Name: Preparação e análise de lâminas histológicas de globos oculares de ratos e camundongos para avaliação da retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a preparar lâminas histológicas de globos oculares de roedores para avaliação da retina. Este protocolo permite visualização clara da retina interna com menos artefatos que outras técnicas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação da espessura da retina e da contagem de camadas de células ganglionares em globos oculares de roedores

<ol><li>Kels, B. D., Grzybowski, A., Grant-Kels, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ocular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human ocular anatomy.</a> Clin Dermatol. 33 (2), 140-146 (2015).</li>
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<li>Lozano, D. C., Twa, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rat+schematic+eye+from+in+vivo+biometry+and+the+correction+of+lateral+magnification+in+sd-oct+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in sd-oct imaging.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).</li>
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<li>Chai, G. R., Liu, S., Yang, H. W., Chen, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+protects+against+diabetic+retinopathy+in+rats+by+inducing+heme+oxygenase-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Quercetin protects against diabetic retinopathy in rats by inducing heme oxygenase-1 expression.</a> Neural Regen Res. 16 (7), 1344-1350 (2021).</li>
<li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+triple+mutated+aav2-bdnf+gene+therapy+in+a+rat+model+of+transient+iop+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Tyrosine triple mutated aav2-bdnf gene therapy in a rat model of transient iop elevation.</a> Mol Vis. 22, 816-826 (2016).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+efficacy+of+neural+stem+cells+originating+from+umbilical+cord-derived+mesenchymal+stem+cells+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Therapeutic efficacy of neural stem cells originating from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in diabetic retinopathy.</a> Sci Rep. 7 (1), 408(2017).</li>
<li>Dorfman, D., Aranda, M. L., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environment+protects+the+optic+nerve+from+early+diabetes-induced+damage+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enriched environment protects the optic nerve from early diabetes-induced damage in adult rats.</a> PLoS One. 10 (8), e0136637(2015).</li>
<li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> J Clin Invest. 102 (4), 783-791 (1998).</li>
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<li>Turner, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+toluidine+blue-phloxinate+staining+of+glycol+methacrylate+sections+of+retina+and+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin toluidine blue-phloxinate staining of glycol methacrylate sections of retina and other tissues.</a> Stain Technol. 55 (4), 229-233 (1980).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+optical+coherence+tomography+and+retinal+histology+in+normal+and+pro23his+retinal+degeneration+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Correlation of optical coherence tomography and retinal histology in normal and pro23his retinal degeneration pig.</a> Transl Vis Sci Technol. 7 (6), 18(2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Acetona&nbsp;</td><td>Chempur&nbsp;</td><td></td><td></td>111024800</tr><tr><td>Pinças Dumont #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm Pontas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td>pinça microcirúrgica pequena</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Mar-Four</td><td>4P.05.2001/L</td><td>Solução aquosa</td></tr><tr><td>Álcool etílico 96 %</td><td>Chempur&nbsp;</td><td>CH.ET. AL.96%CZDA. </td><td></td>CH</tr><tr><td>Álcool etílico 99,9 %</td><td>Chempur&nbsp;</td><td>Ch. ETIL. ALK.99,9%BW</td><td>Utilizar para preparar soluções de 70% e 80% de Geleira EtOH</td></tr><tr><td>- 86 &graus; C Freezer de temperatura ultrabaixa NU-9483E</td><td>NuAire</td><td>13027D0034</td><td>Temperatura de congelamento - 80 &deg; C</td></tr><tr><td>Corredoras de vidro</td><td>Mar-Four</td><td>MI.15.01673</td><td>Corrediças de vidro fosco com um campo fosco de dupla face para descrição</td></tr><tr><td>Leica CV5030 Totalmente Automatizado Glass Coverslipper</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>14,04,78,80,101</td><td>Seladora de slides automatizada</td></tr><tr><td>Hematoxilina de Mayer</td><td>Chempur</td><td></td><td></td>124687402</tr><tr><td>Moldes de base de metal 15 mm&nbsp; x 15 mm</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>3803081</tr><tr><td>Microme HM 340 E</td><td>Thermo Scientific</td><td>90-519-0</td><td>Micrótomo</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear de micrótomo</td><td>Mar-Four</td><td>HI. N.35</td><td>Ângulo de corte 35&deg;</td></tr><tr><td>de biópsia Micro-Twin</td><td>Mar-Four</td><td>LN.13874550</td><td></td></tr><tr><td>Processador de Tecidos Híbrido de Microondas</td><td>Multicorador Milestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica ST5020</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td></td><td>Manchador de lâminas automatizado</td></tr><tr><td>Scanner de lâminas NanoZoomer 2.0-HT</td><td>Hamamatsu</td><td>C9600</td><td>Scanner de lâminas histopatológico</td></tr><tr><td>NDP.view2 Software de visualização de imagens</td><td>Hamamatsu</td><td>U12388-01</td><td>Software de visualização de imagens</td></tr><tr><td>Parafina Pathowax Plus</td><td>Mar-Four</td><td>4P. PWP.010</td><td>Temperatura de fusão 56 > C - 58 &graus; C</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>441244-1KG</td><td>Prepare uma solução a 4% em</td></tr><tr><td>PBS PBS Tablets</td><td>Merck Millipore</td><td>524650-1EA</td><td>Use para preparar uma solução de tampão fosfato salino, de acordo com as instruções do fabricante Tubos de</td></tr><tr><td>Microcentrífuga Pierce, 1,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>Geladeira-freezer EN14000AW</td><td>Electrolux</td><td>925032562-00</td><td>refrigeração 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi</td><td>Swann-Morton</td><td>T.OST. SKAL00.024</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Chempur&nbsp;</td><td></td><td></td>427720906</tr><tr><td>Tesoura de Mola SuperCut, 12.5cm, Curvada</td><td>World Precision Instruments</td><td>501925</td><td>tesoura microcirúrgica pequena e curva</td></tr><tr><td>Fita para seladoras automáticas</td><td>Mar-Four</td><td>KP-3020/SMRH001</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Chempur&nbsp;</td><td>Ch. KSYL.5l.METAL.OP&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação e análise de lâminas histológicas de globos oculares de ratos e camundongos para avaliação da retina

