Name: Estabilização de uma osteotomia de fêmur com fixação de placa em Ambystoma mexicanum (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprenda a estabilizar osteotomia femoral com fixação de placa em Ambystoma mexicanum para estudar regeneração óssea e cicatrização em anfíbios. Este protocolo permite análises comparativas com mamíferos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Usando a fixação em placas para estudar a cicatrização óssea e a regeneração de membros em axolotes

<ol><li>Amamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+axolotls+can+regenerate+original+neuronal+diversity+in+response+to+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury.</a> Elife. 5, 13998(2016).</li>
<li>Butler, E. G., Ward, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+spinal+cord+following+ablation+in+urodele+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae.</a> J Exp Zool. 160 (1), 47-65 (1965).</li>
<li>Echeverri, K., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectoderm+to+mesoderm+lineage+switching+during+axolotl+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration.</a> Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).</li>
<li>Vargas-Gonzalez, A., Prado-Zayago, E., Leon-Olea, M., Guarner-Lans, V., Cano-Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+after+surgical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Cardiol+Mex%22%5BJournal%5D)">Myocardial regeneration in Ambystoma mexicanum after surgical injury.</a> Arch Cardiol Mex. 75 (3), S321-S329 (2005).</li>
<li>Vieira, W. A., Wells, K. M., McCusker, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+to+the+axolotl+model+for+regeneration+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Advancements to the axolotl model for regeneration and aging.</a> Gerontology. 66 (3), 212-222 (2020).</li>
<li>Song, F., Li, B., Stocum, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+as+research+models+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Amphibians as research models for regenerative medicine.</a> Organogenesis. 6 (3), 141-150 (2010).</li>
<li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+limb+blastema%3A+Cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">The axolotl limb blastema: Cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxf). 2 (2), 54-71 (2015).</li>
<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing%3A+Mechanisms+and+interventions%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Fracture healing: Mechanisms and interventions).</a> Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Polikarpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specialist+in+regeneration-the+Axolotl-a+suitable+model+to+study+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">The specialist in regeneration-the Axolotl-a suitable model to study bone healing.</a> NPJ Regen Med. 7 (1), 35(2022).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+fibula+as+a+model+for+the+induction+of+regeneration+across+large+segment+defects+in+long+bones+of+the+extremities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The axolotl fibula as a model for the induction of regeneration across large segment defects in long bones of the extremities.</a> PLoS One. 10 (6), e0130819(2015).</li>
<li>Cosden-Decker, R. S., Bickett, M. M., Lattermann, C., MacLeod, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analysis+of+intra-articular+interzone+tissue+in+axolotl+salamanders%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analysis of intra-articular interzone tissue in axolotl salamanders.</a> Osteoarthritis Cartilage. 20 (11), 1347-1356 (2012).</li>
<li>Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+closed+femoral+fractures+in+mice%3A+A+model+to+study+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing.</a> J Vis Exp. (138), e58122(2018).</li>
<li>Cheung, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+externally+fixed+femoral+fracture+model+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">An externally fixed femoral fracture model for mice.</a> J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).</li>
