Name: Um modelo de rato de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média sem danificar a estrutura anatômica dos vasos cerebrais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda uma técnica microcirúrgica para induzir isquemia cerebral em ratos preservando a integridade anatômica dos vasos. Este método minimiza danos vasculares e reduz a mortalidade em modelos de AVC.

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Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Introdução à Inteligência Estrangeira da Província de Hebei em 2023. Agradecemos a Lisa Kreiner, PhD, de Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), por editar o texto em inglês de um rascunho deste manuscrito.

O procedimento experimental recebeu aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yantai (Número de Aprovação: YTDX20230410) e aderiu às Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Ratos machos da raça Sprague-Dawley pesando entre 300-350 g foram utilizados para este estudo. Uma lista abrangente dos animais, reagentes e equipamentos usados é fornecida na Tabela de Materiais.
1. Preparação dos animais
<ol>
	<li>Alojar os animais em um ambiente que mantenha um ciclo claro/escuro de 12 h, temperatura e umidade controladas. Certifique-se de que eles tenham acesso irrestrito a comida e água.</li>
</ol>
2. Anestesia
<ol>
	<li>Anestesiar os ratos por injeção intraperitoneal com uma mistura contendo cetamina (80 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg). 
	NOTA: Incline a cabeça e o corpo dos ratos para baixo. O local da injeção está no quadrante inferior direito do abdômen do animal. Puxe o êmbolo para trás antes de injetar. O volume médio de injeção é de 0,4 mL.</li>
	<li>Confirme a indução da anestesia avaliando o reflexo de retirada da pata traseira e o reflexo de piscar. Se a profundidade adequada da anestesia não for alcançada, suplementar com isoflurano durante o procedimento cirúrgico.</li>
</ol>
3. Procedimento de modelagem isquêmica
<ol>
	<li>Esterilize as ferramentas cirúrgicas usando uma autoclave. Desinfete as mesas cirúrgicas e equipamentos relacionados com etanol 70%.</li>
	<li>Prepare o local da cirurgia raspando o pelo ao redor do local da incisão previsto. Desinfetar a pele no sítio cirúrgico três vezes com betadina e etanol a 70%.</li>
	<li>Faça uma incisão na linha média no lado ventral, com aproximadamente 1,5 cm de comprimento, e abra a fáscia superficial.</li>
	<li>Realize uma dissecção aguda e romba para expor a artéria carótida externa (ECA), a artéria carótida interna (ICA) e a artéria carótida comum (CCA) de acordo com o método descrito anteriormente7.</li>
	<li>Coloque três suturas de seda 4-0 ao redor do CCA e outra sutura de seda através do ECA perto da bifurcação do ICA. Amarre um nó deslizante soltável no CCA proximal. Aperte a sutura no CCA distal usando um hemostático para bloquear o fluxo sanguíneo. Amarre frouxamente outro nó corrediço ao redor do CCA durante a sutura para garantir que o vaso não esteja ocluído. 
	NOTA: Certifique-se de que o nó corrediço não esteja excessivamente apertado, apenas o suficiente para bloquear o fluxo sanguíneo, pois precisará ser liberado durante a sutura vascular.</li>
	<li>Faça uma incisão de 0,5 mm entre a sutura proximal da seda e a sutura do meio na ACC usando uma tesoura. 
	NOTA: Certifique-se de que a incisão permite que o filamento (ponta revestida de silicone) entre no CCA.</li>
	<li>Introduzir um filamento 4-0 de 3 cm de comprimento (ponta revestida de silicone) no CCA. Aperte as suturas de seda ao redor do CCA para prender o filamento intraluminal e evitar sangramento; em seguida, remova a sutura da CCA distal.</li>
