Name: Diagnóstico baseado em CRISPR no local de atendimento com reagentes pré-misturados e liofilizados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a desenvolver diagnóstico CRISPR no local de atendimento com reagentes pré-misturados e liofilizados para detecção de doenças infecciosas. Este método simplificado reduz riscos de contaminação e oferece alta sensibilidade.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo de diagnóstico molecular baseado em CRISPR otimizado para uso no local de atendimento

<ol><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a%2FC2c2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics.</a> Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).</li>
<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and classification of CRISPR-Cas systems.</a> Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Arizti-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Cas13-based+assays+for+the+fast+identification+of+SARS-CoV-2+and+its+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants.</a> Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+Cas13-based+assay+with+point-of-care+attributes+for+simultaneous+COVID-19+diagnosis+and+variant+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance.</a> CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+Cas13-based+assay+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA.</a> Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li>
<li>Myhrvold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-deployable+viral+diagnostics+using+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13.</a> Science. 360 (6387), 444-448 (2018).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+detection+with+CRISPR%2FCas+system+from+applications+to+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges.</a> Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13a-based+detection+for+bovine+viral+diarrhea+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus.</a> Front Vet Sci. 8, 603919(2021).</li>
<li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHERLOCK%3A+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li>
<li>Selvam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-LAMP+CRISPR-Cas12%2F13-based+SARS-CoV-2+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods.</a> Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).</li>
<li>Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+visually+readable+loop-mediated+isothermal+reverse+transcriptase+nucleic+acid+amplification+test+for+detection+Ebola+Zaire+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA.</a> J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).</li>
<li>Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostic+with+CRISPR%2FCas%3A+Beyond+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).</li>
<li>Twistamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Twistamp%C2%AE+assay+design+manual%22">Twistamp® assay design manual</a>. , (2023).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+isothermal+amplification+assay+for+viral+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An enhanced isothermal amplification assay for viral detection.</a> Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).</li>
<li>Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%3A+Challenges+and+toward+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACSSynth+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications.</a> ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).</li>
<li>Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+DNA-free+RNA+for+use+in+vaccine+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies.</a> Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+strand-displacement+DNA+amplification+by+a+contactless+electrochemical+microsystem+using+interdigitated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes.</a> Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).</li>
<li>Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+molecular+enhancers+of+the+isothermal+exponential+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction.</a> Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+test+kit+for+visual+loop-mediated+isothermal+amplification+of+Salmonella+in+spiked+ready-to-eat+fruits+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables.</a> J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).</li>
<li>Curti, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+lyophilized+CRISPR-Cas12+assay+for+a+ensitive%2C+specific%2C+and+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Viruses. 13 (3), 420(2021).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+with+SHERLOCK+one-pot+testing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing.</a> N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).</li>
</ol>

