Name: Eletroporação In Vivo Combinada e Reinervação de Curto Prazo do Músculo Esquelético do Elevador do Crânio Longo do Auris (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Aprenda eletroporação in vivo e desnervação do músculo LAL em camundongos CF-1 para investigar proteínas musculares na regeneração sináptica neuromuscular. Este protocolo minimamente invasivo permite analisar a estabilidade dos receptores de acetilcolina pós-sinápticos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Eletroporação e lesão nervosa no músculo elevador do auro longo do camundongo

<ol><li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of motor nerve terminals.</a> Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).</li>
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<li>Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transfection+of+mammalian+skeletal+muscles+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation.</a> J Vis Exp. (32), e1520(2009).</li>
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<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#5/45 Fórceps Dumont&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>anti 2H3</td><td>DSHB</td><td></td><td>Diluir 1: 300</td></tr><tr><td>anti S100 Pronto para usar</td><td>Dako</td><td>IR504</td><td>Diluir 1: 5</td></tr><tr><td>anti SV2</td><td>DSHB</td><td></td><td>Diluir 1: 50</td></tr><tr><td>Gluconato de clorexidina 2%</td> <td>DifenPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio de dissecação de luz fria</td><td>Modelo Motic</td><td>SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Dilute 1 : 100</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11252-00</td><td>Esterilize antes de usar</td></tr><tr><td>Mini Fórceps Dumont - ndash; Ferramentas</td> de <td>Belas Ciências Style</td> 5<td>11200-14</td><td>Esterilize antes de usar</td></tr><tr><td>ECM 830 eletroporador</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos tipo agulha dourada&nbsp;</td><td>Genetrodes, BTX</td><td>45-0114</td><td>Seringa Hamilton reta de 10 mm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia por inalação</td><td>SciVerma Scientific</td><td>M3000 Isoflurano de mesa</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Baxter</td><td>218-082</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos</td><td>Instituto de Salud Publica - Chile</td><td></td><td>Camundongos CF-1 adultos (3-6 meses de idade), de ambos os sexos (30-45 g)&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Schick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura Glicosorb 5/0</td><td>TAGUM</td><td>GS0812. J</td><td>Fio de ácido poliglicólico absorvível&nbsp;</td></tr><tr><td>tdTomato plasmid</td><td>Addgene</td><td>54642</td><td>tdTomato plasmid sob o controle do promotor CMV</td></tr><tr><td>Cloridrato de tramadol 5% (Triamcol)</td><td>Drag Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>91500-09</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>WGA Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>W7024</td><td>Diluir</td></tr><tr><td>&alfa;-BTX Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>B13422</td><td>Diluir 1 : 500</td></tr></tbody></table>

eletroporação in vivo combinada e reinervação de curto prazo do músculo esquelético do elevador do crânio longo do auris