	<li>Continue a inserir o filamento no lúmen do MCA, controlando as suturas ao redor do ECA para garantir que o filamento não entre no ECA. O comprimento de inserção é normalmente de 18 mm a 20 mm.</li>
	<li>Inicie um cronômetro e registre a hora em que a oclusão começa. Suture a incisão no pescoço com suturas de seda 3-0 e coloque cuidadosamente o animal em uma gaiola de recuperação. Administre 0,5 mL de solução salina normal por via intraperitoneal.</li>
</ol>
4. Sutura microcirúrgica da ACC
<ol>
	<li>Reanestesiar o rato 1,5 h após a isquemia. Desinfete o local da incisão três vezes com etanol a 70% e reabra a incisão.</li>
	<li>Retire suavemente o filamento de oclusão até que a ponta branca fique claramente visível perto da incisão CCA. Coloque um micro grampo horizontalmente próximo ao nó de sutura intraluminal seguro próximo à bifurcação CCA. 
	NOTA: Evite clamping a ponta do filamento branco para evitar o descolamento do silicone e subsequente trombose.</li>
	<li>Solte o nó de sutura intraluminal seguro e remova completamente o filamento.</li>
	<li>Coloque outro micro grampo perto do lado da extremidade do coração do nó CCA proximal. Em seguida, remover o nó de sutura ao redor da CCA proximal. 
	NOTA: A colocação adequada das pinças é crucial para elevar os vasos fixos em etapas posteriores para facilitar a sutura microvascular. Coloque grampos horizontalmente nos músculos circundantes para evitar deslizamento.</li>
	<li>Enxágue o local da incisão com solução salina normal e seque a área com uma bola de algodão estéril para remover o sangue e obter um campo cirúrgico claro.</li>
	<li>Sob um microscópio (ampliação de 4x), suture a incisão CCA usando suturas microcirúrgicas 11-0 em um padrão interrompido, normalmente exigindo dois pontos, dependendo do tamanho da incisão.</li>
	<li>Após a sutura, remova os micro grampos de ambas as extremidades do CCA para restaurar o fluxo sanguíneo.</li>
	<li>Aplique pressão com uma bola de algodão estéril no local da sutura do CCA por 30 s. Observe o CCA por 2 min para garantir que não ocorra sangramento. Suturar a incisão no pescoço do rato e colocar o animal em uma caixa de cuidados a 35 °C para recuperação da anestesia antes de devolvê-lo à gaiola. 
	NOTA: Administrar por via intraperitoneal com meloxicam na dose de 2 mg/kg para analgesia pós-operatória.</li>
</ol>
5. Coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)
<ol>
	<li>Três dias após a isquemia-reperfusão, eutanasiar os animais sob anestesia profunda com isoflurano a 4% e luxação cervical.</li>
	<li>Remova os miolos e corte-os em cortes coronais de 2 mm de espessura usando uma lâmina de bisturi8.</li>
	<li>Incube as seções cerebrais com TTC a 2% por 20 min a 37 ° C.</li>
	<li>Enxágue as seções cerebrais duas vezes com formalina a 10% e, em seguida, fixe-as com formalina a 10% por 30 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Capture fotografias digitais de cortes consecutivos e meça quantitativamente as áreas de infarto usando o software Image J.</li>
</ol>
6. Teste de função neurológica
NOTA: A função neurológica foi avaliada pelo teste de Garcia, seguindo um relatório anterior9.
<ol>
	<li>Avalie a atividade espontânea, a simetria no movimento dos quatro membros, o alongamento da pata dianteira, a escalada, a propriocepção corporal e a resposta ao toque das vibrissas. Atribua pontuações com base nos critérios do teste de Garcia, com uma pontuação máxima de 18 pontos indicando função neurológica normal.</li>
</ol>
7. Análise estatística
<ol>
	<li>Utilize o GraphPad Prism para realizar análises estatísticas usando o teste t de Student. Expresse os dados como a média ± desvio padrão. Considere-se diferenças entre médias estatisticamente significantes se P < 0,05.</li>
</ol>

Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats with Preserved Vascular Anatomy

