Name: Transfecção de um clone molecular de rDNA de Naegleria gruberi em trofozoítos de N. gruberi (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprenda a transfecção de DNA ribossômico extracromossômico circular em trofozoítos de Naegleria gruberi. Este protocolo estabelece métodos para manutenção estável durante passagens in vitro e ciclos de encistamento.

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Esses estudos foram parcialmente financiados por uma doação do George F. Haddix Fund da Creighton University (KMD). A Figura 1 é gerada em biorender.com e a Figura 3 é gerada em benchling.com.

Os detalhes das espécies, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais. A sequência da construção pGRUB de 17.004 pares de bases é fornecida no Arquivo Suplementar 1.
1. Cultura de trofozoítos
<ol><li>Descongele os trofozoítos de N. gruberi congelados a 37 °C durante 3 min.</li>
	<li>Inocular trofozoítos em frascos T25 em peptona/extrato de levedura/ácido nucleico/ácido fólico/hemina modificados com 10% de meio de soro fetal de bezerro (PYNFH) mais tampão 2% (fosfato dissódico, di-hidrogenofosfato de potássio).</li>
	<li>Cultive os trofozoítos a 25 ° C até ~ 80% confluentes, onde exibem uma morfologia amebóide (Figura 2A). NOTA: Ao reviver inicialmente uma cultura de trofozoítos de seu estado congelado, pode levar de 5 a 7 dias para que um T25 se torne confluente. Transvase a mídia a cada 3-4 dias e substitua por mídia nova.</li>
	<li>Coloque os frascos confluentes no gelo por 5 a 10 minutos para liberar os trofozoítos aderidos do plástico. Gire suavemente o frasco para desalojar quaisquer células aderentes restantes. Os trofozoítos agora têm uma morfologia "arredondada" (Figura 2B).</li>
	<li>Divida as culturas 1:2 a 1:4 em novos frascos de cultura de tecidos.</li>
	<li>Remova o PYNFH e substitua-o por meio de encistamento estéril (cloreto de sódio 120 mM, cloreto de magnésio 0,03 mM, fosfato dissódico 1 mM, di-hidrogenofosfato de potássio 1 mM, cloreto de cálcio 0,03 mM, cloreto de ferro 0,02 mM, pH 6,8)22 para encistar o N. gruberi. NOTA: A maioria dos trofozoítos torna-se encistada por 72 h ( Figura 2C ). O excisto deve ser concluído em 72 h.</li>
	<li>Remova os cistos dos frascos, centrifugue a 600 x g por 10 min a 20 ° C e ressuspenda os cistos em meio PYNFH com 10% de soro fetal de bezerro para excistar as células. Incubar a 25 °C durante 24 h até que os trofozoítos comecem a emergir.</li>
</ol>2. Transfectar trofozoítos
<ol><li>Colocar os trofozoítos numa placa de cultura de tecidos de fundo plano de 6 poços (1 ml de 1 x 106 trofozoítos/ml) e cultivar a 25 °C.</li>
	<li>Transfectar as células quando atingirem 70%-80% confluentes (~10,4 x 104 células/cm2 em clusters de 6 poços). Aqueça o reagente de transfecção à temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Prepare a mistura de reagente de plasmídeo-transfecção da seguinte forma: 75 ng de DNA de plasmídeo e 0,225 μL do reagente de transfecção em 200 μL de meio PYNFH sem FBS. Prepare uma mistura de reagentes de plasmídeo-transfecção suficiente para realizar a transfecção em duplicado. NOTA: Um plasmídeo bacteriano contendo um clone completo de N. gruberi CERE (pGRUB) foi usado neste estudo. O plasmídeo vazio (pGEM) foi usado como controle negativo (Figura 3).</li>
	<li>Incubar a mistura de reagentes de plasmídeo-transfecção à temperatura ambiente durante 10 min.</li>
	<li>Remova ~ 800 μL de meio das monocamadas de trofozoíto imediatamente antes da transfecção.</li>
	<li>Coloque a mistura de reagente de plasmídeo-transfecção nos trofozoítos.</li>
	<li>Gire suavemente a placa a cada 15 minutos para evitar que a mídia se agregue nas bordas da placa.</li>
	<li>Lave as monocamadas uma vez com 2 ml de meio de crescimento após 1 h de incubação a 25 °C.</li>
	<li>Trate as monocamadas com 10 U DNase em 1 mL de tampão 10x DNase por 15 min a 37 ° C para remover o DNA do plasmídeo residual, lave uma vez com meio de crescimento, adicione 2 mL de meio fresco e coloque a 25 ° C. Incube a placa por 24-36 h.</li>
