Name: Cultivo de esferóides de câncer de pâncreas tridimensionais desmoplásicos de co-cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Aprenda a criar esferoides desmoplásicos tridimensionais de co-cultura para pesquisa de câncer de pâncreas. Este método reproduz o ambiente tumoral clínico e permite triagem de terapêuticas.

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1. Cultura de células 2D
<ol><li>Cultive células PANC-1 no meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em condições estéreis. Cresça até 70%-80% de confluência antes das passagens e não use além da20ª passagem. Consulte o processo descrito na etapa 4.2.1. NOTA: Como ponto de referência, 1 x 106 células em 20 mL de meio precisam de cerca de 2-3 dias para atingir 70-80% de confluência.</li>
	<li>Cultive células HPaSteC em meio de células estreladas suplementadas com 2% de FBS, 1% de PenStrep e 1% de Suplemento de Crescimento de Células Estreladas (SteCGS) usando o kit fornecido pelo fabricante em condições estéreis. Crescer de acordo com as instruções do fabricante (com algumas modificações), conforme indicado no passo 4.2.2, num balão revestido com Poli-L-lisina.<ol><li>Ignore a etapa de neutralização do FBS durante a tripsinização do protocolo do fabricante, pois a solução de neutralização de tripsina (TNS) é usada. Neutralize a suspensão celular com um volume total de 10 ml de TNS, conforme descrito no passo 4.2.2.2. NOTA: Como ponto de referência, 0,5 x 106 células e 1 x 106 células em 20 mL de meio precisam de 3 dias e 2 dias, respectivamente, para atingir 90% de confluência.</li>
		<li>Colha células com 90% de confluência. Não use células além da Passagem 7.</li>
	</ol></li>
	<li>Manter as células a 37 °C, com 5% de CO2, em incubadoras estéreis com umidade relativa de 90%-95%. Efectuar todos os estudos de cultura celular num balão T-75.</li>
</ol>2. Revestimento de solução de poli (2 -hidroxietil metacrilato (poli-HEMA) para placa de 96 poços
<ol><li>Prepare a solução de poli-HEMA a 5 mg / mL usando etanol a 95%, permitindo que seja misturada durante a noite usando um agitador aquecido a 37 ° C. (por exemplo, 500 mL de solução precisam de 2,5 g de poli-HEMA)<ol><li>Marque o local do volume inicial antes de adicionar o agitador. Use etanol a 95% para compensar qualquer perda na solução no dia seguinte.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrar a solução final numa coifa estéril utilizando um filtro de 0,22 μm e conservá-la no frigorífico a 4 °C. NOTA: Poly-HEMA é usado para aumentar a hidrofobicidade de uma superfície, o que serve como um impedimento para as células se ligarem. Como este estudo exige que as células não se liguem aos poços e cresçam como uma monocamada, o poli-HEMA é usado como um impedimento adicional para o recurso natural de baixa fixação das placas, tornando-as placas de fixação ultrabaixas.</li>
	<li>Adicione 50 μL da solução fria a cada poço de uma placa redonda de micropoços de fundo de poliestireno de 96 poços dentro de uma capa de cultura de células para revestir a placa.</li>
	<li>Deixe os poços com a tampa colocada em um forno de ar quente a 37 ° C por 3 dias para garantir que as placas estejam completamente secas.</li>
	<li>Esterilize as placas por UV por 30 min na capa de cultura de células antes da semeadura celular. Armazene em um zip lock bem fechado para armazenamento de longo prazo e esterilize antes de usar.</li>
</ol>3. Planejamento de cultura de células 2D
<ol><li>Cronometre o experimento para que as células PANC-1 estejam disponíveis em 70% -80% de confluência no mesmo dia em que as células HPaSteC atingem 90%. NOTA: Frascos contendo cerca de 1 milhão de células de PANC-1 ou HPaSteC, quando levantados a partir de nitrogênio líquido no mesmo dia, com alguma variação, requerem 8 dias de cultura de PANC-1 e 6-7 dias de cultura de HPaSteC para ter ambas as linhas celulares prontas no mesmo dia.</li>
</ol>4. 3D crescimento da cultura
<ol><li>Consulte a visão geral de todo o processo na Figura 1 antes de iniciar o processo. CUIDADO: Tanto o PANC-1 quanto o HPaSteC são de origem biológica. Manuseie PANC-1 (linha de células cancerígenas) com cuidado.</li>