<ol><li>Tu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((China+stroke+surveillance+report+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Mil+Med+Res%22%5BJournal%5D)">China stroke surveillance report 2021.</a> Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oxidative+stress+and+inflammation+to+prevent+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury.</a> Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).</li>
<li>Ringelstein, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+and+extent+of+hemispheric+brain+infarctions+and+clinical+outcome+in+early+and+delayed+middle+cerebral+artery+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization.</a> Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%3A+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jap+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Trueman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-examination+of+the+intraluminal+filament+MCAO+model%3A+Impact+of+external+carotid+artery+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection.</a> Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).</li>
<li>Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+%28MCAO%29+model+for+ischemic+stroke+with+laser+Doppler+flowmetry+guidance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice.</a> J Vis Exp. (51), e2879(2011).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icaritin+inhibits+neuroinflammation+in+a+rat+cerebral+ischemia+model+by+regulating+microglial+polarization+through+the+GPER-ERK-NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway.</a> Mol Med. 28 (1), 142(2022).</li>
<li>Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+Deficit+and+extent+of+neuronal+necrosis+attributable+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).</li>
<li>Bracko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitropropionic+acid-induced+ischemia+tolerance+in+the+rat+brain+is+mediated+by+reduced+metabolic+activity+and+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).</li>
<li>Goldmacher, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+transplanted+bone+marrow+stem+cells+and+their+effects+in+the+rat+MCAO+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model.</a> PLoS One. 8 (3), e60049(2013).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease.</a> Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).</li>
<li>Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+and+strain-related+variables+significantly+affect+outcome+in+a+murine+model+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia.</a> Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).</li>
<li>Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+susceptibility+to+cerebral+ischemia+are+related+to+cerebral+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).</li>
<li>Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).</li>
<li>Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum interesse conflitante potencial a divulgar.

A MCAo é um método amplamente utilizado para criar modelos animais de AVC, replicando efetivamente o processo de AVC observado em pacientes, restaurando o fluxo sanguíneo após isquemia 10,11,12. Nosso laboratório desenvolveu um modelo de AVC isquêmico que permite a reperfusão da ACC sem causar danos à ECA. Após a indução da isquemia, é realizado o reparo microcirúrgico da ACC. Embora a medição direta do fluxo sanguíneo da ACC não tenha sido realizada, os experimentadores observaram pulsação vascular na ACC antes de prosseguir com a reperfusão. Essa técnica preserva a integridade anatômica dos vasos do pescoço, ao mesmo tempo em que se assemelha ao processo de AVC em pacientes. Além disso, avaliações da função neurológica e da área de isquemia cerebral confirmaram a validade do AVC induzido por essa abordagem cirúrgica.
Os modelos de AVC isquêmico descritos anteriormente podem ser afetados por vários fatores. No método de Koizumi et al.4, a reperfusão sanguínea depende fortemente do círculo de Willis devido à ligadura da ACC. No entanto, variações na vasculatura cerebral podem influenciar o volume final do infarto cerebral, potencialmente aumentando a taxa de mortalidade do modelo de AVC devido à baixa perfusão sanguínea13,14. Além disso, a isquemia da ECA pode prejudicar a função dos músculos e nervos faciais, impactando na avaliação de várias funções neurológicas15,16.
O método atual aborda esses desafios por meio de três etapas principais: (1) Manter a incisão do CCA o menor possível, grande apenas o suficiente para a inserção do filamento, reduzindo o tempo e os danos associados à sutura vascular. (2) Colocar pinças microvasculares o mais próximo possível da bifurcação do CCA ao clampear o CCA distal para evitar o clampeamento da ponta do filamento branco, o que pode levar ao descolamento do silicone e trombose. (3) Observar a ACC quanto à retomada da pulsação e ausência de sangramento substancial antes de suturar a incisão cervical na linha média após o reparo vascular.
O método atual tem várias limitações. Em primeiro lugar, existe a possibilidade de formar êmbolos no local da sutura, o que pode levar a mais isquemia cerebral se eles se desprenderem. Esse risco deve ser cuidadosamente considerado e gerenciado em experimentos futuros. Em segundo lugar, o estudo não monitorou o peso corporal dos ratos, o que torna difícil determinar se o método afetou sua ingestão de alimentos. A ingestão de alimentos é um indicador direto das vantagens do método, e sua avaliação pode fornecer informações valiosas. Por fim, o método atual requer proficiência técnica em operações microcirúrgicas, o que pode limitar seu uso generalizado sem treinamento e experiência adequados.
Em resumo, embora o método de modelagem MCAo ofereça alta relevância fisiológica e integridade estrutural, ele vem com limitações que precisam ser abordadas para uma experimentação mais robusta. Preservar a integridade anatômica dos vasos do pescoço e simular de perto os processos de AVC em pacientes são pontos fortes significativos do método. Essa abordagem, sem dúvida, contribuirá significativamente para a pesquisa de AVC isquêmico, melhorando a confiabilidade e a precisão dos modelos experimentais. Em última análise, isso pode levar a menos grupos experimentais necessários para testar os efeitos terapêuticos, resultando em resultados experimentais mais confiáveis.

