Quantificando a atividade do sistema de secreção de Yersinia pseudotuberculosis tipo III após a falta de ferro e o crescimento anaeróbico

Os patógenos bacterianos usam fatores de virulência para colonizar diferentes nichos dentro do organismo hospedeiro. Estamos trabalhando para entender como os patógenos bacterianos detectam pistas ambientais específicas nos tecidos do hospedeiro para regular a expressão do fator de virulência. O patógeno humano Yersinia pseudotuberculosis usa o fator de virulência do sistema de secreção tipo três para injetar proteínas efetoras nas células hospedeiras.

O sistema de secreção tipo três permite que as bactérias subvertam os mecanismos de defesa do hospedeiro e colonizem os tecidos do hospedeiro. No entanto, a expressão do sistema de secreção de Yersinia Tipo III é metabolicamente onerosa, de modo que a expressão dos genes do sistema de secreção tipo três é estritamente regulada em resposta a pistas ambientais, como a temperatura. Nossas publicações anteriores mostraram que a expressão do sistema de secreção de Yersinia Tipo III é controlada pela disponibilidade de ferro e tensão de oxigênio através de um fator de transcrição chamado ISCR.

Esses achados são significativos porque Yersinia coloniza tecidos hospedeiros que variam em seu teor de ferro e tensão de oxigênio. Por exemplo, o lúmen intestinal contém ferro suficiente para o crescimento de Yersinia, mas tem baixa tensão de oxigênio. Em contraste, tecidos como o sangue têm disponibilidade de ferro muito baixa, mas maior tensão de oxigênio.

Nosso método nos permite cultivar Yersinia em condições de cultivo que variam na quantidade de ferro e oxigênio disponíveis, para estudar como essas pistas ambientais afetam a expressão do sistema de secreção tipo três. Este método nos ajudará a determinar o mecanismo molecular pelo qual a disponibilidade de ferro e oxigênio controla a expressão do sistema de secreção tipo três e nos ajudará a entender como isso controla o resultado da infecção por Yersinia. Para começar, listre Yersinia Pseudo tuberculosis em placas de ágar caldo de lisogenia.

Incube as placas em temperatura ambiente por 48 horas. Assim que as colônias visíveis se formarem, inocule uma única colônia isolada em quatro mililitros de meio M9. Cultive-o durante a noite a 26 graus Celsius com aeração a 250 RPM.

Coloque uma cubeta contendo a cultura em um espectrômetro e, em seguida, dilua a cultura em 14 mililitros de meio M9 quelatado estéril sem suplementação de ferro para atingir um valor OD600 de 0,1. Coloque os frascos em um agitador de 26 graus Celsius e incube por oito horas. Após a conclusão da incubação, use a cultura para iniciar três novas culturas; dois para crescimento anaeróbico e um para crescimento aeróbico.

Para cultura aeróbica, dilua a cultura para um valor OD600 de 0,1 em 14 mililitros de meio M9 quelatado estéril sem suplementação de ferro. Em seguida, cultura com aeração a 26 graus Celsius por 12 horas. Para cultura anaeróbica, diluir a cultura em 14 mililitros de meio M9 quelatado estéril em dois tubos de vidro lavados com ácido.

No primeiro tubo, adicione sulfato de ferro esterilizado por filtro até uma concentração final de um miligrama por litro. No segundo tubo, adicione sulfato de ferro para uma concentração final de 0,01 miligrama por litro. Incubar ambos os tubos em uma câmara anaeróbica em temperatura ambiente por 12 horas.

Em seguida, induza a atividade do sistema de secreção tipo três, deslocando as culturas anaeróbicas para 37 graus Celsius e continuando a incubação por quatro horas. Em seguida, dilua as culturas de crescimento aeróbico para um valor OD600 de 0,2 adicionando 14 mililitros de meio M9 quelatado em dois frascos lavados com ácido. Adicionar sulfato de ferro nas concentrações finais exigidas aos frascos.

Incubar ambos os frascos com arejamento a 26 graus Celsius a 250 RPM durante duas horas. Após duas horas, mude as culturas para 37 graus Celsius com aeração a 250 RPM por quatro horas para induzir a atividade do sistema de secreção tipo três. Após a indução do sistema de secreção tipo três em Yersinia pseudotuberculosis, transfira volumes normalizados dessa cultura incubada em tubos de 15 mililitros.

Adicionar quatro microlitros de albumina de soro bovino a cada tubo como controle de precipitação de proteínas. Centrifugar as culturas a 3.200 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Filtre o sobrenadante em um tubo novo de 15 mililitros usando um filtro de PVDF de 0,22 mícron conectado a uma seringa.

Em seguida, adicione ácido tricloroacético equivalente a 10% do volume sobrenadante. Vortex os tubos vigorosamente por um minuto. Incube os tubos no gelo em uma câmara fria a quatro graus Celsius durante a noite.

Em seguida, adicione dois mililitros de cada amostra a um tubo de dois mililitros e centrifugue a 21.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Aspire o sobrenadante usando um acessório de vácuo. Repita a pipetagem de dois mililitros de amostra no mesmo tubo, centrifugue e aspire o sobrenadante.

Consolide as reações de precipitação em um único tubo de dois mililitros. Lave os pellets com um mililitro de acetona a 100% gelada, seguido de centrifugação e aspiração de sobrenadante. Depois de retirar o sobrenadante pela última vez, secar o pellet na bancada durante uma hora.

A proteína precipitada deve parecer uma névoa ao longo da lateral do tubo. Em seguida, ressuspenda cada pellet em 50 microlitros de solução F-S-B-DTT. Vortex completamente por um minuto.

Em seguida, ferva as amostras em um bloco de calor a 95 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, centrifugue brevemente à velocidade máxima à temperatura ambiente. Carregue 15 microlitros de cada amostra anaeróbica e 10 microlitros de cada amostra aeróbica em um gel 12,5% SDS-PAGE para análise.

Após a conclusão da execução do gel, use coloração de prata para visualizar as proteínas no gel. Para começar, coloque um gel SDS-PAGE contendo amostras aeróbicas separadas de Yersinia pseudotuberculosis em um sistema de imagem. No software, selecione as bandas que representam a proteína efetora do sistema de secreção tipo três, YopE, em todos os poços.

Defina a banda YopE de referência para o sample apropriado. Exporte os valores de quantificação relativa calculados por software para todas as bandas YopE. Em seguida, selecione todas as bandas BSA em todos os poços.

Certifique-se de que a banda BSA de referência corresponda ao sample da banda YopE de referência. Exporte os valores de quantificação relativos para todas as bandas BSA. Divida o valor YopE pelo valor BSA para cada condição para produzir resultados normalizados.

O gel SDS-PAGE corado com prata revelou que, nas amostras anaeróbicas, 38 vezes mais YopE estava presente nas amostras com baixo teor de ferro em comparação com as amostras com alto teor de ferro. Nas amostras aeróbicas, essas proteínas foram secretadas em quantidades quase semelhantes.