	<li>Tripsinização e contagem de células<ol><li>Tripsinzes e conte as células PANC-1:<ol><li>Descarte o sobrenadante e lave as células PANC-1 com 9 mL de HBSS (3 mL de cada vez). Descarte os reagentes usados no exaustor em uma solução de alvejante a 20-25% V/V para garantir a morte completa do material vivo/viável.</li>
			<li>Tripsinize as células com 2 mL de tripsina. Após quase 10 min (pode precisar de mais tempo), quando todas as células estiverem descoladas, neutralize a suspensão com 10 mL de DMEM + 10% de FBS. Comece com 3 mL e siga com as etapas de lavagem subsequentes usando 1 mL por lavagem (7 lavagens restantes) para garantir a coleta máxima de células tripsinizadas.</li>
			<li>Agrupe cada alíquota neutralizada no mesmo tubo de 15 mL. O volume final no tubo será próximo a 12 mL (~2 mL de tripsina que foi neutralizada com 10 mL de meio).</li>
			<li>Centrifugue a suspensão de células neutralizadas a 700 x g por 2 min e 30 s. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento obtido em 1 ml de DMEM +10% FBS. Pegue uma alíquota para contagem de células e rotule o valor obtido nesta seção como "Contagem A".</li>
		</ol></li>
		<li>Tripsinze e conte células HPaSteC.<ol><li>Descarte o sobrenadante e lave as células HPaSteC com 9 mL de HBSS (3 mL de cada vez).</li>
			<li>Tripsinize as células com 2 mL de tripsina. Após quase 10 min, quando todas as células estiverem descoladas, neutralizar a suspensão com 10 mL de solução de neutralização de tripsina. Comece com 3 mL e siga com as etapas de lavagem subsequentes usando 1 mL por lavagem (7 lavagens restantes) para garantir a coleta máxima de células tripsinizadas.</li>
			<li>Agrupe cada alíquota neutralizada no mesmo tubo de 15 mL. O volume final no tubo será próximo a 12 mL (~2 mL de tripsina que foi neutralizada com 10 mL de solução neutralizante).</li>
			<li>Centrifugue a suspensão de células neutralizadas a 700 x g por 2 min e 30 s. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento obtido em 1 ml do meio de células estreladas suplementado. Pegue uma alíquota para contagem de células e rotule o valor obtido nesta seção como "Contagem B".</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Diluição das suspensões celulares iniciais<ol><li>Faça uma pausa nesta etapa, se necessário (não mais de 0,5 h) por um curto período de tempo após obter as contagens A e B ou após tripsinizar e neutralizar PANC-1 e HPaSteC. Manter os meios de cultura não utilizados a 37 °C e as suspensões celulares à temperatura ambiente (RT; 25 ± 2 °C).</li>
		<li>Use a Contagem A e a Contagem B obtidas anteriormente, para tirar alíquotas e fazer as respectivas diluições (em tubos separados) de modo que o volume final seja de 1 mL (diluente: DMEM + 10% FBS para ambos os frascos) e a contagem final esteja entre 110.000-140.000 células para cada tipo de célula. Uma vez feita essa diluição, verifique a contagem de células para cada diluição para dar Contagem C (PANC-1) e Contagem D (HPaSteC).</li>
		<li>Faça uma pausa nesta etapa, se necessário (não mais de 15-30 min) após obter a Contagem C e a Contagem D. Não parar depois de efectuadas as diluições finais no passo 4.3.3.2; experimento para evitar a sedimentação celular. Manter os meios de cultura não utilizados a 37 °C e as suspensões celulares a RT (25 ± 2 °C).<ol><li>Manter o número final de células necessárias por poço no HPaSteC: PANC-1: 60:120. Use 110 poços para o cálculo para contabilizar o excesso. Calcule com um valor base de 100 μL de suspensão de células por poço (o volume total da suspensão é de 11 mL para 110 poços com HPaSteC: PANC-1: 60:120). Faça esta suspensão em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL para facilitar a mistura.</li>
			<li>Use a Contagem C e a Contagem D e coloque suspensão celular suficiente em uma solução DMEM + FBS a 10% para ter HPaSteC: PANC-1: 60:120 em um volume final de 11 mL (6.600 células HPaSteC e 13.200 células PANC-1 em 11 mL). Misture bem a solução usando uma pipeta de 1 mL, agitando e pipetando para cima e para baixo. Evite a formação de espuma.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Semeadura<ol><li>Use uma pipeta de 200 μL ou 100 μL para misturar a suspensão final (mexa movendo a ponta da pipeta combinada com a pipetagem para cima e para baixo) em cada etapa antes de adicionar 100 μL da suspensão por poço. Adicione os 100 μL suavemente ao longo do canto do poço.<ol><li>Reutilize a mesma ponta para vários poços, a menos que ela caia. Misture para frente e para trás e conte até 10 ou 15 (não segundos) entre as adições a cada poço para a primeira metade (aproximadamente os primeiros 43 poços) da placa. Reduza a contagem de mistura para 5-10 entre cada poço para a segunda metade (43 poços restantes), pois o volume da suspensão é menor e requer menos duração da mistura.</li>