O acidente vascular cerebral, a principal causa de morte e disfunção neurológica de longa duração em adultos em todo o mundo, abrange vários tipos, sendo o acidente vascular cerebral isquêmico responsável por aproximadamente 81,9% dos casos, enquanto a hemorragia cerebral e a hemorragia subaracnóidea representam 14,9% e 3,1%, respectivamente1. O AVC isquêmico geralmente resulta de aterosclerose ou oclusão da artéria cerebral média (ACM), levando à redução do fluxo sanguíneo cerebral local e subsequente dano cerebral. Essa redução no suprimento de nutrientes para as células isquêmicas desencadeia a depleção de energia, causando perda da integridade da membrana, inchaço celular e, eventualmente, lise. Além disso, fatores como aumento do cálcio intracelular, liberação de aminoácidos excitatórios, aumento da produção de radicais livres e ativação de células inflamatórias contribuem para a lesão do tecido cerebral pós-AVC2.
Os objetivos do tratamento do AVC isquêmico são multifacetados: reduzir os danos neurológicos contínuos e diminuir a mortalidade e a incapacidade a longo prazo; prevenir complicações decorrentes da imobilidade e disfunção neurológica; e minimizar o risco de recorrência do AVC. Dada a complexidade da fisiopatologia do AVC isquêmico, um modelo robusto de AVC é essencial para a pesquisa e desenvolvimento de tratamentos direcionados ao AVC isquêmico.
Atualmente, a oclusão da artéria cerebral média (MCAo) é um modelo animal comum de AVC isquêmico3. A MCAo é normalmente realizada inserindo um monofilamento com ponta de silicone ou embotado em chama através dos vasos cervicais até atingir a origem da artéria cerebral média (MCA). Em 1986, Koizumi e colegas desenvolveram uma técnica envolvendo a inserção de um monofilamento com ponta de silicone através de uma incisão na artéria carótida comum (ACC), permitindo que ele alcançasse a entrada da ACM e bloqueasse seu fluxo sanguíneo4. Em 1989, o grupo de Longa relatou outro método MCAo que envolvia a introdução de um monofilamento através de uma incisão na artéria carótida externa (ECA). O monofilamento então atravessa a bifurcação da artéria carótida interna (ACI) e ECA antes de atingir o ponto de partida da classe MCA<sup='xref'>5.
As limitações dos dois métodos existentes para induzir MCAo são evidentes. O método de Koizumi requer o bloqueio permanente da ACC ipsilateral, levando à redução da perfusão da ACM, uma vez que a reperfusão depende apenas do círculo de Willis4. Por outro lado, o método de Longa envolve o corte do ECA, resultando em danos ao sistema ECA e subsequente comprometimento da função muscular facial5. Esse dano pode impactar na ingestão de alimentos e água, bem como causar disfunção sensorial da face, afetando a reabilitação e a avaliação da função neurológica pós-AVC isquêmico6.
O protocolo atual procura abordar essas limitações desenvolvendo um novo método para induzir um modelo de AVC isquêmico sem danificar a estrutura anatômica dos vasos cerebrais. Essa nova abordagem utiliza técnicas microcirúrgicas para reparar o CCA, evitando assim as desvantagens associadas aos métodos anteriores.