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

O alto rendimento quântico de fluorescência da proteínatdTomato 20 a torna um marcador apropriado para a eficiência da eletroporação. Portanto, a expressão da proteína tdTomato nos músculos LAL por eletroporação in vivo foi avaliada (Figura 1). Os músculos LAL foram dissecados 21 dias após a eletroporação. As preparações de montagem inteira mostram a fina banda caudal (cLAL, polígono ciano) do músculo LAL com suas duas regiões de inervação, e a banda rostral espessa (rLAL, polígono amarelo) com suas cinco regiões de inervação 8,10 (Figura 1B). De acordo com o local de injeção de DNA e o posicionamento dos eletrodos, uma alta proporção de fibras musculares, especificamente da porção rLAL, foi positiva para a expressão de tdTomato (Figura 1B). As criossecções transversais foram realizadas conforme descrito16 para avaliar a eficiência do procedimento (Figura 1C). A quantificação mostra 66,70% ± 5,95% de fibras positivas para a expressão de tdTomato (Figura 1D). Em seguida, para avaliar o dano às fibras musculares, a membrana muscular foi marcada com WGA e os núcleos com DAPI (Figura 1C) para identificar a presença de núcleos centrais (cabeças de setas) como sinal de ciclos de dano/regeneração. Não foram encontradas diferenças significativas na porcentagem de fibras com núcleos centrais entre os músculos controle e eletroporado LAL (Figura 1E).
O esmagamento do ramo auricular posterior do nervo facial desnerva o músculo LAL6 (Figura 2A). Os músculos LAL de camundongos controle e de camundongos 5 dias, 10 dias e 60 dias após a lesão nervosa foram dissecados, fixados e corados usando métodos descritos anteriormente16,21. Resumidamente, o anticorpo SV2 marca vesículas sinápticas e é usado em conjunto com o anticorpo 2H3 contra neurofilamentos para revelar todo o domínio pré-sináptico 6,16,22,23,24. O anticorpo S100B foi usado para corar as células de Schwann, enquanto o α-BTX detectou AChRs pós-sinápticos. A microscopia confocal mostrou denervação completa da JNM 5 dias após a lesão nervosa (Figura 2B). Os domínios pós-sinápticos parecem ser reinervados 10 dias após a lesão nervosa (Figura 2B). Após 60 dias (Figura 2B), as NMJs regeneradas exibiram um fenótipo semelhante ao controle.
Finalmente, o uso combinado de protocolos de eletroporação in vivo e esmagamento do nervo facial foi testado. Para isso, os músculos LAL foram eletroporados com um vetor expressando a proteína tdTomato e, 3 dias depois, foi realizada lesão nervosa. Após 9 dias, o músculo LAL foi dissecado, fixado e corado para revelar os domínios pré e pós-sinápticos da JNM (Figura 3A). A expressão da proteína tdTomato nas fibras musculares, juntamente com as JNMs desnervadas (ponta de seta verde) e reinervadas (setas amarelas), pode ser observada (Figura 3B). A quantificação revelou que 58,37% ± 4,63% das fibras são positivas para a expressão de tdTomato (Figura 3C, barra esquerda), enquanto 47,00% ± 10,69% dos domínios pós-sinápticos são reinervados (Figura 3C, barra direita).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig01.jpg"> Figura 1: Transferência gênica eficiente mediada por eletroporação in vivo de músculos LAL. Um plasmídeo que codifica a proteína tdTomato foi expresso nos músculos LAL por eletroporação in vivo de camundongos adultos. A solução de DNA foi injetada sob a fáscia do músculo rLAL, e eletrodos do tipo agulha de ouro foram posicionados acima do músculo para fornecer cinco pulsos de 100 V / cm2 com duração de 20 ms a 1 Hz (A). Os músculos montados inteiros foram dissecados 21 dias após a eletroporação e corados para AChR usando α-BTX (branco). Fibras eletroporadas expressando tdTomato (vermelho) foram observadas no músculo rLAL (B). O músculo rLAL foi seccionado transversalmente e corado com WGA (amarelo) e DAPI (ciano) (C) para detectar a membrana muscular e os núcleos, respectivamente. A eficiência do procedimento foi quantificada como a porcentagem de fibras que expressam tdTomato (vermelho em C) das fibras totais via coloração WGA (D). A proporção de núcleos centrais (cabeças de setas) foi quantificada como parâmetro de dano/regeneração das fibras musculares (E). As estatísticas representam a média ± EPM de N: três animais por grupo (controle e eletroporado). Barra de escala = 1 mm (B), 50 μm (C). ns = não significativo; teste t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig02.jpg"> Figura 2: Regeneração de NMJ de curto prazo usando um protocolo de lesão por esmagamento de nervo. Para lesão específica por esmagamento do nervo, o ramo auricular posterior do nervo facial (ciano) pode ser exposto de forma eficiente por meio da identificação de alguns indicadores anatômicos: a veia auricular posterior, o ventre do músculo digástrico e o canal auditivo cartilaginoso (A). Imagens representativas de microscopia confocal de NMJs do músculo LAL obtidas de controle ou dissecadas 5 dias, 10 dias e 60 dias após o esmagamento do nervo de camundongos adultos. As NMJs foram identificadas pela marcação de axônios motores e terminais (SV2 para vesículas sinápticas mais 2H3 para neurofilamentos; ciano), células de Schwann (anti-S100 B; amarelo) e AChRs (α-BTX; magenta) (B). Os painéis inferiores mostram os axônios motores (painéis esquerdos) e os canais AChR (painéis direitos) separadamente. Formas cinzentas foram desenhadas para delimitar a posição dos domínios pós-sinápticos e avaliar o estado de inervação. Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig03.jpg"> Figura 3: Protocolos combinados de eletroporação in vivo e lesão por esmagamento de nervo. O músculo LAL foi eletroporado com um plasmídeo que codifica a proteína tdTomato (vermelho). O ramo auricular posterior do nervo facial foi esmagado 3 dias após a eletroporação. Após 9 dias, o músculo LAL foi dissecado (A), e os componentes pré e pós-sinápticos foram identificados pela marcação de axônios motores e terminais (anticorpos SV2 mais 2H3, ciano) e AChRs (α-BTX; magenta) (B). Um NMJ desnervado (ponta de seta verde) e um NMJ reinervado (seta amarela) são indicados. Quantificação da proporção de fibras positivas para a expressão da proteína tdTomato (barra esquerda) e a proporção de domínios pós-sinápticos contatados por um axônio motor regenerado (barra direita) (C). Os resultados representam a média ± EPM de N: 3 camundongos por grupo. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