O diagnóstico baseado em CRISPR para a detecção de biomarcadores de ácidos nucleicos foi relatado pela primeira vez em 2017 1,2,3,4 e, desde então, foi comprovado como diagnóstico de última geração com testes aprovados pela Food and Drug Administration (FDA), particularmente para a detecção de RNA do Coronavírus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), em vários países 5,6,7,8. Além da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), as tecnologias demonstraram ser eficazes para detectar diversos vírus e bactérias 9,10,11,12,13, mutações e deleções de doenças genéticas e podem ser projetadas para detectar biomarcadores de proteínas e pequenas moléculas 2,12. Os diagnósticos baseados em CRISPR geralmente combinam métodos de amplificação isotérmica - como amplificação da polimerase recombinase (RPA) ou amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) 14 , 15 - com detecção baseada em CRISPR usando enzimas associadas a CRISPR (Cas) guiadas por RNA com atividade de endonuclease "colateral" após o reconhecimento do alvo3. O uso duplo de amplificação isotérmica e detecção baseada em CRISPR confere vários atributos desejáveis às tecnologias, particularmente alta precisão diagnóstica próxima à da reação em cadeia da polimerase (PCR) padrão-ouro e capacidade de multiplexar e detectar pequenas diferenças de sequência, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único 1,9.
As versões mais precisas do diagnóstico baseado em CRISPR, no entanto, contêm vários componentes e etapas e podem ser complicadas de executar com não especialistas ou no ponto de atendimento (POC). Para enfrentar esse desafio de estender o uso de diagnósticos baseados em CRISPR altamente precisos para configurações de POC, desenvolvemos protocolos para preparar amplificação isotérmica baseada em recombinase pré-misturada, liofilizada e reações de detecção baseadas em CRISPR, que são fáceis de usar e armazenar7. Esses protocolos devem complementar os excelentes protocolos existentes sobre diagnósticos baseados em CRISPR14, que contêm informações adicionais sobre a produção de componentes bioquímicos necessários para diagnósticos baseados em CRISPR7, diretrizes de design1 e formulações usando técnicas alternativas de amplificação isotérmica 2,14,15,16 e enzimas Cas12. Em última análise, esperamos que os diagnósticos baseados em CRISPR possam ajudar a realizar a detecção nucleica rápida, barata e sensível em ambientes onde análises portáteis e sem instrumentais são necessárias 1,9,17.
Usamos principalmente a combinação de detecção baseada em RPA e Cas13 em nossos protocolos. O RPA funciona em temperaturas próximas ao ambiente (37-42 °C) e, portanto, tem baixos requisitos de energia e equipamentos. Outras reações de amplificação isotérmica requerem temperaturas mais altas (LAMP, 60-65 °C; amplificação de deslocamento de fita (SDA), 60 °C; reação de amplificação exponencial (EXPAR), 55 °C; e amplificação dependente de helicase (HDA), 65 °C)2. O design dos primers RPA também não é complexo, ao contrário dos primers LAMP, e pode ser estendido para amplificação multiplexada 7,9,14. Embora a multiplexação além de dois alvos com RPA seja difícil na prática, existem diretrizes claras sobre como projetar primers de RPA multiplexados para minimizar a interferência18.
Embora a contaminação por transferência continue sendo um grande problema no fluxo de trabalho de duas etapas, os amplicons gerados de RPA são pequenos em tamanho e menos propensos a causar contaminação por transferência em comparação com grandes amplicons concateméricos do LAMP14. Os primers RPA podem ser projetados de acordo com as diretrizes padrão14: eles geralmente têm 25-35 nucleotídeos de comprimento com temperaturas de fusão de 54 a 67 °C. O tamanho do amplicon deve ser menor que 200 pares de bases. A enzima transcriptase reversa (RT) pode ser adicionada ao RPA para permitir a amplificação do RNA, e na transcrição reversa-RPA (RT-RPA), outra enzima Ribonuclease H (RNase H) é normalmente adicionada em pequenas quantidades para ajudar a resolver o RNA: DNA híbrido resultante e promover a reação de amplificação 5,19. Para permitir a transcrição de T7 para detecção baseada em Cas13, o promotor da RNA polimerase T7 pode ser colocado na extremidade 5' do primer RPA direto.