<table><tbody><tr><td>10% formalina</td><td>Pequim Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BL913A</td><td></td></tr><tr><td>11-0 suturas microcirúrgicas</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>3/8 1&vezes; </td><td></td>5</tr><tr><td>2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto (TTC)</td> <td>SIGMA</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>3-0 sutura de seda</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>3-0</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano a 4%&nbsp; &nbsp;</td><td>Fornecedor verificado - Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>20221102</tr><tr><td>6-0 sutura de seda</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>6-0</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>20230408</tr><tr><td>Filamento</td><td>Xinong Technologies Co Ltd.</td><td>2838-A5</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Jiangsu Hengrui Farmacêutica Co., Ltd.</td><td>230613BL</td><td></td></tr><tr><td>Ratos machos Sprague Dawley</td><td>Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.</td><td>SCXK (Lu) 20190003</td><td></td></tr><tr><td>Microclips</td><td>Shanghai Jinzhong Fábrica de Dispositivos Médicos</td><td>W40150</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>ZEISS</td><td>S100 OPMI pico</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de enfermagem</td> Beijing <td>Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd.</td><td>FYL-YS-100L</td><td></td></tr><tr><td>xilazina</td><td>SIGMA</td><td>PHR3263</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de rato de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média sem danificar a estrutura anatômica dos vasos cerebrais

A Rat Model of Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion Without Damaging the Anatomical Structure of Cerebral Vessels

O AVC isquêmico é a principal causa de incapacidade e mortalidade a longo prazo entre adultos em todo o mundo. Modelos animais de AVC isquêmico têm contribuído significativamente para a compreensão de seus mecanismos patológicos e para o desenvolvimento de possíveis tratamentos. Atualmente, existem dois métodos comuns envolvendo técnicas de filamento (sutura endovascular) para induzir modelos animais de isquemia cerebral. No entanto, esses métodos têm limitações inerentes, como redução da perfusão sanguínea para o cérebro, danos ao sistema da artéria carótida externa, ingestão prejudicada de alimentos e/ou água e disfunção sensorial da face. Este artigo apresenta um novo método para induzir um modelo de AVC isquêmico em ratos sem comprometer a anatomia vascular cerebral. Neste estudo, a artéria carótida comum (ACC) de ratos Sprague-Dawley foi exposta e uma incisão foi feita. Um filamento foi então inserido através da incisão na artéria carótida interna para ocluir a artéria cerebral média. Após 1,5 h de isquemia induzida, o filamento ocluído foi totalmente removido da artéria carótida interna e da ACC. A incisão na ACC foi posteriormente suturada com pontos microcirúrgicos 11-0 ao microscópio (aumento de 4x). Através da utilização de técnicas microcirúrgicas para reparar o CCA, este estudo desenvolveu com sucesso um método único para induzir um modelo de AVC isquêmico em ratos, preservando a integridade anatômica dos vasos sanguíneos cerebrais.