Eletroporação In Vivo Combinada e Reinervação de Curto Prazo do Músculo Esquelético do Elevador do Crânio Longo do Auris

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...

combined-vivo-electroporation-short-term-reinnervation-cranial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Descrevemos os procedimentos para a administração repetida de inibidores da sinalização muscarínicos ao longus levantador auris (LAL) muscular de ratos adultos jovens e para a imunocoloração subseqüente de sua junções neuromusculares (NMJs) em wholemounts. O músculo LAL tem vantagens exclusivas para...

A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos

Cartilagens craniofacial desenvolver em estreito contato com outros tecidos e são difíceis de manipular em animais vivos. Estamos usando eletroporação para entregar ferramentas moleculares durante o crescimento do esqueleto craniofacial, enquanto ignorando cedo efeitos embrionárias. Esta abordagem irá permitir-nos testar de forma eficiente as moléculas de...

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento dos neurônios olfativos primários. Esta propriedade específica pode ser utilizado para transplantação celular. Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização de OECs em um modelo de lesão do nervo laríngeo.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

O uso do nervo massetérico como nervo doador representa uma alternativa de estágio único ao procedimento padrão de dois estágios de enxerto de nervo facial cruzado e transferência muscular livre na paralisia facial. Fornecemos uma descrição detalhada para realizar com segurança esta técnica com uma transferência do músculo grácil e discutimos indicações e limitações.

Simples estágio dinâmico Reanimação do Sorriso em Irreversível Paralisia Facial pela Free Funcional transferência muscular

O protocolo descrito neste artigo usa o músculo levator auris longus (LAL) de rato para gravar espontânea e nervo-evocou potenciais pós-sinápticos (corrente-braçadeira) e correntes (tensão-braçadeira) na junção neuromuscular. Uso desta técnica pode fornecer insights-chave nos mecanismos de transmissão sináptica sob condições normais e doença.

Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

Modelos animais de implantes cocleares podem avançar o conhecimento das bases tecnológicas de tratamento de perda de audição neurossensorial permanente com estimulação elétrica. Este estudo apresenta um protocolo cirúrgico para agudo ensurdecedor e implante coclear de uma matriz de eletrodo em ratos, bem como a avaliação funcional com auditivo de tronco encefálico.

Cirurgia de implante coclear e gravações de resposta eletricamente evocado auditivo do tronco encefálico em camundongos C57BL/6

Eletroporação é uma abordagem eficaz para entregar genes de interesse em células. Aplicando-se esta abordagem na vivo sobre os neurônios do gânglio de raiz dorsal do rato adulto (DRG), descrevemos um modelo para estudo de regeneração do axônio em vivo.

Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Este protocolo descreve uma abordagem reprodutível para a cirurgia do nervo facial no modelo de rato, incluindo descrições de vários padrões induziveis de lesão.

Cirurgia do nervo facial no modelo de rato para estudar inibição e regeneração axonal

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um sistema implantável para registro cronológico in vivo de potenciais eletromiográficos evocados e espontâneos. O sistema é aplicado à investigação da reinervação dos músculos laríngeos após lesão nervosa.

Um sistema implantável para eletromiografia crônica in vivo

As lesões de perda muscular volumétrica (VML) excedem a capacidade regenerativa endógena, resultando em déficits funcionais permanentes. A pesquisa atual do VML se concentra principalmente nos músculos dos membros e troncos. Para estender os estudos mecanísticos do VML aos músculos craniofaciais, este artigo descreve um método in vivo para avaliação longitudinal da função do músculo masseter pré e pós-lesão do VML.

Avaliação funcional in vivo do músculo masseter de rato após a criação cirúrgica de uma lesão de perda muscular volumétrica (VML)

Aprenda eletroporação in vivo e desnervação do músculo LAL em camundongos CF-1 para investigar proteínas musculares na regeneração sináptica neuromuscular. Este protocolo minimamente invasivo permite analisar a estabilidade dos receptores de acetilcolina pós-sinápticos.

Eletroporação In Vivo Combinada e Reinervação de Curto Prazo do Músculo Esquelético do Elevador do Crânio Longo do Auris

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