	<li>Coloque o prato no gelo por 10 min para liberar as células.</li>
	<li>Divida um poço (1:2) em dois novos poços.</li>
	<li>Colete trofozoítos dos poços restantes para fins experimentais. NOTA: Todas as culturas são realizadas em duplicata. Para cada condição, 1 poço é usado para passagem e 1 é usado para isolamento CERE.</li>
</ol>3. Isolando CERE de Naegleria
<ol><li>Calcule o número de trofozoítos em cada poço usado para isolamento CERE por coloração de exclusão de azul de tripano e um hemocitômetro23.</li>
	<li>Colocar os trofozoítos num tubo de 2,0 ml.</li>
	<li>Lave os trofozoítos uma vez em cloreto de sódio a 100 mM (pH 7,5) por centrifugação (600 x g, 10 min, 4 ° C). NOTA: O cloreto de sódio impede que os trofozoítos adiram às laterais do tubo.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda os grânulos celulares em 100 μL de EDTA 100 mM (pH 7,5).</li>
	<li>Coloque o tubo em um bloco de calor por 15 min a 98 ° C para lisar as células e inativar as enzimas nos trofozoítos. NOTA: Esta etapa inativa DNases, que são abundantes em trofozoítos de Naegleria . As DNases podem interferir na capacidade de detectar CERE nativo e o clone molecular na etapa 4. O rendimento do DNA diminui quando mais de ~ 3 x 106 células são usadas na etapa 3.4.</li>
	<li>Centrifugue os tubos na velocidade máxima (16.000 x g) a 4 °C por 10 min para pellet os detritos.</li>
	<li>Transferir os sobrenadantes para um novo tubo.</li>
	<li>O etanol precipita os sobrenadantes com 0,5 volumes de acetato de amônio 7,5 M (pH 7,5), 3 volumes de etanol absoluto e 1 μL de glicogênio 10 mg / mL como transportador.</li>
	<li>Inverter o tubo várias vezes e colocá-lo a -80 °C durante pelo menos 1 h ou durante a noite.</li>
	<li>Aqueça as amostras à temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugue os tubos à temperatura ambiente por 10 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e lave o pellet com etanol a 70% por centrifugação por 5 min a 16.000 x g (à temperatura ambiente).</li>
	<li>Remova o etanol e seque o pellet ao ar por 5 min.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet seco em água deionizada estéril (DI). Normalize o volume para 10.000 trofozoítos por μL.</li>
	<li>Conservar a -80 °C até ser utilizado em PCR.</li>
</ol>4. Detecção por PCR de trofozoítos transformados
<ol><li>Use 20.000 equivalentes celulares de DNA, primers de 600 nM (Tabela 1) e Taq polimerase e realize a PCR24. NOTA: Os primers que distinguem entre o CERE nativo e o CERE clonado estão listados na Tabela 1, assim como as condições de PCR. A Figura 3 mostra a localização dos primers nos construtos. A PCR exigirá otimização dependendo dos primers usados, bem como da mistura específica de PCR utilizada.</li>
	<li>Microondas 0,8% agarose em 1x base Tris, ácido acético e tampão EDTA (TAE) até que a agarose seja dissolvida.</li>
	<li>Resfrie a agarose a ~ 50 ° C em temperatura ambiente.</li>
	<li>Despeje a solução em uma bandeja de fundição de gel contendo um pente para formar poços.</li>
	<li>Deixe o gel descansar em temperatura ambiente até solidificar.</li>
	<li>Coloque o gel no aparelho de eletroforese.</li>
	<li>Transvase 1x TAE na câmara de eletroforese até que o gel esteja coberto.</li>
	<li>Retire o pente.</li>
	<li>Adicione 6x corante de carga (0,25% azul de bromfenol, 0,25% xileno cianol, 30% glicerol) às amostras e carregue o gel. Use uma escada de DNA para determinar o tamanho do produto de PCR.</li>
	<li>Conecte o eletrodo, ligue a fonte de alimentação e execute o gel a 80 V por ~ 1.5-2 h.</li>
	<li>Desligue a energia e remova o gel.</li>
	<li>Manchar o gel com corante de DNA (por exemplo, 10 μL de brometo de etídio 10 mg/mL) em 100 mL de água DI por 10 min.</li>
	<li>Destain o gel por 20 min em água DI.</li>
	<li>Visualize o gel em um sistema de luz ultravioleta (UV) e documente os resultados.</li>
</ol>