O processo de microsutura 
O filamento foi retirado próximo à incisão da ACC até que a ponta branca do filamento ficasse visível (Figura 1A). Em seguida, grampos microcirúrgicos foram colocados sobre a ACC (Figura 1B). Sob microscópio com ampliação de 4x, a incisão da ACC foi suturada utilizando pontos microcirúrgicos em padrão interrompido (Figura 1C). Posteriormente, os microgrampos foram removidos da ACC, restaurando a estrutura anatômica e o fluxo sanguíneo (Figura 1D).
Coloração com TTC e taxa de mortalidade 
Um total de 12 ratos machos adultos foi dividido aleatoriamente em dois grupos: sham e modelo (n = 6 em cada grupo). Infelizmente, um animal do grupo sham morreu devido a uma overdose de anestésico, e um animal do grupo modelo morreu dentro de 24 horas. Os infartos resultantes da isquemia cerebral foram observados tanto no estriado quanto na córtex (Figura 2A). Três dias após o acidente vascular cerebral isquêmico, a porcentagem total de infarto foi medida em 29,3% ± 1,6% do hemisfério (Figura 2B), com uma taxa de mortalidade de 16,7% após a cirurgia.
Avaliação da função neurológica 
Nos dias 1 e 3 após o acidente vascular encefálico isquêmico, os escores dos grupos modelo diminuíram significativamente em comparação com os dos grupos controle (17,8 ± 0,4 vs. 8,2 ± 1,5, Figura 3A; 17,6 ± 0,9 vs. 9,6 ± 1,3, Figura 3B, respectivamente).
<img alt="Diagrama da técnica de sutura cirúrgica; pinça segurando tecido; etapas: inserção da agulha, amarração do nó." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: O processo de microsutura. (A) O filamento é retirado da ACI. As setas azuis indicam os grampos microvasculares. (B) A seta preta indica a incisão após a remoção completa do filamento. As setas azuis indicam os grampos microvasculares. (C) Sob microscópio (ampliado 4x), a incisão na ACI foi suturada utilizando fios de sutura microcirúrgicos 11-0 em padrão interrompido. As setas azuis indicam os grampos microvasculares. A seta preta indica a incisão suturada. (D) Os grampos micro são removidos e o fluxo sanguíneo da ACI é restabelecido. A seta preta indica o local suturado da ACI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Seções de tecido cerebral isquêmico, gráfico de barras, comparação da porcentagem de área isquêmica, resultados do experimento." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Resultados da coloração com TTC do modelo de isquemia. (A) Imagens representativas de cortes cerebrais corados com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) após isquemia cerebral. Nos tecidos vivos, o TTC é reduzido enzimaticamente por desidrogenases em 1,3,5-trifenilformazano, que apresenta cor vermelha. Os tecidos nas áreas necróticas permanecem brancos devido à ausência dessa atividade enzimática. (B) Porcentagem de área isquêmica em ratos aos 3 dias após isquemia cerebral. Em comparação com o grupo Sham, **P &lt; 0,01. Os dados são expressos como média ± desvio padrão. Havia cinco ratos em cada grupo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras comparando os escores de Garcia no grupo Sham versus Modelo, mostrando diferença significativa (**)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Avaliação da função neurológica. (A) Escores de Garcia 1 dia após a isquemia cerebral. (B) Escores de Garcia 3 dias após a isquemia cerebral. Em comparação com o grupo Sham, **P &lt; 0,01. Os dados são expressos como média ± desvio padrão. Havia cinco ratos em cada grupo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

O protocolo atual descreve um modelo de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média em ratos que preserva a estrutura anatômica dos vasos cerebrais sem causar danos.

Um modelo de rato de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média sem danificar a estrutura anatômica dos vasos cerebrais

Ischemic stroke stands as the primary cause of long-term disability and mortality among adults worldwide. Animal models of ischemic stroke have ...

