu tamanho de cavidade aumentado, o modelo oferece diversas leituras funcionais, como ensaios de permeação, liberação de citocinas e infiltração de células imunes, e é compatível com a medição de imunofluorescência de estruturas 3D formadas pela camada de células epiteliais. Ele fornece informações abrangentes sobre a diferenciação e função celular. A plataforma intestino em chip demonstrou seu potencial na elucidação de interações complexas entre substitutos de uma microbiota viva e tecido hospedeiro humano dentro de uma plataforma de biochip microfisiológico perfundido.

Esses resultados representativos mostram as distintas camadas de tecido do modelo intestino em chip. Eles são corados por imunofluorescência conforme descrito na seção 11 do protocolo. As imagens foram tiradas com um microscópio de epifluorescência ou fluorescência confocal como z-stacks e processadas para uma projeção ortogonal. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre a configuração microscópica e o software. A Figura 5 mostra a camada vascular, uma monocamada endotelial formadora de barreira, consistindo de HUVECs e macrófagos. Marcadores celulares representativos, como VE-Caderina e fator de von Willebrand para as células endoteliais e CD68 para os macrófagos, são corados. A camada epitelial tridimensional constituída por células C2BBe1 é mostrada na Figura 6 e na Figura 7. A integridade do tecido é confirmada pela coloração de E-Caderina e ZO-1. Uma análise detalhada de todos os marcadores teciduais esperados e polarização tecidual pode ser encontrada em Maurer et al.6. A Figura 8 mostra uma imagem exemplar sem crescimento tridimensional de estruturas semelhantes a vilosidades intestinais. Em comparação com uma camada de células tridimensional típica (Figura 6), o número de núcleos corados é altamente reduzido e as células estão presentes apenas em uma monocamada. Este fenótipo específico foi criado pela adição de um inibidor da histona desacetilase ao meio de cultura celular que inibe a proliferação celular. A permeabilidade da barreira é avaliada por um ensaio de permeação usando FITC-dextrano. A permeabilidade aumentou após a infecção com o patogênico oportunista C. albicans, conforme mostrado na Figura 9A. A infecção resulta no aumento da liberação das citocinas IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-10 no sobrenadante do meio vascular (Figura 9B)8.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig05.jpg"> Figura 5: Lado vascular fixado do intestino em chip. Imagem representativa de imunofluorescência da barreira vascular após cinco dias de perfusão. O tecido foi fixado com metanol. Uma pilha z de cortes de 1 μm foi obtida com um microscópio de epifluorescência e uma projeção máxima ortogonal dessa pilha z é exibida. (A) O DNA dentro dos núcleos foi corado com DAPI. (B) Macrófagos derivados de monócitos totalmente diferenciados expressam CD68 e estão espalhados por todo o tecido vascular. (C) Os HUVECs criam uma camada confluente que mostra a integridade do tecido pela formação de junções aderentes, como a VE-Caderina. Além disso, (D) o fator de von Willebrand é altamente expresso por HUVECs. Finalmente, (E) todos os marcadores são mostrados em uma sobreposição. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; HUVECs = células endoteliais venosas umbilicais humanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig06.jpg"> Figura 6: Lado epitelial fixado do intestino no chip. Imagem representativa de imunofluorescência da camada de células epiteliais polarizadas após 5 dias de perfusão expressando as proteínas de junção E-Caderina e ZO-1. O tecido foi fixado com metanol. Uma pilha z de cortes de 1 μm foi obtida com um microscópio de epifluorescência. Uma projeção máxima ortogonal desta pilha z é exibida. (A) O DNA nos núcleos foi corado com DAPI. Uma barreira epitelial apertada é desenvolvida pela formação de (B) junções aderentes, coradas com E-Caderina, e (C) junções apertadas apicais, coradas com ZO-1. Junções apertadas e junções aderentes co-localizam-se na membrana celular apical, como visto na imagem de sobreposição (D). Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig07.jpg"> Figura 7: Lado epitelial fixado do intestino em chip com crescimento semelhante a vilosidades. Imagem representativa de imunofluorescência da camada tridimensional de células epiteliais após seis dias de perfusão. O tecido foi fixado com fixador de Carnoy. Uma pilha z de seções de 1 μm foi tirada com um microscópio confocal de varredura a laser e (A) uma projeção máxima ortogonal dessa pilha z é exibida. O DNA nos núcleos foi corado com Hoechst. Além disso, o tecido foi corado com aglutina de gérmen de trigo, uma lectina, que cora a mucina humana. (B) O crescimento tridimensional de estruturas semelhantes a vilosidades e criptas do epitélio pode ser detectado nas seções x e y da pilha z. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: WGA = aglutinina de gérmen de trigo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig08.jpg"> Figura 8: Lado epitelial fixado do intestino em chip sem crescimento semelhante a vilosidades. Imagem representativa de imunofluorescência da camada de células epiteliais tratada com ácido hidroxâmico suberoylanilida (SAHA), um inibidor da histona desacetilase, impedindo a proliferação celular. O tecido foi fixado com metanol. Uma pilha z de cortes de 1 μm foi obtida com um microscópio de epifluorescência. Uma projeção máxima ortogonal desta pilha z é exibida. (A) O DNA nos núcleos foi corado com DAPI. Em (B), as junções aderentes são coradas com E-Caderina e, em (C), as junções apertadas são coradas com ZO-1. Junções apertadas e junções aderentes co-localizam, como visto na imagem de sobreposição (D). Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig09.jpg"> Figura 9: Resposta imune dependente de patógenos de células imunes inatas integradas: Esta figura é modificada de Kaden et al.8. O modelo intestino-on-chip não infectado (-) ou infectado (+) com C. albicans SC5314 foi analisado quanto à permeabilidade (A) com FITC-Dextrana (3-5 kDa) e (B) secreção de citocinas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solução/meio</td>
			<td colspan="2">Composição</td>
		</tr><tr><td>Solução estoque de colágeno</td>
			<td colspan="2">0,5 mg/mL de colágeno IV em ácido acético 0,5 mM</td>
		</tr><tr><td>Tampão de isolamento</td>
			<td colspan="2">PBS -/-, 1 mg/ml de soro bovino albumina fração V, 2 mM de EDTA</td>
		</tr><tr><td>Meio de diferenciação de monócitos</td>
			<td colspan="2">Meio de células hematopoiéticas + 10% de soro autólogo humano + 10 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos recombinantes (M-CSF) + 10 ng/mL de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos recombinantes (GM-CSF)</td>
		</tr><tr><td>Reagente de dissociação de tripsina</td>
			<td colspan="2">0,25% de tripsina + 1 mM de EDTA em PBS -/-</td>
		</tr><tr><td>Reagente de descolamento de monócitos</td>
			<td colspan="2">4 mg/mL de lidocaína + 5 mM de EDTA em PBS -/-</td>
		</tr><tr><td>Meio condicionado CE</td>
			<td colspan="2">Meio EC-+10% soro autólogo humano +10 ng/mL M-CSF + 10 ng/mL GM-CSF</td>
		</tr><tr><td>C2-médio</td>
			<td colspan="2">DMEM glicose alta (4,5 g/L) + 10% FBS + 1% GlutaMax + 1% MEM solução de aminoácidos não essenciais + 1 mM de piruvato de sódio + 10 μg/mL de holotransferrina humana</td>
		</tr><tr><td>Solução-mãe de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano</td>
			<td colspan="2">1 mg/ml em meio C2 pré-aquecido sem vermelho de fenol</td>
		</tr><tr><td>Solução de bloqueio e permeabilização</td>
			<td colspan="2">3% de soro normal de burro (NDS) + 0,1% de saponina em PBS +/+</td>
		</tr><tr><td>Solução de coloração</td>
			<td colspan="2">0,3% de soro de burro normal (NDS) + 0,1% de saponina em PBS +/+</td>
		</tr><tr><td>Solução de lavagem</td>
			<td colspan="2">0,1% de saponina em PBS +/+</td>
		</tr><tr><td>Fixador de Carnoy</td>
			<td colspan="2">60% de etanol, 30% de clorofórmio, 10% de ácido acético glacial</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Lista e composição das soluções utilizadas neste protocolo. Abreviatura: PBS -/- = solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem magnésio e cálcio.

Nosso protocolo detalhado descreve a criação e o uso do modelo avançado de intestino em chip, que simula a mucosa intestinal humana com estruturas 3D e vários tipos de células, permitindo uma análise aprofundada das respostas imunes e funções celulares em resposta à colonização microbiana.

