Name: Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais pancreáticas de camundongo usando dissociação suave e separação magnética. Este método permite estudar a vascularização pancreática em saúde e doença com alta viabilidade celular.

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<meta charset="utf8"></head><body>Simplificando a extração de células endoteliais pancreáticas de camundongo para estudos de doenças

<table><tbody><tr><td>Eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm prato</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>agulhas 25G</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL eppendorf</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14282300</tr><tr><td>placa de 6 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m coador</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-biotina</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino tratada com choque térmico</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo 1, de pele de bezerro</td><td>Sigma Aldrich& nbsp;</td><td>C9791</td><td>Reagente de fixação no protocolo</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo 1&nbsp;</td><td>Contador</td><td></td> de Células Automático Worthington Bio LS004197 <td></td></tr><tr><td>Countess</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>bisturis de segurança descartáveis</td> de imunofluorescência <td>Myco Instrumentação</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>260913&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2+,Mg2+)</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14080055</tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td>mantida a 37 &deg; C 5% CO2</td></tr><tr><td>LS Colunas</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand com o Separador QuadroMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Médio 199</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas anti-biotina</td><td>Microscópio Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td></td><td>Para avaliar a morfologia celular</td></tr><tr><td>Grau Molecular Água</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Agitador orbital&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>imunofluorescência</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (10X) (sem Ca2+,sem Mg2+)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>Primer 36B4 Forward mouse</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>Primer 36B4 Revese mouse&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Forward mouse&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Reverse mouse</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>Primer Nkx6.1 Reverse mouse&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>Primer Nxk6.1 Mouse para frente</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Mouse para frente</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTCTATGCAAG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Mouse reverso</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATTCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free água</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Estéreil 12" fórceps de comprimento</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps fino estéril</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina estéril</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos 2cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Inibidor</td><td></td> de Tripsina MT25900CI Fisher 15596018 <td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td></td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-Caderina Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>imunofluorescência</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

