Name: Construção de redes metabólicas fora de equilíbrio em vesículas nanométricas e micrométricas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprenda a construir células sintéticas através da reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas em vesículas lipídicas. Este método integra redes metabólicas fora de equilíbrio para aplicações em biologia sintética.

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Os autores agradecem a Aditya Iyer pela clonagem do gene pBAD-PercevalHR e a Gea Schuurman-Wolters por ajudar na produção e purificação de proteínas. A pesquisa foi financiada pelo programa NWO Gravitation "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).

Protocolo de encapsulamento de vesículas lipídicas para redes complexas de proteínas

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</ol>

Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

Apresentamos um protocolo para a síntese de proteínas (de membrana) contendo vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico (proteoLUVs) e a conversão de proteoLUVs em vesículas unilamelares gigantes (proteoGUVs). O protocolo deve ser aplicável para a reconstituição de outras proteínas de membrana 13,19,30,40 e o encapsulamento de redes metabólicas diferentes das vias de degradação da L-arginina e síntese de glicerol 3-fosfato aqui apresentadas.
A reconstituição de proteínas de membrana em lipossomas geralmente produz uma orientação aleatória das proteínas dentro da membrana lipídica. Para ArcD e Glpt, a orientação não importa, porque as proteínas operam bidirecionalmente e os solutos se movem dependendo do sinal do potencial eletroquímico total. Para proteínas que funcionam em uma direção, metade das moléculas não estará disponível para atividade quando sua orientação for 50/50.
A extrusão de vesículas através de um filtro de policarbonato estreita a distribuição de tamanho, e as vesículas se tornam mais homogêneas quanto menor o tamanho dos poros dos filtros. No entanto, vesículas menores têm o preço de ter um volume menor e, portanto, um número muito pequeno de proteínas (enzimas, proteínas de membrana) por vesícula. Para minimizar a fração de LUVs com um ou mais componentes ausentes, a concentração das proteínas pode ser ajustada conforme mostrado na Figura 3A, B, mas com vesículas muito pequenas, os efeitos estocásticos são inevitáveis.
O método de inchaço assistido por gel baseia-se na deposição de vesículas sonicadas (SUVs) em uma superfície seca de agarose. Durante o processo de secagem, forma-se um gradiente de concentração de vesículas e a concentração de lipídios é mais alta na periferia da mancha. Isso se deve a um fenômeno conhecido como efeito da mancha de café 41,42. Como resultado, apenas uma pequena região dentro da mancha contém uma concentração de lipídios adequada para a formação de GUV. Manchas lipídicas circulares desiguais e concentradas resultam em grandes áreas não utilizadas que não estão disponíveis para a fusão de vesículas; portanto, a eficiência da formação de GUV torna-se baixa nesta abordagem. Para aumentar o rendimento de GUVs, deve-se buscar uma deposição lipídica uniforme, que pode ser realizada por spin coating42 ou alavancando o efeito de coloração de café41.
Outras notas sobre o protocolo:
Deve-se tomar cuidado para que várias proteínas de membrana (>10) sejam reconstituídas em média por vesícula para evitar efeitos estocásticos. Assim, evite proporções lipídio-proteína superiores a 400:1 p/p. Uma orientação aleatória é assumida para a maioria das proteínas.
Idealmente, o volume total de proteínas de membrana é o menor possível e, de qualquer forma, não excede 10-20% do volume do lipossomo. A adição de volumes maiores introduzirá mais detergente e a maioria dos lipossomas pré-formados pode lisar, o que pode ter um efeito negativo na eficiência da reconstituição.
O pré-equilíbrio da extrusora com a solução apropriada é importante para evitar a diluição dos componentes durante o encapsulamento. Idealmente, a solução de pré-equilíbrio também deve conter as enzimas solúveis, mas incluir enzimas pode ser muito caro devido ao volume relativamente grande necessário para o pré-equilíbrio da extrusora. Portanto, normalmente omitimos esses componentes e aceitamos uma diluição de 5% das enzimas.
Devem ser adicionados ionóforos às misturas que contêm proteolipossomas, uma vez que as moléculas são altamente hidrofóbicas e podem adsorver-se nas superfícies se não estiverem presentes vesículas. Deve-se tomar cuidado para que o volume de solvente adicionado seja baixo (<1% do volume total da reação). Os controles são feitos para verificar se os solventes não afetam as redes metabólicas nas vesículas. Concentrações de ionóforo de cerca de 1 μM são geralmente seguras para concentrações lipídicas totais de ~ 3 mg / mL.
Deve-se tomar cuidado para secar bem as gotículas. Se as gotículas não estiverem secas o suficiente, a formação de GUV é menos eficiente, pois os lipídios formarão agregados lipídicos e os MLVs podem se formar quando a solução de inchaço é adicionada.
A glicose é usada para combinar a osmolaridade do meio externo com o interno; este último contém sacarose em vez de glicose para aumentar a densidade das vesículas e, assim, facilitar a sedimentação dos GUVs. Além disso, a glicose no ambiente externo aumenta o contraste de fase, tornando a vesícula mais facilmente visível.
Os efeitos estocásticos são muito menos problemáticos com os GUVs; Mas aqui, a relação superfície-volume pode se tornar inaceitavelmente baixa, de modo que o número de proteínas de membrana (por exemplo, transportadores) se torna limitante para a rede metabólica interna. O método descrito neste protocolo não permite um controle preciso sobre o tamanho dos proteoGUVs, mas a maioria se enquadra na faixa de tamanho de 5-50 μm.
Em conclusão, o trabalho aqui apresentado fornece uma visão abrangente da reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento enzimático em vesículas lipídicas de tamanhos variados. Demonstramos a construção de vesículas funcionais para a síntese de ATP e blocos de construção a partir de precursores simples, como aminoácidos e glicerol. A reconstituição de proteínas de membrana em GUVs continua sendo um desafio, mas os protocolos aqui apresentados abrem caminho para novos desenvolvimentos na pesquisa de biologia sintética de baixo para cima.