			<li>Não use um pipetador de repetição, pois o revestimento poli-HEMA hidrofóbico fará com que a suspensão salte da placa, levando a uma distribuição desigual.</li>
		</ol></li>
		<li>Descarte qualquer excesso de suspensão depois que todos os poços estiverem cheios.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugação<ol><li>Centrifugue a placa final contendo a suspensão celular para reunir todas as células como um pellet. Enrole cuidadosamente a placa com parafilme ao redor da borda da placa para evitar contaminação durante esta etapa. Após o embrulho, centrifugue a placa com um contrapeso a 1000 x g por 2 min.</li>
		<li>Leve a placa de volta para a coifa de cultura de células (use luvas pulverizadas com etanol para manusear), remova o parafilme e armazene as placas na incubadora a 37 ° C, com 5% de CO2. Não borrife a placa com mistura de etanol e água em nenhum momento.</li>
	</ol></li>
	<li>Manutenção da cultura<ol><li>Veja as células se unindo para formar esferoides sob um microscópio de luz com ampliação de 4x-5x no dia 3. Siga o protocolo de manutenção da cultura conforme descrito abaixo.<ol><li>No dia 3, meça 5-6 mL de DMEM + 10% de FBS e adicione 50 μL a cada poço ao longo da lateral do poço.<ol><li>Não misture ou agite o meio de forma alguma durante a adição, pois isso danificará o esferóide ou levará à remoção acidental do esferoide. O volume final por poço será de ~ 150 μL.</li>
			</ol></li>
			<li>Além do dia 3, consulte a Figura 2 para se familiarizar com a estrutura do poço e a localização do reflexo da luz (entre a porção cilíndrica e curva do poço) visto na mídia chamada de halo. Execute operações próximas ao halo com cuidado para garantir que os esferoides permaneçam intactos.</li>
			<li>No dia 6, meça 10-11 mL de DMEM + 10% FBS. Use uma pipeta de 1 mL para retirar a mídia a granel de vários poços, retirando a mídia até o halo. Faça isso para toda a placa, seguido pela substituição da mídia. Colete o sobrenadante a granel e descarte-o ou descarte-o à medida que for retirado.</li>
			<li>Substitua o meio descartado por um novo meio adicionando 100 μL de meio ao longo da lateral de cada poço. O volume final no poço será próximo a 200 μL.<ol><li>Não puxe a mídia além do halo, pois isso aumenta o risco de puxar acidentalmente o esferoide.</li>
			</ol></li>
			<li>No dia 10/11, meça 10-11 mL de DMEM + 10% de FBS. Use uma pipeta de 1 mL para retirar a mídia a granel de vários poços, retirando a mídia até o halo. Faça isso para toda a placa, seguido pela substituição da mídia. Colete o sobrenadante a granel e descarte-o ou descarte-o à medida que for retirado.</li>
			<li>Substitua o meio descartado por um novo meio adicionando 100 μL de meio ao longo da lateral de cada poço. O volume final no poço será próximo a 200 μL.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação do último dia<ol><li>Realize o tratamento medicamentoso nos esferoides no dia 14. Visualize os esferoides antes do uso usando um microscópio invertido de campo claro sob uma objetiva de 4x para determinar o volume inicial do esferoide. Calcule o Volume (V) usando a seguinte fórmula: V = 0,5 × L × W2</li>
		<li>Siga a equação para calcular os volumes esferóides descritos acima. Aqui L é o comprimento do eixo maior e W é a largura (linha mais longa perpendicular ao eixo maior). Converta todas as unidades originais de micrômetros para milímetros para obter um volume em milímetros cúbicos.</li>
		<li>O volume inicial em cada poço no dia 14 está entre 150-200 μL devido à evaporação. Para tratamentos medicamentosos, remova o meio até que o halo seja alcançado de cada poço e substitua-o por 100 μL da solução medicamentosa na força 2x, juntamente com uma mistura suave (misture o meio suavemente para frente e para trás enquanto conta até 2 entre cada poço).<ol><li>Use soluções de força 2x para permitir que a solução final do medicamento esteja em 1x e para evitar a remoção completa do meio antigo dos poços, caso contrário, os esferóides podem ser perturbados. Use os esferóides dentro de 3 dias a partir desse período.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Coleção de esferóides<ol><li>Meça os volumes esferóides antes da coleta, conforme descrito na etapa 4.7.2.</li>