Preparation and Analysis of Histological Slides of Rat and Mouse Eyeballs to Evaluate the Retina

Com o uso do protocolo apresentado, a anatomia e a morfologia de estruturas específicas do globo ocular podem ser avaliadas em detalhes. Nossa equipe se concentra em pesquisar os mecanismos patológicos da neurodegeneração em distúrbios da retina, como glaucoma, retinopatia diabética e retinopatia hipertensiva. Para avaliar as características da neurodegeneração na retina, avaliamos o RT (globo ocular de camundongo - Figura 2, globo ocular de rato - Figura 3), ONL, OPL, INL e IPL (globo ocular de camundongo - Figura 4, globo ocular de rato - Figura 5) e o número de células do GCL (globo ocular de camundongo - Figura 6, globo ocular de rato - Figura 7). Espera-se que o RT e as células do GCL sejam mais altos na retina central e mais baixos na periferia. Ao cortar o globo ocular ao nível da pupila, cortes transversais através da retina central (no pólo posterior do globo ocular) e periférica (perto do corpo ciliar) são obtidos em uma lâmina.
Embora a contagem de células GCL possa ser considerada bastante objetiva, o viés causado pelo corte distorcido pode influenciar os resultados da medição das camadas específicas da retina. Para evitar viés, as medições podem ser apresentadas como a razão entre a espessura de uma determinada camada e o valor de RT: ONL/RT, OPL/RT, INL/RT e IPL/RT.
<img alt="Diagrama de anatomia do olho mostrando partes rotuladas: retina, esclera, lente, córnea, nervo óptico, mácula." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Anatomia do globo ocular. Seção transversal sagital de um globo ocular com a rotulagem de suas maiores estruturas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Imagem microscópica da seção transversal da retina, mostrando camadas de tecido, medição de espessura de 125 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Espessura da retina em um camundongo. Medição da espessura da retina (TR) da membrana limitante externa até a membrana limitante interna no ponto mais largo, marcada com a barra verde. Globo ocular de rato (estirpe: C57Bl/6, idade: 44 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Corte histológico mostrando camadas retinianas, 53,4 μm de espessura; Imagem de microscopia, estudo de tecido." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Espessura da retina em um rato. Medição da espessura da retina (TR) da membrana limitante externa até a membrana limitante interna no ponto mais largo, marcada com a barra verde. Globo ocular de rato (cepa: Lewis, idade: 16 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de seção transversal do tecido retiniano; camadas medidas: IPL, INL, OPL, ONL; análise microscópica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Camadas da retina em um camundongo. Medição da espessura de camadas retinianas individuais: camada nuclear externa (ONL), camada plexiforme externa (OPL), camada nuclear interna (INL) e camada plexiforme interna (IPL), marcadas com barras verdes. Globo ocular de rato (estirpe: C57Bl/6, idade: 44 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Imagem microscópica da seção transversal da retina com camadas marcadas: OPL, ONL, IPL, INL; barra de escala 100 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Camadas da retina em um rato. Medição da espessura de camadas retinianas individuais: camada nuclear externa (ONL), camada plexiforme externa (OPL), camada nuclear interna (INL) e camada plexiforme interna (IPL), marcadas com barras verdes. Globo ocular de rato (cepa: Lewis, idade: 16 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Seção de histologia mostrando estrutura celular em camadas, imagem de microscópio, análise de tecido, escala de 500 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6: Contagem de células da camada de células ganglionares em um camundongo. Método de contagem das células da camada de células ganglionares (GCL) ao longo da retina com um comprimento de 500 μm. Corpos unicelulares foram identificados como corpos redondos corados com hematoxilina localizados dentro da camada de células ganglionares. As células são marcadas com círculos pretos. Globo ocular de camundongo (cepa: DBA/2, idade: 44 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Lâmina histológica, secção transversal da retina; camadas de tecido visíveis; Exame microscópico, escala de 100 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7: Contagem de células da camada de células ganglionares em um rato. Método de contagem das células da camada de células ganglionares (GCL) ao longo da retina com um comprimento de 100 μm. Corpos unicelulares foram identificados como corpos redondos corados com hematoxilina localizados dentro da camada de células ganglionares. As células são marcadas com círculos pretos. Globo ocular de rato (cepa: Lewis, idade: 16 semanas). A barra de escala no canto esquerdo mostra o comprimento de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Preparação e análise de lâminas histológicas de globos oculares de ratos e camundongos para avaliação da retina