Modelo Intestino em Chip Imunocompetente para Análise das Respostas Imunes da Mucosa Intestinal

An advanced intestine-on-chip model recreating epithelial 3D organotypic villus-like and crypt-like structures has been developed. The immunocompetent ...

Nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento e uso de plataformas imunocompetentes de órgãos em chip. Ao criar esses modelos in vitro humanizados e fisiologicamente relevantes, podemos estudar a complexa interação patógeno-hospedeiro. O conhecimento que criamos pode ser usado para manipular e identificar alvos moleculares para a terapia de doenças infecciosas.Um dos principais desafios é manter uma microbiota viva sob condições homeostáticas ao lado do tecido hospedeiro in vitro. Isso inclui replicar a topografia 3D organotípica de estruturas de criptas e vilosidades e sua colonização microbiana. As plataformas de intestino em chip abordam isso usando o fluxo para moldar as estruturas organotípicas e evitar o crescimento excessivo de bactérias.Isso garante condições de cultura estáveis. Em comparação com outras plataformas de intestino em chip disponíveis, nosso modelo permite o estudo detalhado da resposta imune humana a patógenos devido à inclusão de células imunes residentes no tecido primário. Além disso, o tamanho do modelo permite várias leituras em um único experimento, reduzindo o custo geral e o número de experimentos.Nosso laboratório está se concentrando no uso de células-tronco pluripotentes induzidas para desenvolver sistemas autólogos que permitem a medicina personalizada.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descreve-se um protocolo in vitro de co-cultura intestino microbiota e vilosidades intestinais por um período prolongado utilizando um sistema microphysiological intestino humano-on-a-chip.

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

neuroHuMiX é um modelo avançado de gut-on-a-chip para estudar as interações de células bacterianas, epiteliais e neuronais sob condições de co-cultura proximal e representativa. Este modelo permite desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à comunicação entre o microbioma intestinal e o sistema nervoso.

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Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

A integração de organoides intestinais caninos e um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip oferece modelos translacionais relevantes para doenças intestinais humanas. Os protocolos apresentados permitem a morfogênese 3D e a modelagem dinâmica in vitro do intestino, auxiliando no desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças intestinais em cães e humanos com o One Health.

Morfogênese Tridimensional em Intestino Canino Utilizando Organoides Intestinais Derivados de Pacientes com Doença Inflamatória Intestinal

Os modelos de pulmão em chip superam as culturas 2D tradicionais, imitando a interface ar-líquido e a perfusão de células endoteliais, simulando o fluxo sanguíneo e a troca de nutrientes cruciais para estudos de fisiologia pulmonar. Isso aumenta a relevância da pesquisa pulmonar, oferecendo um ambiente dinâmico e fisiologicamente preciso para avançar na compreensão e no tratamento de infecções respiratórias.

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Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Listeria monocytogenes é um organismo modelo para estudar as respostas imunológicas e suscetibilidade genética para as bactérias intracelulares em camundongos. Este método permite que sejam medidos carga bacteriana e gerar uma única célula suspensões de fígado e do baço de ratos para análise FACS para determinar mudanças em células do sistema imunológico devido à infecção por Listeria.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

O vírus sincicial respiratório humano (HRSV) pode causar bronquiolite grave em lactentes pequenos. Parte da patogênese da doença grave por HRSV é causada pela resposta imune do hospedeiro. A estimulação de células imunes humanas primárias com HRSV fornece um sistema modelo rápido e reprodutível para estudar a ativação de vias inflamatórias e infecções.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

A coinfecção humana é difícil de replicar in vitro. No entanto, os parasitas da malária humana podem ser facilmente cultivados in vitro, assim como as células mononucleares do sangue periférico humano recém-isoladas naturalmente infectadas com o HIV. Isso fornece um excelente modelo para estudar as respostas imunes precoces aos parasitas da malária no contexto da coinfecção pelo HIV.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Aprenda a criar modelos intestino-em-chip imunocompetentes usando células primárias e fluxo microfluídico. Esta plataforma permite analisar respostas imunes à colonização microbiana e identificar alvos terapêuticos para doenças infecciosas.

Modelo Intestino em Chip Imunocompetente para Análise das Respostas Imunes da Mucosa Intestinal

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