Depois que os amplicons são gerados a partir do RPA, eles podem ser detectados com enzimas Cas programadas por crRNA. Entre as várias enzimas Cas que podem ser usadas para detecção de amplicon, preferimos variantes Cas13 direcionadas a RNA devido à sua alta atividade de clivagem1 e preferências de clivagem de polinucleotídeos bem caracterizadas 7,9, a última das quais pode ser usada para detecção multiplexada. A sequência de crRNA para Cas13 é projetada para ser complementar (complemento reverso) ao local alvo no RNA produzido com sequências espaçadoras e de repetição direta (DR). A sequência de crRNA e os primers RPA não devem se sobrepor, para evitar a detecção indesejada baseada em Cas de produtos de amplificação fora do alvo, o que aumenta o fundo e os falsos positivos14.
A detecção baseada em Cas depende de diferentes modalidades de detecção para monitorar a clivagem de moléculas de ácido nucleico repórter (repórteres de RNA para reações baseadas em Cas13) 1 , 2 , 14 . Diferentes modalidades de detecção incluem colorimetria, leituras eletroquímicas, fluorescência, leituras de sequenciamento e tiras de fluxo lateral2. Nós nos concentramos na leitura de fluorescência dada uma variedade de fluoróforos e repórteres, como cianina 5 (Cy5), rodamina X (ROX) e carboxifluoresceína (FAM), que podem ser efetivamente excitados usando uma única fonte de luz LED azul, e sua fluorescência analisada por um leitor de microplacas ou um termociclador em tempo real 7,14. Além disso, a leitura de fluorescência é fácil de configurar e permite monitoramento contínuo, o que permite a quantificação em tempo real. A pré-amplificação multiplexada de RPA e a detecção multiplexada baseada em Cas13 usando enzimas Cas podem ser combinadas com leituras de fluorescência multicoloridas para a detecção simultânea de múltiplos alvos genéticos 2,7.
Em nossos protocolos, primeiro amplificamos isotermicamente o RNA com RT-RPA adicionando a amostra de RNA à forma liofilizada do reagente RT-RPA (Figura 1). Durante o RT-RPA, o promotor T7 é adicionado ao amplicon de DNA de fita dupla gerado. Em seguida, os produtos RPA são transferidos para a detecção liofilizada baseada em Cas13, que também contém RNA polimerase T7. Esta reação de detecção converterá amplicons de DNA em RNA (via T7 RNA polimerase), que pode ser prontamente detectada com Cas13 programada por crRNA. O Cas13 ativado por alvo clivaria as moléculas repórter para produzir um sinal de fluorescência detectável 2,7,14. Embora os protocolos aqui pertençam à detecção por Leptotrichia wadei (LwaCas13a), eles podem ser estendidos para detecção simultânea e multiplexada de até quatro alvos usando enzimas ortogonais Cas13 e Cas12 7,9. As reações de detecção baseadas em RPA e Cas também podem ser combinadas em um único tubo, embora com perda de sensibilidade14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig01v2.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho de detecção baseado em CRISPR. O fluxo de trabalho ilustra a detecção de dois genes-alvo. Primeiro, as regiões de interesse dentro do alvo de DNA são amplificadas isotermicamente com RPA; a reação pode ser realizada com transcrição reversa (RT-RPA) ao detectar alvos de RNA. Depois disso, a transcrição T7 converte amplicons de dsDNA em RNAs, que por sua vez são reconhecidos por complexos Cas13-crRNA capazes de provocar atividade colateral de RNase após a ligação ao alvo. A clivagem de repórteres de fluorescência temperada produz sinais de fluorescência que podem ser monitorados usando um leitor de microplacas, visualizados por um transiluminador de LED ou usados com um termociclador em tempo real. Abreviaturas: CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; TR = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; Cas = proteína associada a CRISPR; LED = diodo emissor de luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As principais características dos protocolos apresentados aqui são as formulações de pré-mistura para liofilização. A pré-mistura simplifica o uso da reação e aumenta a reprodutibilidade, mas muitos componentes dentro da detecção baseada em RPA e Cas - particularmente a transcrição reversa e alguns cofatores lábeis, como