O campo da biologia sintética de baixo para cima concentra-se na construção de células (mínimas) 1,2 e biorreatores metabólicos para fins biotecnológicos 3,4 ou biomédicos 5,6,7,8. A construção de células sintéticas fornece uma plataforma única que permite aos pesquisadores estudar proteínas (de membrana) em condições bem definidas, imitando as de ambientes nativos, permitindo a descoberta de propriedades emergentes e funções bioquímicas ocultas de proteínas e redes de reação9. Como um passo intermediário em direção a uma célula sintética que funciona de forma autônoma, são desenvolvidos módulos que capturam características essenciais das células vivas, como conservação de energia metabólica, síntese de proteínas e lipídios e homeostase. Esses módulos não apenas aprimoram nossa compreensão da vida, mas também têm aplicações potenciais nos campos da medicina8 e da biotecnologia10.
As proteínas transmembranares estão no centro de praticamente qualquer rede metabólica, pois transportam moléculas para dentro ou para fora da célula, sinalizam e respondem à qualidade do ambiente e desempenham vários papéis biossintéticos. Assim, a engenharia de módulos metabólicos em células sintéticas requer, na maioria dos casos, a reconstituição de proteínas integrais e/ou periféricas da membrana em uma bicamada de membrana composta por lipídios específicos e de alta integridade (baixa permeabilidade). O manuseio dessas proteínas de membrana é desafiador e requer conhecimentos específicos e habilidades experimentais.
Vários métodos foram desenvolvidos para reconstituir proteínas de membrana dentro de vesículas fosfolipídicas, na maioria das vezes com o objetivo de estudar a função11,12, regulação13, propriedades cinéticas14,15, dependência lipídica15,16 e/ou estabilidade17 de uma proteína específica. Esses métodos envolvem a rápida diluição da proteína solubilizada em detergente em meio aquoso na presença de lipídios18, a remoção de detergentes pela incubação de proteínas solubilizadas em detergente com vesículas lipídicas desestabilizadas por detergente e a absorção do(s) detergente(s) em esferas de poliestireno19, ou a remoção de detergentes por diálise ou cromatografia de exclusão de tamanho20. Solventes orgânicos têm sido usados para formar vesículas lipídicas, por exemplo, através da formação de interfases óleo-água21, mas a maioria das proteínas integrais da membrana são inativadas quando expostas a esses solventes.
Em nosso laboratório, reconstituímos principalmente proteínas de membrana pelo método de absorção de detergente para formar grandes vesículas unilamelares (LUVs) 19 . Esse método permite a co-reconstituição de múltiplas proteínas de membrana e a encapsulação no lúmen da vesícula de enzimas, metabólitos e sondas22,23. As LUVs contendo proteínas de membrana podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) com/sem encapsulamento de componentes solúveis em água, usando eletroformação24 ou inchaço assistido por gel25 e condições específicas para preservar a integridade das proteínas de membrana26.
Este trabalho apresenta um protocolo para a reconstituição em LUVs de uma rede metabólica fora de equilíbrio que regenera ATP através da quebra de L-arginina em L-ornitina27. A formação de ATP está associada à produção de glicerol-3-fosfato (G3P), um importante bloco de construção para a síntese de fosfolipídios22,28. A via metabólica consiste em duas proteínas integrais da membrana, uma arginina/ornitina (ArcD) e um antiportador G3P/Pi (GlpT). Além disso, três enzimas solúveis (ArcA, ArcB, ArcC) são necessárias para a reciclagem de ATP, e GlpK é usado para converter glicerol em glicerol 3-fosfato, usando o ATP da quebra de L-arginina, consulte a Figura 1 para uma visão geral esquemática da via. Este protocolo representa um bom ponto de partida para a futura construção de redes de reação ainda mais complexas - para a síntese de lipídios ou proteínas ou a divisão de células. A composição lipídica das vesículas suporta a atividade de uma ampla variedade de proteínas integrais da membrana e foi otimizada para o transporte de diversas moléculas para dentro ou para fora das vesículas 27,29,30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> Figura 1: Visão geral da via de produção de ATP e síntese e excreção de glicerol 3-fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Em suma, proteínas de membrana purificadas (solubilizadas em dodecil-β-D-maltosídeo, DDM) são adicionadas a vesículas lipídicas pré-formadas que foram desestabilizadas com Triton X-100, o que permite a inserção das proteínas na membrana. As moléculas de detergente são subsequentemente (lentamente) removidas pela adição de esferas de poliestireno ativadas, resultando na formação de proteolipossomas bem selados. Os componentes solúveis podem então ser adicionados às vesículas e encapsulados por meio de ciclos de congelamento e descongelamento, que prendem as moléculas no processo de fusão da membrana. As vesículas obtidas são altamente heterogêneas e muitas são multilamelares. Eles são então extrudados através de um filtro de policarbonato com um tamanho de poro de 400, 200 ou 100 nm, o que produz vesículas de tamanho mais uniforme; Quanto menor o tamanho dos poros, mais homogêneas e unilamelares são as vesículas, mas ao preço de um volume interno menor. As proteínas não incorporadas e as pequenas moléculas