<li>Jiang, S., Knapstein, P., Donat, A., Tsitsilonis, S., Keller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+a+standardized%2C+femoral+osteotomy+model+to+study+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for a standardized, femoral osteotomy model to study fracture healing in mice.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100798(2021).</li>
<li>Matthys, R., Perren, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+fixator+for+use+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Internal fixator for use in the mouse.</a> Injury. 40, Suppl 4 S103-S109 (2009).</li>
<li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+segmental+femoral+critical-size+defect+model+in+mice+stabilized+by+plate+osteosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis.</a> J Vis Exp. (116), e52940(2016).</li>
<li>Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+of+mouse+diaphyseal+femur+fracture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models.</a> Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).</li>
<li>Riquelme-Guzman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+development+and+aging+of+the+appendicular+skeleton+in+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Postembryonic development and aging of the appendicular skeleton in Ambystoma mexicanum.</a> Dev Dyn. 251 (6), 1015-1034 (2022).</li>
<li>Gentz, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicine+and+surgery+of+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Medicine and surgery of amphibians.</a> ILAR J. 48 (3), 255-259 (2007).</li>
<li>Lang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+I-based+scaffolds+negatively+impact+fracture+healing+in+a+mouse-osteotomy-model+although+used+routinely+in+research+and+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Collagen I-based scaffolds negatively impact fracture healing in a mouse-osteotomy-model although used routinely in research and clinical application.</a> Acta Biomater. 86, 171-184 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Serra de fio Gigly de 0,66 mm&nbsp;</td><td>RISystem</td>: <td>RIS.590.120</td><td></td></tr><tr><td>7.0 Sutura Optilene&nbsp;</td><td>Braun</td><td>C3090538</td><td></td></tr><tr><td>benzocaína&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>diluir para 0,03%&nbsp; antes de usar</td></tr><tr><td>Butorfanol (Butomidor 10 mg/mL)</td><td>Richter Pharma AG-diluir</td><td></td> <td>para 0,5 mg/L&nbsp; antes de usar</td></tr><tr><td>Broca 0,30 mm</td><td>RISystem</td><td>RIS.590.200</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps - Padrão/Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Broca Manual</td><td>RISystem</td><td>RIS.390.130</td><td>melhor ter pelo menos 3 peças</td></tr><tr><td>Micro CT analisador de dados</td><td>Bruker, Billerica, MA, USA</td><td>SkyScan NRecon software</td><td></td></tr><tr><td>Micro CT specimen scanner</td><td>Bruker, Billerica, MA, USA</td><td>SkyScan 1172&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de íris Moria MC31b - lisa, curva, 10 cm</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11373-12FST</td><td>2 peças</td></tr><tr><td>Broca MouseFix-& Guia de serra 1,75 mm,</td><td>RISystem</td> rígida <td>RIS.301.102</td><td></td></tr><tr><td>Placa MouseFix 4 furos,</td><td>RISystem</td> rígida <td>RIS.401.110</td><td></td></tr><tr><td>Parafuso MouseFix, L =2,00 mm</td><td>RISystem</td><td>RIS.401.100</td><td>precisa de 4 por osso</td></tr><tr><td>Pinça de padrão estreito</td><td>VWR</td><td>FSCI11002-12</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de anel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>bisturi #15</td><td>B Braun, Thermo Fischer Scientific</td><td>5518032</td><td></td></tr><tr><td>Chave de caixa quadrada 0,50 mm</td><td>RISystem</td><td>, RIS.590.111</td><td></td></tr><tr><td>Cera de osso estéril, 2,5 g</td><td>Ethicon, Johnson & Tesoura Fina para</td> Estudantes <td>Johnson W810</td><td></td></tr><tr><td>- Reta/11.5cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>91460-11</td><td></td></tr></tbody></table>