		<li>Colete os esferoides no dia 14 ou 17, dependendo das necessidades do experimento, removendo o meio de cada poço até que o halo seja alcançado.</li>
		<li>Use uma pipeta de 1 mL para remover o meio e coletar o sobrenadante em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL de vários poços.</li>
		<li>Uma vez que todos os poços tenham meio no nível do halo, reduza a configuração na pipeta de 1 mL para entre 200-300 μL.</li>
		<li>Alinhe a placa contra o fundo do exaustor ou fundo escuro (por exemplo, um rack de tubo) para ver os esferóides assentados na parte inferior.</li>
		<li>Insira suavemente a ponta perto do esferóide (vá abaixo do halo) e pipete uma pequena quantidade de meio (por exemplo, uma estimativa visual de cerca de 50 μL) para frente e para trás para perturbar o esferoide. Não coloque a ponta diretamente sobre o esferóide, pois isso pode danificar sua estrutura.<ol><li>Não puxe toda a mídia para fora do poço nesta etapa. Controle o movimento do polegar firmemente no pistão da pipeta.</li>
		</ol></li>
		<li>Deslocar a mídia até que o esferóide não permaneça mais no centro e possa ser visto se movendo contra o fundo. Puxe mídia suficiente para sugar o esferóide e mova-o para o local desejado (por exemplo, agrupe-o com outros esferoides em um poço que faça parte do mesmo conjunto de tratamento).</li>
	</ol></li>
	<li>Eliminação de resíduos<ol><li>Descarte todas as amostras líquidas uma vez neutralizadas com alvejante de acordo com os protocolos do Departamento de Meio Ambiente e Segurança Sanitária dos respectivos laboratórios. Autoclave e descarte todas as pipetas e frascos usados com resíduos de risco biológico.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do processo de cultivo de esferóides de câncer de pâncreas desmoplásicos 3D (gerado usando BioRender). A figura fornece uma visão geral dos processos básicos envolvidos; ou seja, células tripsinzadoras, usando a contagem inicial de células para fazer suspensões celulares diluídas, preparando uma co-cultura usando as suspensões celulares diluídas, adicionando suspensões celulares a cada poço, incubando as culturas, realizando manutenção do meio e formação final de esferóides conforme esperado no dia 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig02.jpg"> Figura 2: Estrutura do poço de fundo em U. A imagem da direita é uma forma exagerada para demonstrar a porção "halo" do poço. A figura visa definir onde está a parte do "halo" do poço, pois trabalhar acima do halo é fundamental para o crescimento dos esferoides e evitar perdas acidentais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
5. Avaliação dos componentes da ECM e microscopia confocal
<ol><li>Utilizar imunomarcação para avaliar a resposta da MEC à terapia medicamentosa de acordo com o protocolo descrito por Durymanov et al.38.<ol><li>Agrupe os esferóides e lave duas vezes com 100 μL de PBS. Incorporar em meio de inclusão de tecido de temperatura de corte ideal (OCT), congelar e manter a -80 °C.</li>
		<li>Corte os blocos tumorais congelados em seções de 10 μm, fixe as seções na mistura de acetona-metanol (1: 1) por 15 min e deixe-as secar ao ar em RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Para determinar os componentes da MEC, imunocorar as criossecções com anticorpos primários monoclonais antifibronectina de coelho, anticorpos policlonais de colágeno tipo I de coelho, anticorpos antilaminina policlonal de coelho e anticorpos antiácido hialurônico policlonal de ovelha.</li>
	<li>Use IgG anticoelho de cabra marcado com Alexa Fluor 488 ou anti-ovelha de burro conjugado com Alexa Fluor 568 como anticorpos secundários. NOTA: Os anticorpos primários e secundários foram diluídos a 1:200 e 1:300, respectivamente.</li>
	<li>Adquira imagens de todas as seções esferóides usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com lente objetiva de 20x/0,45.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo 3D-PDAC Capturando Desmoplasia para Avaliação Terapêutica