o ATP, não são estáveis em solução. Portanto, formulamos as soluções pré-misturadas de forma que possam ser liofilizadas para armazenamento de longo prazo e fácil transporte e implantação 1,9,20. Reagentes liofilizados pré-misturados também ajudam a melhorar a sensibilidade de detecção, pois maior volume de amostra (e, portanto, maior entrada de DNA / RNA) pode ser adicionado para reconstituir a reação10. Em nossas formulações, usamos principalmente trealose21 como crioprotetor em reações de detecção liofilizadas de RPA e Cas7. Além da preservação do reagente, a trealose também promove as reações por meio do aumento da estabilização enzimática 16,22,23,24 e da diminuição das temperaturas de fusão do dsDNA 23. Explorações de outros estabilizadores 5,7,21,25,26 além da trealose podem produzir formulações ainda mais ideais para diferentes cenários de uso.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte>Solução de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>betaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Água tratada com DEPC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Merck</td><td>3870-25GM</td><td></td></tr><tr><td>EpiScript transcriptase reversa</td><td>Lucigen</td><td>ERT12925K</td><td></td></tr><tr><td>Gly-Gly-Gly& nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-50239-1G</td><td></td></tr><tr><td>LwaCas13a</td><td>Produzindo internamente</td><td></td><td>Nome da cepa: Leptotrichia wadei, Abreviatura: Lwa, Nome da proteína: LwaCas13a</td></tr><tr><td>Solução de cloreto de magnésio, 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>NxGenT7 RNA polimerase</td><td>Lucigen</td><td>30223-2</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilenoglicol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acetato de potássio, 5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95843-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Riobnucleotide Solution Mix</td><td>NEB</td><td>N0466L</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>TCI</td><td>TCI-S0111-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trealose Dihidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-90210-50G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloridrato de Trizma, 1M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Kit básico</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BluPAD Dual LED Transiluminador de luz azul/branco</td><td>Bio-Helix</td><td>BP001CU</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath Dual Block</td><td>ELITE</td><td>4-2-EL-02-220</td><td>Modelo: EL-02</td></tr><tr><td>Microplaca de fluorescência leitor</td><td>Tecan</td><td>30050303</td><td>Modelo: Secador de congelamento Infinite 200 Pro</td></tr><tr><td></td><td>LABCONCO</td><td>794001030</td><td>FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer</td></tr><tr>Microplaca <td>Greiner</td><td>de 384 poços</td><td>GDE0784076</td><td>F-Bottom, pequeno volume, Hibase, Med. Encadernação, Preto</td></tr><tr><td>Termociclador em tempo real (Sistema de PCR em tempo real CFX Connect)</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5201</td><td>Modelo: Módulo CFX Connect Optics</td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>s-gene forward RPA</td><td>primer IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA</td></tr><tr><td>s-gene reverse RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG</td></tr><tr><td>n-gene forward RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG</td></tr><tr><td>primer RPA reverso do gene</td><td>n IDT</td><td></td><td>CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA para o gene s</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGACUAAAACGCAGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA para o gene n</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGACUAAAAAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC</td></tr><tr><td>FAM-polyU-IABkFQ repórter</td><td>IDT</td><td></td><td>56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_F RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_R RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA</td></tr><tr><td>synT7crRNA13a_ O_hannah&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC</td></tr></tbody></table>