Este estudo desenvolve um modelo de rato para oclusão ou reperfusão da artéria cerebral média que mantém a integração do vaso cerebral. Ele se concentra na introdução de um novo método para induzir um modelo de AVC isquêmico em ratos sem comprometer a anatomia vascular cerebral. O projeto utiliza técnicas microcirúrgicas e a isquemia induzida pelo filamento.Introduz um método para induzir isquemia sem danificar a artéria carótida comum ou o sistema carotídeo externo. Ao contrário das técnicas que podem prejudicar permanentemente o fluxo sanguíneo ou danificar a anatomia vascular cerebral, este protocolo mantém a integridade anatômica de vários vasos. Ele fornece uma abordagem mais precisa e menos prejudicial para o estudo do AVC isquêmico.Para começar, coloque o rato anestesiado em uma plataforma de operação. Depois de raspar o pelo ao redor da garganta e da região do pescoço esquerdo, desinfete o local da cirurgia três vezes com Betadine e etanol 70%. Faça uma incisão na linha média de 1,5 centímetro de comprimento no lado ventral do pescoço e abra a fáscia superficial.Realize a dissecção romba para expor a artéria carótida externa, a artéria carótida interna e a artéria carótida comum. Coloque três suturas de seda 4-0 ao redor da artéria carótida comum e outra sutura de seda através da artéria carótida externa perto da bifurcação da artéria carótida interna. Amarre um nó deslizante soltável na artéria carótida comum proximal.Aperte a sutura na artéria carótida comum distal usando um hemostático para bloquear o fluxo sanguíneo. Amarre frouxamente outro nó deslizante ao redor da artéria carótida comum durante a sutura para garantir que o vaso não esteja ocluído. Agora, usando uma tesoura, faça uma incisão de 0,5 milímetro entre a sutura proximal da seda e a sutura do meio na artéria carótida comum.Introduza um filamento 4-0 de três centímetros de comprimento na artéria carótida comum. Aperte as suturas de seda ao redor da artéria carótida comum para prender o filamento intraluminal e evitar sangramento. Em seguida, remova a sutura da artéria carótida comum distal.Continue a inserir o filamento no lúmen da artéria cerebral média, controlando as suturas ao redor da artéria carótida externa. Inicie um cronômetro e registre a hora em que a oclusão começa. Suturar a incisão no pescoço com suturas de seda 3-0.Coloque cuidadosamente o animal em uma gaiola de recuperação. Após a modelagem isquêmica, reabra a incisão no pescoço do rato anestesiado. Sob um microscópio de dissecação, retire suavemente o filamento de oclusão enquanto coloca o micro grampo horizontalmente próximo ao nó de sutura intraluminal.Continue retirando até que a ponta branca esteja claramente visível perto da incisão da artéria carótida comum. Em seguida, remova completamente o filamento e solte o nó de sutura intraluminal seguro. Coloque outro micro grampo perto do lado da extremidade do coração do nó proximal da artéria carótida comum.Em seguida, remova o nó de sutura ao redor da artéria carótida comum proximal. Enxágue o local da incisão com solução salina. Seque a área com uma bola de algodão estéril para remover o sangue e obter um campo cirúrgico claro.Agora, com aumento de 4x, suturar a incisão da artéria carótida comum usando suturas microcirúrgicas 11-0 em um padrão interrompido. Após a sutura, remova os microgrampos de ambas as extremidades da artéria carótida comum para restaurar o fluxo sanguíneo. Aplique pressão com uma bola de algodão estéril no local da sutura da artéria carótida comum por 30 segundos.Observe a artéria carótida comum por dois minutos para garantir que não ocorra sangramento. Suture a incisão no pescoço e coloque o rato em uma caixa de cuidados de 35 graus Celsius para recuperação da anestesia. Três dias após a reperfusão da isquemia, remova o cérebro do rato eutanasiado.Congele o cérebro a menos 20 graus Celsius por 20 minutos. Após o congelamento, use um bisturi para cortar o cérebro em seções coronais de dois milímetros de espessura. Incube as seções cerebrais com 2% TTC por 20 minutos a 37 graus Celsius.Após a incubação, transfira as seções cerebrais para uma pequena placa de Petri e descarte 2% TTC. Em seguida, fixe as seções cerebrais com 10% de formalina por 30 minutos em temperatura ambiente. Descarte a formalina e enxágue as seções cerebrais com PBS.Capture fotografias digitais de fatias consecutivas. Usando o software ImageJ, meça quantitativamente as áreas de infarto. Após a coloração do TTC, os infartos resultantes da isquemia cerebral foram observados tanto no estriado quanto no córtex.Três dias após o AVC isquêmico, a porcentagem total de infarto foi medida em aproximadamente 30% do hemisfério, com uma taxa de mortalidade de 16,7% após a cirurgia.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Indução cirúrgica de uma lesão cerebral isquêmico no rato é um modelo amplamente utilizado para a pesquisa acidente vascular cerebral. Aqui nós demonstram a indução de isquemia cerebral focal por oclusão da artéria cerebral média. Visualização do infarto resultantes de coloração histológica e ressonância magnética também é mostrada.