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Microscópio invertido Axio Observer</td><td>Carl Zeiss</td><td>0450-354</td><td></td></tr><tr><td>Celômetro Auto T4</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Auto-T4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, pó, alta glicose</td><td>Gibco</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep conjugado com Alexa Fluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175712</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>SH3091003HI</td><td></td></tr><tr><td>IgG anticoelho de cabra rotulado com Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solução Salina Balanceada (HBSS)&nbsp;</td><td>Células Estreladas</td> Pancreáticas Humanas <td>Gibco 14175145</td><td></td></tr><tr><td>(HPaSteC)</td><td>Microscópio ScienCell</td><td>3830</td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ts 100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-Well Poliestireno Fundo Redondo Micropoços Placas Thermo</td><td>Scientific</td><td>12-565-331</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview FV1200 laser confocal</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Produto</td></tr> <tr>descontinuado<td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anti-laminina policlonal para coelhos&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab11575</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos de colágeno policlonal tipo I para coelhos&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anti-ácido hialurônico policlonal de ovelha</td><td>Abcam</td><td>ab53842</td><td></td></tr><tr><td>Kit completo de mídia celular estrelada&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>5301</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>153571</td><td>solução de tripsina preparada de acordo com o protocolo do fabricante e usada a 0,25% com e sem energia;</td></tr><tr><td>Solução de neutralização de tripsina (TNS)</td><td>ScienCell</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo de esferóides de câncer de pâncreas tridimensionais desmoplásicos de co-cultura