diagnóstico baseado em crispr no local de atendimento com reagentes pré-misturados e liofilizados

Point-of-care CRISPR-based Diagnostics with Premixed and Freeze-dried Reagents

Destacamos a cinética da geração do sinal de fluorescência FAM a partir da detecção combinada dos genes s e n do SARS-CoV-2 e como as informações foram usadas para determinar as condições ideais para formulações de reação pré-misturadas liofilizadas. Em todos os casos, incluímos amostras com valores de Ct bem dentro do limite de detecção determinado (LoD) (Ct ~ 31-33), bem como aquelas com Ct no LoD (Ct ~ 35-37)7, para permitir a diferenciação de protocolos com melhor sensibilidade.
Para RT-RPA liofilizado e pré-misturado, descobrimos que a inclusão de KOAc na reação pré-misturada afetou negativamente a sensibilidade da reação (Figura 2A). Portanto, omitimos o KOAc da reação pré-misturada e o adicionamos com o iniciador da reação, Mg (OAc) 2, uma vez que a amostra de RNA foi adicionada. Também usamos ensaios semelhantes para determinar a concentração ideal de um crioprotetor trealose (Figura 2B) e os efeitos da triglicina7 na reação RT-RPA liofilizada (Figura 2C). Portanto, reações RT-RPA pré-misturadas e liofilizadas ideais foram preparadas com trealose a 6%, sem KOAc (mas foi adicionado posteriormente após a amostra de RNA) e suplementadas com triglicina, conforme descrito na seção 1 do protocolo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig02.jpg"> Figura 2: Otimizando reações RT-RPA liofilizadas e pré-misturadas. A reação RT-RPA foi preparada usando primers direcionados ao gene n do SAR-CoV-2. Mg(OAc)2 foi excluído de todas as reações pré-misturadas. Foram avaliados os efeitos de (A) KOAc, (B) trealose e (C) triglicina adicionados às reações pré-misturadas. O monitoramento da reação por meio da fluorescência FAM gerada foi realizado usando um termociclador em tempo real ou um leitor de microplacas de fluorescência. Dados individuais de medições triplicadas são mostrados. Abreviaturas: RT = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; Cas = proteína associada a CRISPR; SAR-CoV-2 = Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus 2; Ct = limiar do ciclo; FAM = carboxifluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para reações liofilizadas e pré-misturadas à base de Cas13a, verificamos a importância de ter o crioprotetor correto: trealose a 6% ou sacarose a 2%19 funcionaram bem, enquanto a sacarose a 1% ou 5% p/v PEG20000 não preservou a eficiência da reação após a liofilização (Figura 3). O MgCl2 foi omitido de todas as reações e adicionado na etapa de reidratação. A reação de detecção baseada em Cas13 liofilizada ideal foi preparada com trealose a 6%, conforme mostrado na seção 2 do protocolo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig03.jpg"> Figura 3: Otimizando reações de detecção baseadas em Cas13 liofilizadas e pré-misturadas. A reação de detecção foi realizada a 37 °C usando o produto RPA do gene SARS-CoV-2 n. Os testes foram feitos antes e após a liofilização. O MgCl2 foi excluído de todas as reações pré-misturadas. Foram avaliadas as habilidades de (A) trealose, (B) PEG20000 e (C) sacarose em preservar a eficiência da reação após a liofilização. O monitoramento da reação por meio da fluorescência FAM gerada foi realizado usando um termociclador em tempo real. São mostrados dados individuais de medições triplicadas para as condições "após a liofilização" e uma réplica das condições "antes da liofilização". A Figura 3A,B foi retirada de Patchsung et al.7. Abreviaturas: RPA = amplificação da polimerase recombinase; SAR-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2; FAM = carboxifluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os reagentes liofilizados e pré-misturados para reações baseadas em RT-RPA e Cas13 são estáveis a -20 ° C por pelo menos 8 meses [Figura 4].
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig06.jpg"> Figura 4: Testes de estabilidade de reagentes RPA e CRISPR-Cas13a liofilizados e pré-misturados a -20 °C. Teste de estabilidade em (A) 30 dias, (B) 45 dias, (C) 3 meses, (D) 5 meses, (E) 8 meses. Dados individuais de medições triplicadas são mostrados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O LoD de reações liofilizadas baseadas em RT-RPA e Cas13 para a detecção dos genes s e n do SARS-CoV-2 é mostrado na Figura 5. A cinética de geração de sinal pode ser melhorada na detecção de dois genes em comparação com quando apenas um gene é detectado.