estabilização de uma osteotomia de fêmur com fixação de placa em ambystoma mexicanum

Stabilizing a Femur Osteotomy with a Plate Fixation in Ambystoma mexicanum

O procedimento cirúrgico aqui descrito (Figura 1) dura entre 20 min e 30 min e requer um cirurgião e um assistente. Opcionalmente, use um microscópio de dissecção binocular ou sistema de lupa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66648/66648fig01.jpg"> Figura 1: Esquemas do procedimento cirúrgico e da configuração experimental. (A) O fêmur é exposto por dissecção de pele e afastamento dos músculos do campo cirúrgico. (B) Uma placa de titânio está alinhada com o fêmur. (C) O1º orifício interno é criado usando uma furadeira manual. (D) Um parafuso é colocado no1º orifício. (E) A guia da serra e da broca é inserida e fixada na alça do1º parafuso. (F) O restante dos parafusos é fixado na ordem indicada. (G) A serra e a guia da broca são cuidadosamente removidas e as alças dos parafusos são quebradas ao girar a chave de fenda devido à maior rigidez do osso em comparação com o pescoço do parafuso. (H) A película de segurança e a serra Gigly são colocadas sob o osso. (I) A osteotomia é realizada sob irrigação constante do local de corte. (J) As cabeças dos parafusos são cobertas com cera de abelha de osso estéril antes de substituir o músculo e fechar a pele com pontos. (D,E,F): os números indicam a sequência em que os furos são feitos e os parafusos são colocados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66648/66648fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Atenção especial deve ser dada às etapas de alinhamento placa-osso e fixação da placa (Figura 2). A variação na idade do axolote leva a pequenas diferenças no tamanho, forma e grau de ossificação do fêmur. Assim, em alguns casos, foi um desafio encontrar uma boa posição da placa para garantir espaço suficiente para a fixação do parafuso. No total, a falha de fixação foi observada em 23,5% dos animais, o que pode ser resultado de ossos mais estreitos ou menos ossificados em animais mais jovens (Figura 3). A falha de fixação resultou em um desalinhamento do osso osteotomizado. Isso foi detectado pela presença de parafusos destacados, deslocamento dos fragmentos ósseos com desalinhamento do eixo ósseo de &gt;20° ou deslocamento lateral pronunciado. Enquanto o primeiro pode ser observado durante a colheita das amostras, os outros podem não ser óbvios até que a análise de microCT seja feita. Enquanto nos membros devidamente alinhados, o tecido de granulação estava localizado na lacuna da fratura 3 semanas após a cirurgia, nas amostras desalinhadas, ele parecia muito maior, possivelmente na tentativa de estabilizar o osso.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66648/66648fig02.jpg"> Figura 2: Visão geral do procedimento cirúrgico e animal resultante com osteotomia de membro posterior esquerdo. (A) São apresentadas as principais etapas da cirurgia: exposição do fêmur, alinhamento correto da placa de titânio, utilização de guia de serra para confecção de furos no osso com broca manual e aplicação dos parafusos, uso de película protetora e guia de serra (seta amarela) para osteotomia, Fratura do fêmur de 0,7 mm (seta branca), cobrindo as cabeças dos parafusos com cera de abelha de osso estéril (seta roxa) e o resultado final com membro fechado. (B) Animal após a cirurgia. A seta indica o membro posterior esquerdo, onde foi realizada a cirurgia de osteotomia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66648/66648fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O uso de cera de abelha de osso estéril antes da costura da pele (Figura 2) reduziu a reabertura pós-operatória da pele acima da placa de fixação. O membro permaneceu funcional e pôde ser usado para ficar em pé e andar logo após a remoção da anestesia.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66648/66648fig03.jpg"> Figura 3: Resultados representativos da osteotomia fixada em placa de axolote. (A) MicroCT de fêmures intactos e fraturados. Observe uma lacuna no osso 3 semanas após a fratura. 23,5% dos membros apresentaram falha na fixação, resultando em desalinhamento ósseo. Nas amostras fixadas, o calo duro está se formando em 6-9 meses após a fratura. (B) Coloração Safranin O/Light Green de fêmures intactos e fraturados. Observe uma lacuna com tecido de granulação no osso 3 semanas após a fratura. Aos 6 meses após a fratura, o calo duro consiste em osso e cartilagem tecidos. Barras de escala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66648/66648fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A microCT e a análise histológica (coloração Safranin O/Light Green) permitiram a visualização da posição dos fragmentos ósseos e do tamanho do gap da fratura, bem como o estado de cicatrização óssea. Os dados de microCT foram adquiridos com resolução nominal de 10,05 μm em um scanner de espécimes disponível comercialmente e analisados usando software compatível (ver Tabela de Materiais), conforme descrito em Polikarpova et al.9. Em contraste com os mamíferos, onde a fratura do mesmo tamanho (0,7 mm) é fechada com calo cartilaginoso e ósseo 3-5 semanas após a cirurgia, nenhum calo foi observado 3 semanas após a cirurgia em axolote. Tipicamente, o calo cartilaginoso era visível aos 3 meses de pós-operatório9 e o calo ósseo ossificado - aos 6 meses de pós-operatório (Figura 3).

Estabilização de uma osteotomia de fêmur com fixação de placa em Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged ...

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Biologia

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