Growing Desmoplastic Three-Dimensional Pancreatic Cancer Spheroids from Co-Culture

Três das etapas mais críticas envolvidas no crescimento dos esferoides são a contagem inicial de células, as etapas de mistura durante a semeadura dos esferoides e a realização de alterações oportunas no meio para permitir que os esferoides cresçam (Figura 1). Além disso, estar familiarizado com a Figura 2 sobre mudanças de mídia após o dia 3 é fundamental para permitir mudanças de mídia eficazes devido ao aumento do volume de mídia por poço. Quando todas essas etapas são executadas de acordo com as instruções fornecidas, os esferóides (Figura 3) crescem até um volume médio de 0,048 ± 0,012 mm3 (451 μm x 462,84 μm) (Figura 4). Foram encontrados casos em que as células podem crescer melhor, levando a maiores volumes médios iniciais de 0,096 ± 0,014 mm3 (611 μm x 560 μm) no dia 14. Uma variedade de razões pode levar os esferoides a terem volumes iniciais maiores, como a manutenção da temperatura e umidade da incubadora ou o uso de passagens celulares anteriores, que têm uma vitalidade ligeiramente melhorada em comparação com as passagens posteriores.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig03.jpg"> Figura 3: Um esferóide representativo visto no dia 14 (tamanho: 451,59 μm x 462,84 μm). Barra de escala = 200 μm. Cada esferóide é medido ao longo de seu eixo mais longo e mais curto, respectivamente, e usou a equação descrita na seção de métodos para calcular o volume. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig04.jpg"> Figura 4: Progresso do crescimento do esferóide ao longo de 17 dias. As placas 1 e 2 são réplicas. As barras de erro representam o desvio padrão. A figura pode ser usada como uma estimativa aproximada dos volumes esferóides que podem ser vistos nos dias 6, 10, 14 e 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
No entanto, nos casos em que as células não são contadas corretamente ou a suspensão celular não é completamente misturada, ou a cultura final não é mantida regularmente, ou ocorre uma combinação desses erros, isso pode levar ao desenvolvimento de esferóides menores ou esferóides crescidos de forma incompleta. Esferoides com aparências semelhantes também foram observados quando os estudos iniciais de otimização apenas suplementaram o meio em poços ao redor da periferia da placa no Dia 3, em vez de toda a placa (Figura 5). Alternativamente, nos casos em que as células não estão bem misturadas, ou erros iniciais de contagem / diluição levam à semeadura de mais células por poço do que a recomendação, vários esferóides podem ser vistos por poço. Um achado semelhante foi observado quando as células PANC-1:HPaSteC foram usadas na proporção de 240:120 (Figura 6). Isso também pode ser visto ocasionalmente quando os esferoides são cultivados por direção, mas esses esferoides são em menor número (por exemplo, 4/96 poços podem conter dois esferoides por poço em vez de um). Nos casos em que vários esferoides são encontrados, evite usar os poços com vários esferoides ou faça anotações de mudanças nos volumes quando esses esferoides estiverem sendo tratados. Alterações inadequadas de meio onde a ponta da pipeta mergulha abaixo do halo (Figura 1) também podem levar à perda acidental dos esferoides.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig05.jpg"> Figura 5: Uma imagem representativa de um esferóide mal crescido no dia 14. Barra de escala = 200 μm. Aqui, as células não se agregaram bem, por isso torna-se difícil medir o comprimento e a largura do esferóide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig06.jpg"> Figura 6: Uma imagem representativa de um poço contendo dois esferóides mal crescidos, como visto no dia 14. Barra de escala = 200 μm. Aqui, um dos esferóides tem um tamanho de 246,61 μm x 178,31 μm e o outro 289,13 μm x 252,35 μm. Este é um exemplo em que provavelmente há um problema com as diluições iniciais ou com a qualidade das células que foram usadas para iniciar o experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os esferoides também desenvolvem uma MEC com quatro dos componentes primários da MEC: colágeno-I, laminina, ácido hialurônico e fibronectina. Em estudos que o laboratório publicou anteriormente, a vantagem da co-cultura sobre o PANC-1 sozinho foi demonstrada em termos de esferóides homo PANC-1 exibindo colágeno difuso, sem fibronectina e menor deposição de ácido hialurônico.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig07.jpg"> Figura 7: Imagem representativa dos quatro componentes primários da MEC, conforme visto no dia 17 em esferoides não tratados: colágeno I, laminina, ácido hialurônico e fibronectina. Essas imagens são obtidas após imunomarcação criosseccional do esferoide. O brilho dessas imagens foi aumentado uniformemente para ajudar a destacar as diferenças na aparência. As áreas onde o tecido está danificado ou ausente devem ser ajustadas enquanto as medições de intensidade estão sendo realizadas. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Cultivo de esferóides de câncer de pâncreas tridimensionais desmoplásicos de co-cultura