são removidas da solução externa por cromatografia de exclusão por tamanho. Os proteoLUVs podem ser convertidos em vesículas de tamanho micrométrico por inchaço assistido por gel, e esses proteoGUVs são então coletados e presos em um chip microfluídico para caracterização e manipulação microscópica. A Figura 2 mostra uma visão geral esquemática do protocolo completo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> Figura 2: Visão geral do protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico (LUVs) e micrométrico (GUVs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os protocolos de reconstituição e encapsulamento funcionam bem e a funcionalidade das proteínas é mantida, mas os proteoLUVs e proteoGUVs são heterogêneos em tamanho. As abordagens microfluídicas31,32 permitem a formação de vesículas do tamanho de micrômetros que são mais homogêneas em tamanho, mas a reconstituição funcional das proteínas da membrana geralmente não é possível porque o solvente residual na bicamada inativa as proteínas. Os proteoLUVs variam em tamanho de 100 a 400 nm e, em baixas concentrações de enzimas, o encapsulamento pode levar a vesículas com vias metabólicas incompletas (efeitos estocásticos; ver Figura 3). Os LUVs são ideais para a construção de módulos metabólicos específicos, como mostrado aqui para a produção de ATP e blocos de construção como G3P. Tais proteoLUVs podem potencialmente ser encapsulados em GUVs e servir como compartimentos semelhantes a organelas para as vesículas hospedeiras.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> Figura 3: Número de moléculas por vesícula com diâmetro de 100, 200 ou 400 nm. (A) Quando as proteínas encapsuladas (enzimas, sondas) estão na faixa de 1-10 μM. (B) A reconstituição é feita em 1 a 1.000, 1 a 10.000 e 1 a 100.000 proteínas de membrana por lipídio (mol / mol). Assumimos que as moléculas são encapsuladas nas concentrações indicadas e incorporadas na membrana nessas proporções proteína-lipídio. Para algumas enzimas, vimos que elas se ligam às membranas, o que pode aumentar sua concentração aparente nas vesículas. Abreviatura: LPR = Proporção Lipídio-Proteína <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody>Filtro de corte <tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Unidades de</td><td>filtro centrífugo Sigma Aldrich Milipore Amicon Ultra&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose</td><td>Paramedium-D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sacarose</td><td>Formedium-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glycon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Ether</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Paramédio&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Extrusora</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro</td><td>Jasco</td><td>Spectrofluorômetro FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de fluxo por gravidade</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton 100 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton 1000 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador LCP portátil</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecnologia de ultrassom portátil Hielscher</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de tubo Falcon grande Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornitina</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM Microscópio Confocal de Varredura a Laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chip microfluídico</td><td>caseiro&nbsp;</td><td>DOI baseado em PDMS</td><td>: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro</td><td>Nanodrop Isogen Life Science</td><td>ND-1000 espectrofotômetro NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas para GUVs</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4'' 0,4 x 20 mm</td></tr><tr><td>Agulhas para microfluídica</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2'' 1,2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>Medidor</td> <td>de osmolalidadeGonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 ponto de congelamento básico osmômetro</td><td></td></tr><tr><td>Plasmacleaner</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de policarbonato</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor Track-Etch Membrane: 10417104</td><td>0.4 &micro; m</td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga de policarbonato</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Pyranine</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo (preto)</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 resina&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics & Materiais INC</td><td>Sonics vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S plus 0.2</td><td>0.2 &micro; m</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Espaçador de teflon</td><td>Caseiro&nbsp;</td><td>À base de teflon</td><td>45 x 26 x 1,5 ou 45 x 26 x 3 ou 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada UV</td><td>Spectroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS Espectrofotômetro</td><td>Jasco</td><td>V730</td><td></td></tr><tr><td>Valinomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de fluorescência de campo amplo</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Caseína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