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig04.jpg"> Figura 5: Sensibilidade analítica da detecção de gene único versus gene duplo. (A) O LoD de RT-RPA singleplex liofilizado e detecção baseada em Cas visando o gene s do SAR-CoV-2. (B) O LoD de RT-RPA singleplex liofilizado e detecção baseada em Cas visando o gene n do SAR-CoV-2. (C) O LoD de RT-RPA multiplex liofilizado e detecção dupla baseada em Cas visando os genes s e n . O LoD foi determinado usando RNAs SARS-CoV-2 diluídos em série, cujos valores de Ct foram determinados usando um ensaio RT-qPCR direcionado ao gene n . São mostrados dados individuais de 3-6 medições replicadas. Abreviaturas: LoD = limite de detecção; TR = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; Cas = proteína associada a CRISPR; SAR-CoV-2 = Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus 2; Ct = limiar do ciclo; qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Além da detecção de vírus, apresentamos um protótipo de uma ferramenta de genotipagem POC baseada no diagnóstico CRISPR, para ajudar a identificar espécies de cobras venenosas endêmicas da Tailândia (Figura 6). A identificação mais rápida e precisa de espécies de serpentes por meio de amostras de DNA coletadas de feridas de mordidas pode ajudar na administração imediata de antivenenos, melhorando a chance de sobrevivência do paciente. Visamos regiões dentro do gene mitocondrial do citocromo b (cytb) de oito espécies de cobras, incluindo Ophiophagus hannah (King cobra) (Figura 6A) e mostramos que a detecção de substitutos de DNA sintético do gene O. hannah cytb pode atingir o nível attomolar de sensibilidade (Figura 6B, C).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig05.jpg"> Figura 6: Um protótipo para detecção baseada em CRISPR para identificar espécies de cobras de envenenamento por picada de cobra. (A) Primers RPA e design de crRNA LwaCas13a para a detecção do gene cytb de Ophiophagus hannah. O promotor T7 (saliência T7) foi colocado na extremidade 5' do primer RPA dianteiro. (B) Cinética da geração de sinal FAM ao longo de 60 min e (C) fluorescência FAM final da detecção mediada por LwaCas13a de entradas sintéticas de dsDNA correspondentes aos segmentos do gene cytb de O. hannah. Diferentes concentrações de entrada (0, 10-9, 10-12, 10-15 e 10-18 M) foram usadas. Os dados são ± média dp de medições triplicadas. Abreviaturas: RPA = amplificação da polimerase recombinase; CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; Cas = proteína associada a CRISPR; FAM = carboxifluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="5">Liofilização de reagentes de detecção pré-misturados CRISPR-Cas13a</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Passo</td>
			<td>Taxa de rampa</td>
			<td>Temperatura da prateleira</td>
			<td rowspan="2">Tempo (hh:mm)</td>
			<td>Vácuo</td>
		</tr><tr><td>(°C/min)</td>
			<td>(°C)</td>
			<td>(mbar)</td>
		</tr><tr><td>Congelar 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>desligado</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Seco 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>desligado</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Seco 2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>01:00</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Seco 3</td>
			<td>3</td>
			<td>20</td>
			<td>∞</td>
			<td>0</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Configurações de liofilizador de reagentes de detecção RT-RPA e CRISPR-Cas13a pré-misturados. Abreviaturas: RT = transcrição reversa; RPA = amplificação da polimerase recombinase; CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; Cas = proteína associada a CRISPR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Parâmetro</td>
			<td>Ambiente</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Temperatura</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Ciclo cinético</td>
			<td>Tempo de duração</td>
			<td>02:00 (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td>Intervalo de tempo</td>
			<td>02:30 (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Trêmulo</td>
			<td>Tempo de duração</td>
			<td>1 segundo</td>
		</tr><tr><td>Modo</td>
			<td>Linear</td>
		</tr><tr><td>Amplitude</td>
			<td>1 milímetro</td>
		</tr><tr><td>Intensidade de fluorescência</td>
			<td>Comprimento de onda de excitação</td>
			<td>488 milhas náuticas</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Comprimento de onda de emissão</td>
			<td>520 nm</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Modo</td>
			<td>Início</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Posição Z</td>
			<td>24470</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Ganhar</td>
			<td>71</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Tempo de integração</td>
			<td>20 μs</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Número de intermitências</td>
			<td>25</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Programa leitor de microplacas de fluorescência para detecção de ácidos nucleicos.

Diagnóstico baseado em CRISPR no local de atendimento com reagentes pré-misturados e liofilizados

Molecular diagnostics by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-based detection have high diagnostic accuracy and attributes ...

point-care-crispr-based-diagnostics-with-premixed-freeze-dried

Research

JoVE Journal

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Bioengenharia

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