A rodent eyeball is a powerful tool for researching the pathomechanisms of many ophthalmic diseases, such as glaucoma, hypertensive retinopathy, and many ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos funcionais dentro da retina e do...

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

Este relatório descreve métodos detalhados para preparar seções congeladas do retina do rato para immunohistochemistry (IHC).  Os métodos descritos incluem dissecção do copo posterior ocular, fixação paraformaldeído, incorporação em meios de temperatura de corte ideal (OCT) e orientação tecidual, corte e imunocoloração.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. Histologia, ensaio de quebra da barreira hemorrânica e angiografia de fluorescência são técnicas valiosas para entender a fisiopatologia da retina, o que poderia aumentar ainda mais o rastreamento eficiente de drogas contra a retinopatia diabética.

Avaliação fisiofisiológica da retina em um modelo de rato

O objetivo deste protocolo é caracterizar um novo modelo de neurodegeneração glaucomatosa baseado na cauterização térmica 360° do plexo vascular limbal, induzindo hipertensão ocular subaguda.

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Este trabalho apresenta um protocolo para microdissecção ocular em roedores. O processo envolve a enucleação do globo ocular junto com a membrana nictitante (ou seja, a terceira pálpebra). Isto é seguido pela separação dos copos oculares posterior e anterior.

Microdissecção do olho de roedores

Modelos murinos podem ser ferramentas úteis para investigar a biologia do epitélio pigmentado da retina (EPR). Foi estabelecido que camundongos podem desenvolver uma série de patologias do EPR. Aqui, descrevemos um protocolo de fenotipagem para elucidar e quantificar patologias do EPR em camundongos usando microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal.

Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

Um protocolo para preparar criossecções de retina de camundongos e realizar imunocoloração em fotorreceptores é descrito. Este artigo permite que os pesquisadores produzam consistentemente seções congeladas de retina de camundongos com morfologia bem preservada e resultados de imunocoloração de alta qualidade.

Crioseccionamento e imunocoloração da retina de camundongos

B7-H1 (PD-L1) e a sua ligação ao PD-1 fornece um sinal induzida por tumor principal imunossupressor no microambiente do tumor. Uma técnica de coloração imuno-histoquímica para caracterizar a expressão e localização de B7-H1 em adenocarcinoma pancreático é descrito aqui.

A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 (PD-L1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas

Aprenda a preparar lâminas histológicas de globos oculares de roedores para avaliação da retina. Este protocolo permite visualização clara da retina interna com menos artefatos que outras técnicas.

Preparação e análise de lâminas histológicas de globos oculares de ratos e camundongos para avaliação da retina

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