construção de redes metabólicas fora de equilíbrio em vesículas nanométricas e micrométricas

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

Apresentamos um método para incorporar em vesículas redes complexas de proteínas, envolvendo proteínas integrais de membrana, enzimas e sensores baseados em fluorescência, usando componentes purificados. Este método é relevante para o projeto e construção de biorreatores e o estudo de redes complexas de reações metabólicas fora de equilíbrio. Começamos reconstituindo (múltiplas) proteínas de membrana em grandes vesículas unilamelares (LUVs) de acordo com um protocolo desenvolvido anteriormente. Em seguida, encapsulamos uma mistura de enzimas purificadas, metabólitos e sensores baseados em fluorescência (proteínas fluorescentes ou corantes) por meio de congelamento-descongelamento-extrusão e removemos componentes não incorporados por centrifugação e/ou cromatografia de exclusão de tamanho. O desempenho das redes metabólicas é medido em tempo real monitorando a relação ATP / ADP, concentração de metabólitos, pH interno ou outros parâmetros por leitura de fluorescência. Nossas vesículas contendo proteínas de membrana de 100-400 nm de diâmetro podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs), usando procedimentos existentes, mas otimizados. A abordagem permite a inclusão de componentes solúveis (enzimas, metabólitos, sensores) em vesículas de tamanho micrométrico, aumentando assim o volume dos biorreatores em ordens de magnitude. A rede metabólica contendo GUVs é aprisionada em dispositivos microfluídicos para análise por microscopia óptica.