Modelo de isquemia focal cerebral por oclusão Suture Endovascular da artéria cerebral média no Rat

Demonstramos no vídeo um método para produzir uma oclusão da artéria cerebral média em ratos adultos utilizando um monofilamento intraluminal. Também mostramos como avaliar a extensão do infarto cerebral por 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto de coloração (TTC).

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

Este vídeo demonstra o procedimento de realização da oclusão permanente da artéria cerebral média distal, ou MCAO, com a artéria carótida comum, ou ligadura CCA, em ratos idosos para modelar o AVC isquêmico. Isso bloqueia o fluxo sanguíneo para o cérebro, levando à morte neuronal e gerando um modelo para estudar os mecanismos do AVC e possíveis tratamentos.

Induzindo isquemia via oclusão do cérebro médio e da artéria carótida comum em um modelo de rato

Fonte: Larpthaveesarp, A., et. al. Modelo transitório de oclusão da artéria cerebral média de acidente vascular cerebral neonatal em ratos P10. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o estabelecimento do modelo de oclusão da artéria cerebral média em um filhote de rato. A artéria carótida interna (ACI) é exposta e uma ligadura é fixada para restringir a inundação do sangue. Um ocluído é inserido através da ACI para atingir a Artéria Cerebral Média. O filhote é então autorizado a se recuperar...

Gerando uma oclusão da artéria cerebral média em um filhote de rato para induzir isquemia cerebral local

Nós descrevemos um método altamente reprodutível para a oclusão permanente de um roedor grande vaso sanguíneo cerebral. Esta técnica pode ser realizado com muito pouco dano periférica, a perda de sangue mínima, uma elevada taxa de sobrevivência a longo prazo, e o volume de enfarte consistente comensurável com a população de clínica humana.

Permanente oclusão vascular cerebral<em&gt; Via</em&gt; Dupla ligadura e transecção

O AVC neonatal é uma causa significativa de lesão cerebral precoce, exigindo um modelo translacional com padrões consistentes de lesão focal e alta reprodutibilidade para permitir o estudo. Este estudo descreve o procedimento cirúrgico detalhado para a criação de uma lesão de isquemia-reperfusão focal unilateral não hemorrágica em roedores equivalentes a termo.

Transiente Artéria Cerebral Média Oclusão Modelo de AVC neonatal em ratos P10

Oclusão de filamento intraluminal da artéria cerebral média é o modelo mais frequentemente utilizadas na vivo do acidente vascular cerebral experimental em roedores. Uma abordagem alternativa cirúrgica para permitir a reparação de artéria carótida comum é realizada aqui, que permite a reperfusão da artéria carótida comum e uma reperfusão completa no território da artéria cerebral média.

Oclusão de artéria Cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos

Para investigar a fisiopatologia do AVC, é criado um modelo do rato de isquémia-reperfusão cerebral. Nós distalmente ligate da artéria cerebral média direita e artéria carótida comum direita e restaurar o fluxo sanguíneo após 10 ou 40 min de isquemia.

Modelo de Mouse de dois vasos oclusão de isquémia-reperfusão Cerebral

Este protocolo descreve o processo de preparação para a reperfusão da oclusão da artéria cerebral média através da artéria carótida comum.

Preparação de um modelo modificado para reperfusão de oclusão da artéria cerebral média

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método reprodutível para realizar uma craniectomia seguida de oclusão permanente e seletiva da artéria cerebral média em ratos, para aplicação em estudos experimentais de déficits de memória motora e espacial.

Oclusão Seletiva e Permanente da Artéria Cerebral Média em Ratos: Uma Abordagem Experimental para Estudar Déficits de Memória Motora e Espacial

Aprenda uma técnica microcirúrgica para induzir isquemia cerebral em ratos preservando a integridade anatômica dos vasos. Este método minimiza danos vasculares e reduz a mortalidade em modelos de AVC.

Um modelo de rato de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média sem danificar a estrutura anatômica dos vasos cerebrais

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