Seguindo este protocolo, aproximadamente 2 x 106 células vivas podem ser obtidas ao agrupar 3 pâncreas de camundongos e 750.000 células de um único pâncreas de camundongo. Para validar o enriquecimento da CE, realizamos as seguintes análises: 1) PCR quantitativo: em comparação com as amostras de fluxo contínuo (FT) (ou seja, as frações ligadas ao anticorpo não CD31), as frações de CE apresentaram níveis significativamente mais altos de Pecam1 (codificando CD31) e Kdr (codificando VEGFR2), dois genes marcadores de CE33 e níveis mais baixos de NK6 homeobox 1 (Nkx6.1), um fator de transcrição nas células endócrinas pancreáticas (Figura 4A); 2) western blotting: amostras enriquecidas com CE de três preparações (pEC-1-3) mostraram fortes sinais de CD31 no tamanho esperado (~ 130 kDa). Em comparação, as amostras de entrada e FT mostraram sinal mínimo de CD31. Como controle positivo, os lisados de células MS1, uma linhagem celular pEC, também apresentaram forte sinal de CD31 (Figura 4B); 3) coloração com azul de tripano: verificamos que a viabilidade das células isoladas foi de cerca de 50% (Figura 4C); 4) citometria de fluxo seguindo um protocolo publicado15 : por meio de gating na população de células vivas (Figura 4D), descobrimos que as células CD31+ estavam em 88% e as células TdTomato+ estavam em 76%. É importante notar que a maioria das células isoladas co-expressa CD31 e TdTomato (Figura 4E). Como controles negativos, as células MS1 não coradas e MS1 incubadas com IgG não apresentaram células vivas marcadas por CD31. Como controle positivo, ou seja, as células MS1 coradas para CD31 apresentaram cerca de 100% de células CD31+ vivas (Figura 4F). Também cultivamos as células isoladas, realizamos a coloração por imunofluorescência de PECAM1 seguindo um protocolo publicado36 e imageamos o TdTomato, que mostrou sinais robustos de ambos os marcadores nas células isoladas, sugerindo a presença de CEs (Figura 4G).
<img alt="Diagrama do pâncreas ilustrando CEs intra-ilhotas para estudo da estrutura vascular e análise da interação celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Ilustração da vascularização do pâncreas e ilhotas pancreáticas. Uma representação pictórica das células endoteliais pancreáticas (CEs) e CEs intra-ilhotas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de pâncreas unicelular; centrifugação, marcação de CD31-biotina, análise de fluxo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Visão geral do fluxo de trabalho. 1) Dissecção do pâncreas, 2) digestão mecânica, 3) incubação enzimática, 4) centrifugação, 5a) remoção do sobrenadante e 5b) digestão secundária de colagenase dos pellets celulares com trituração para filtragem em 6), 7) e 8) reconstituição do pellet e ligação de anticorpos, 9) incubação de microesferas, 10) enriquecimento da coluna MACS, 11) contagem de células para viabilidade e 12) análise a jusante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Dissecção de tecido mostrando o processo de colheita, isolamento e corte do pâncreas em pesquisa biológica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Etapas do processamento de tecidos. Imagens de (A) a cavidade abdominal, (B) o pâncreas de camundongo isolado e (C) o pâncreas de camundongo aparado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Expressão gênica, análise de CD31, DAPI, classificação celular, fluorescência e resultados de citometria de fluxo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Validação de frações de EC isoladas do pâncreas de camundongo. (A) qPCR de amostras de FT e fração de EC enriquecida com CD31 para enriquecimento. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) e Nkx6.1 (fator de transcrição específico de β células pancreáticas)33. * denota p &lt;0,05 em comparação com FT com base em testes t . n = 3-4 amostras agrupadas, consistindo de 3 camundongos cada. (B) Western blotting de CD31. pEC-1-3 indicam CEs enriquecidos de 3 amostras separadas de camundongos agrupados. Lisados celulares de 30 mg foram carregados em cada pista, seguidos pela coloração S de Ponceau. (C) Contagem de células e coloração com azul de tripano de pECs enriquecidos para ensaio de viabilidade. (D) Estratégia de gating por citometria de fluxo para pECs de camundongos corados por 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e anticorpo CD31. (E) Histogramas de citometria de fluxo de MS1 não corado (canto superior esquerdo), MS1 corado com anticorpo secundário AlexaFluor-488 (controle IgG; canto superior direito), MS1 corado com CD31 (canto inferior esquerdo) e os pECs de camundongo isolados corados com CD31 (canto inferior direito). (F) Porcentagem de células vivas quantificadas por citometria de fluxo. (G) Imunofluorescência da expressão de CD31 (verde) com contracoloração DAPI (azul) e repórter fluorescente TdTomato endógeno (vermelho). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Microscopia de imunofluorescência CD31/CD144/DAPI, análise da expressão gênica UMAP de Cdh5, Pecam1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Especificidade de CD31 e CD144 no pâncreas de camundongo. (A) Imunofluorescência do pâncreas de camundongo com CD31 (Magenta) e CD144 (Ciano), com contracoloração DAPI. Imagem capturada usando uma lente de 10x sob um microscópio invertido fluorescente de campo amplo. Barra de escala = 100 μm. Linhas tracejadas demarcam a área da ilhota. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) mostrando a expressão de Cdh5 e Pecam1 nas ilhotas CEs de camundongos C57BL6 detectados por scRNA-seq (GSE128565)37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Enzima</td>
			<td>Usar</td>
			<td>Temperatura e Tempo</td>
			<td>Referência</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenase I</td>
			<td>Dissociação de célula única, enriquecimento de EC do pâncreas inteiro</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>Este protocolo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenase IV</td>
			<td>Isolamento de ilhotas e dissociação não enzimática</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenase + Tripsina</td>
			<td>Examinando células ductais no pâncreas de camundongos</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenase B</td>
			<td>Suspensão unicelular do pâncreas</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenase NBI</td>
			<td>Isolamento de ilhotas</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenase P</td>
			<td>Acinar suspensão viável</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenase XI</td>
			<td>Isolamento de ilhotas</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exibir</td>
			<td>Suspensão unicelular</td>
			<td>37 °C, 45 min</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Suspensão unicelular</td>
			<td>37 °C, 10 min</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsina</td>
			<td>Dissociação de célula única, pâncreas inteiro</td>
			<td>4 °C, O/N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Resumo de vários protocolos usados para processar amostras de pâncreas de camundongos.

Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

isolation-of-mouse-pancreatic-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de ilhotas de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produzem hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. Este protocolo explica um método para isolar ilhotas pancreáticas pela primeira vez perfundindo colagenase via ampola de Vater para digerir o tecido pancreático exócrino e uma centrifugação simplificada com gradiente de densidade para purificar as ilhotas de camundongos.

Isolamento de ilhotas pancreáticas por meio de perfusão de colagenase: um método enzimático para isolar células de ilhotas pancreáticas

Nesta publicação, é descrito um procedimento rápido e conveniente para o isolamento e cultura de células acinares pancreáticas primárias do pâncreas murino. Este método constitui uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia das células primárias normais do pâncreas fresco / não transformada exócrinas.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Este protocolo está preparado para compartilhar nosso método de isolamento de células endoteliais coronárias de camundongos para fins de imagem ou para conduzir experimentos biológicos moleculares.

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar células de ilhotas pancreáticas do mouse para as induções ROS de triagem pelos xenobióticos para identificar os potenciais químicos xenobióticos de diabetogenic.

Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Neste artigo, células endoteliais primárias do pulmão foram isoladas e cultivadas de camundongos neonatais.

Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Aprenda a isolar células endoteliais pancreáticas de camundongo usando dissociação suave e separação magnética. Este método permite estudar a vascularização pancreática em saúde e doença com alta viabilidade celular.

Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

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