A reconstituição de proteínas de membrana solubilizadas em lipossomas requer a desestabilização de vesículas pré-formadas. A adição de pequenas quantidades de Triton X-100 resulta inicialmente em um aumento da absorbância a 540 nm (A540) devido a um aumento no espalhamento da luz pelo inchaço das vesículas (Figura 4). O valor máximo de A540 é o ponto em que os lipossomas são saturados com detergente (Rsat), após o qual qualquer adição adicional de Triton X-100 resultará na solubilização parcial das vesículas. No R sol, os lipossomas são completamente solubilizados (Figura 4). Para a reconstituição de proteínas de membrana, normalmente usamos vesículas desestabilizadas a 60% além de Rsat (indicado pela seta).
A proteína de membrana reconstituída ArcD é usada para transportar L-arginina para dentro e L-ornitina para fora das vesículas e é usada em conjunto com as enzimas encapsuladas ArcA, ArcB e ArcC para reciclar ATP de ADP e fosfato inorgânico. GlpT é um antiportador de glicerol 3-fosfato / fosfato que, juntamente com GlpK, é necessário para a síntese (e excreção) de glicerol 3-fosfato a partir de glicerol mais ATP produzido pela quebra da L-arginina. A adição de 5 mM de L-arginina em t = 0 aos proteolipossomas resulta em um aumento acentuado na razão da fluorescência PercevalHR a 500 e 430 nm de excitação39, que reflete a relação ATP/ADP dentro das vesículas (Figura 5). Após a adição de glicerol, o ATP é usado para a síntese de glicerol 3-fosfato, o que resulta em uma redução da relação ATP/ADP28. A quebra da L-arginina também leva a mudanças de pH, que podem ser quantificadas usando piranina ou pHluorin27.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> Figura 5: Reciclagem de ATP pela via de degradação da L-arginina. LUVs a 2,7 mg de lipídios / mL são colocados em uma cubeta e a proporção de fluorescência a 500 nm e 430 nm é registrada. Adicionam-se 5 mM de L-arginina a t = 0. A razão F500 / F430 é uma medida da relação ATP / ADP dentro das vesículas. Abreviatura: LUVs = vesículas unilamelares grandes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os LUVs produtores de ATP também podem ser usados para formar GUVs. A reidratação de proteo-LUVs secos em um gel de agarose LGT resulta na formação de vesículas de tamanho micrométrico (Figura 6). A formação de proteo-GUVs dentro das manchas LUV secas depende muito da concentração local de lipídios e do grau de desidratação. Algumas áreas têm grandes manchas de GUVs, enquanto em outros lugares na mesma gotícula, nenhum ou poucos GUVs podem ser formados. A formação de GUVs via inchaço assistido por agarose LGT resulta em uma variedade de tamanhos de GUV, normalmente de alguns micrômetros a mais de 50 μm.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> Figura 6: Imagens DIC de proteoGUVs formadas por inchaço assistido por gel. Barra de escala = 25 μm. Abreviaturas: DIC = contraste de interferência diferencial; GUVs = vesículas unilammelares gigantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os GUVs são colhidos e presos em um dispositivo microfluídico baseado em PDMS passivado com β-caseína (Figura 7). O dispositivo é projetado de forma que muitas vesículas possam ser capturadas e analisadas em um único experimento, e o dispositivo é usado para controlar o ambiente externo (taxa de fluxo, composição do buffer, etc.) 34. Mesmo quando o rendimento de proteo-GUVs é baixo, o fluxo constante de GUVs através do chip microfluídico permite que muitas vesículas sejam coletadas. Uma vez que GUVs suficientes são capturados, o sistema é lavado com um tampão osmoticamente balanceado para remover componentes externos, como proteínas solúveis, pequenas moléculas e sondas fluorescentes. O tampão de lavagem é então substituído por uma solução de substrato de igual osmolalidade contendo 50 mM de KPi (pH 7,0), quantidades variáveis de glicose (para ajustar a osmolalidade) e substratos como 10 mM de L-arginina. Um experimento de série temporal é feito em várias armadilhas do chip microfluídico e as imagens são tiradas a cada 90 s (excitação de 405 nm e 488 nm quando PercevalHR é usado). Além disso, uma imagem de campo claro é tirada em cada ponto de tempo. A razão das intensidades de emissão após excitação a 488 e 405 nm é uma medida da razão ADP/ATP nas vesículas.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> Figura 7: Aprisionamento de vesículas com o chip microfluídico. (A) Aprisionamento das vesículas, acompanhado pela capacidade de controlar o ambiente externo e a taxa de fluxo. (B) ProteoGUVs presos em um dispositivo microfluídico e excitados com um laser de 405 nm (verde) e laser de 488 (vermelho). A emissão para ambos os canais é medida a &gt;500 nm. A imagem de campo claro permite a visualização das vesículas sem fluorescência. Barra de escala = 25 μm. Abreviatura: GUVs = vesículas unilamelares gigantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e outros componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico e micrométrico.

Construção de redes metabólicas fora de equilíbrio em vesículas nanométricas e micrométricas