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest cancers with a 5-year survival rate of &#60;12%. The biggest barrier to therapy is the ...

growing-desmoplastic-three-dimensional-pancreatic-cancer-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um método simples é descrita para analisar os efeitos da fibroblastos de tecido em associadas células epiteliais. A combinação deste método eo tridimensional de cultura de tecido pode facilitar a análise das células após o isolamento a partir de 3D. A técnica é aplicável a células de diferentes potencial maligno, permitindo estudo sistemático dos efeitos de estroma associado ao tumor em células tumorais.

Isolamento de células epiteliais mamárias de tridimensional Mixed-célula esferoidal co-cultura

Este vídeo explica a bioimpressão magnética 3D de células cancerígenas pancreáticas e fibroblastos co-cultivados. As células cancerígenas pancreáticas e as células de fibroblastos pancreáticos ativadas são co-cultivadas e magnetizadas usando um conjunto de nanopartículas biocompatível, para gerar esferoides, sob a influência de forças magnéticas.

Co-culturas de esferóides 3D magneticamente bioimpressas: um método para co-cultura de células cancerígenas e fibroblastos

Este vídeo demonstra um método para estabelecer uma co-cultura tridimensional de esferóides tumorais e células T. Um molde de agarose com micropoços contendo esferóides tumorais é preparado, seguido pela adição de células T. Após a incubação, essa configuração permite estudar a interação das células T com os esferoides tumorais em um ambiente tridimensional controlado.

Um modelo tridimensional de co-cultura de células T infiltrantes em esferoides tumorais

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Aqui, um método é descrito para a preparação de co-cultura 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos, seguidos por medição das funções metabólicas, usando um analisador de fluxo extracelular.

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.

Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

Modelos in vitro abrangentes que recapitulem fielmente a doença humana relevante estão em falta. O presente estudo apresenta a criação e cultura de spheróides tumorais tridimensionais (3D), uma ferramenta in vitro confiável para estudar a interação tumor-estrommal no carcinoma hepatocelular humano.

Um modelo esferoide tridimensional para investigar a interação tumoral-estroma em carcinoma hepatocelular

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Este estudo apresenta uma metodologia econômica e eficiente para gerar estruturas celulares 3D usando um sistema baseado em carimbos para criar micropoços em moldes de agarose. O sistema promove a formação de esferóides/organoides uniformes, melhorando assim as interações celulares. Essa abordagem reduz a variabilidade experimental e oferece suporte a aplicações em testes de medicamentos e engenharia de tecidos.

Geração de esferoides/organoides tridimensionais a partir de culturas de células bidimensionais usando um novo dispositivo de carimbo

Aprenda a criar esferoides desmoplásicos tridimensionais de co-cultura para pesquisa de câncer de pâncreas. Este método reproduz o ambiente tumoral clínico e permite triagem de terapêuticas.

Cultivo de esferóides de câncer de pâncreas tridimensionais desmoplásicos de co-cultura

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