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

Na Holanda, o consórcio BaSyC visa construir células sintéticas a partir de componentes moleculares. O consórcio BaSyC é composto por grupos de pesquisa que vão desde biologia molecular até química, física e ciências computacionais. O objetivo deste consórcio é criar um sistema auto-replicante capaz de crescimento autônomo para transmitir informações e dividir.E atualmente nos concentramos na construção de redes moleculares que são integradas a sistemas moleculares mais complexos. Desenvolvimentos recentes em biologia sintética incluem a engenharia de módulos para funções celulares, integrando-os em redes complexas para aplicações em diagnóstico, terapia, imunologia sintética e materiais adaptativos. Esse progresso abrange grupos na Europa, América e Ásia, avançando em abordagens de cima para baixo e de baixo para cima para a construção de células sintéticas.As tecnologias atuais em nosso campo incluem os métodos de engenharia e evolutivos para construir e otimizar redes metabólicas. Usamos IA para seleção molecular e técnicas bioquímicas e biofísicas avançadas para isolamento de componentes e formação de redes. Também empregamos reconstituição de membrana, encapsulamento físico e visualização por meio de espectroscopia fluorescente e microscopia.Com a integração de módulos, o número de proteínas e enzimas de membrana aumenta enormemente, o que impõe restrições às nossas tecnologias de reconstituição e encapsulamento. O encapsulamento estocástico torna-se um problema com vesículas de tamanho submicrométrico, e a eficiência da formação de vesículas de tamanho micrométrico diminui quando várias proteínas de membrana são reconstituídas na membrana lipídica. Em Groningen, desenvolvemos redes metabólicas para a produção de ATP e para a manutenção de um estado fora de equilíbrio por meio da alimentação de substrato e exportação de produtos.Além disso, vinculamos a reciclagem de ATP à síntese e excreção de precursores lipídicos, permitindo que vesículas secundárias produzam lipídios, o que é um avanço significativo em nosso campo.

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Descrevemos aqui métodos simples para a preparação de vesículas, o encapsulamento de transcrição e maquinaria de tradução, e o controlo da produção da proteína. Os sistemas isentos de células resultante pode ser utilizado como um ponto de partida para a construção de imitadores celulares cada vez mais complexas.

O encapsulamento de transcrição livre de células e Tradução Máquinas em vesículas para a Construção de Mimics celulares

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Muitas proteínas desempenham sua função quando ligadas às superfícies da membrana. A ligação de proteínas extrínsecas nas membranas dos nanodiscos pode ser indiretamente visualizada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que o empilhamento característico (rouleau) de nanodiscos induzido pela coloração negativa fosfotungstato de sódio é impedido pela ligação de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Muitas proteínas na célula sentem e induzem a curvatura da membrana. Nós descrevemos um método para puxar a membrana nanotubos de vesículas lipídicas para estudar a interação de proteínas ou qualquer molécula de curvatura-ativo com membranas curvo em vitro.

Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante

Com suporte sólido, isento de proteína, dobro fosfolipídeo BICAMADA membranas (DLBM) podem ser transformadas em redes de nanotubo de lipídios complexos e dinâmicos e podem servir como modelos 2D de baixo para cima do retículo endoplasmático.

Formação espontânea e rearranjo das redes de nanotubo lipídica Artificial como um modelo de baixo para cima para o retículo endoplasmático

Este protocolo descreve um processo para a fabricação de redes lipídicas de nanotubos usando motilidade de quinase deslizante em conjunto com vesículas lipídicas unilamellar gigantes.

Fabricando redes nanotubos lipídes de lipídicas multi-componentes usando o ensaio de motilidade de mobilidade de cinévola gliding

Na interface de solventes orgânicos e aquosos, proteínas anfífilas sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares complexas, como vesículas, fibras e coacervates desencadeadas por parâmetros ambientais. Os protocolos de montagem descritos produzem compartimentos baseados em membrana sérica (PMBCs) com propriedades ajustáveis, permitindo o encapsulamento de várias cargas.

Montagem dirigida de proteínas semelhantes à elastina em estruturas supramoleculares definidas e encapsulamento de carga in vitro

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

O presente protocolo descreve a montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA), uma técnica microfluídica para gerar lipossomas biocompatíveis. O OLA produz lipossomas monodispersos do tamanho de mícrons com encapsulamento eficiente, permitindo a experimentação imediata no chip. Prevê-se que este protocolo seja particularmente adequado para biologia sintética e pesquisa de células sintéticas.

Montagem de lipossomas assistida por octanol on-chip para bioengenharia

Este artigo apresenta uma reconstituição simples de redes do citoesqueleto dentro de vesículas gigantes separadas por fase. O método pode ser generalizado e aplicado ao encapsulamento ou confinamento de uma ampla gama de biomoléculas.

In vitro Reconstituição de Redes Citoesqueléticas no Interior de Vesículas Unilamelares Gigantes Separadas por Fase (GUVs)

Aprenda a construir células sintéticas através da reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas em vesículas lipídicas. Este método integra redes metabólicas fora de equilíbrio para aplicações em biologia sintética.

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