Usando um vetor baseado em CERE para transfecção de trofozoítos de Naegleria gruberi

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</ol>

Nenhum conflito de interesse financeiro foi declarado.

O protocolo descrito aqui é muito simples, embora cada construção provavelmente exija algum grau de otimização, particularmente da proporção de reagentes de transfecção de DNA, dependendo da natureza da construção e da espécie de Naegleria usada. Testamos apenas um reagente de transfecção disponível comercialmente usando este protocolo, mas é provável que vários outros possam ser eficazes. Dado que um clone completo do CERE é usado, contendo uma origem funcional de replicação e, portanto, replicando-se de forma autônoma, a construção possui todo o maquinário de replicação eucariótica necessário. Se um clone parcial fosse inserido no vetor pGEM, o clone transfectado seria previsto para ser perdido logo após a transfecção se não contivesse uma origem eucariótica funcional de replicação, semelhante ao vetor pGEM vazio (Figura 2B). Além disso, esses dados demonstram que a presença de DNA procariótico não interfere na capacidade do clone molecular de ser retido pelo trofozoíto.
Embora tenha havido um caso relatado de transfecção de trofozoítos de N. gruberi 25, a inserção usada no presente estudo é consideravelmente maior (~ 17 kbp) do que a transfectada no estudo anterior (<1 kbp). Embora não se saiba qual é o plasmídeo de tamanho máximo que pode ser tolerado pela Naegleria, dados não publicados de nosso laboratório determinaram que as amebas de outro gênero (Willaertia) contêm CERE com aproximadamente 24 kbp de tamanho.
Um passo fundamental para garantir que este protocolo detecte DNA dentro do trofozoíto é a etapa de tratamento com DNase (etapa 2.9), que garante que o DNA residual (ou seja, DNA que não foi transfectado) seja eliminado das culturas. Alguns procedimentos de controle de qualidade foram realizados para garantir a integridade do protocolo. Primeiramente, os construtos foram sequenciados. Em segundo lugar, os produtos de PCR também foram sequenciados para confirmar sua identidade e garantir que não houvesse contaminação do ensaio e confirmar que os produtos de PCR não eram o resultado de erros de priming.
Embora a transfecção bem-sucedida de um plasmídeo com origem eucariótica de replicação tenha sido demonstrada, fica claro na Figura 4 que há uma diminuição do sinal de PCR após a primeira passagem dos trofozoítos. qPCR foi realizado nos trofozoítos transfectados ao longo do tempo, e foi determinado que o nível de pGRUB cai de aproximadamente 1.600 cópias na passagem 1 para 35 na passagem 7 (dados não mostrados), indicando que o plasmídeo transfectado provavelmente será perdido nas próximas passagens. Isso não é inesperado, pois o plasmídeo transfectado é estranho aos trofozoítos e seria visto como desnecessário ou prejudicial à sobrevivência da ameba.
Há uma falta fundamental de conhecimento sobre o CERE da Naegleria. A maioria das sequências CERE no GenBank são sequências parciais, com o foco principal no rDNA e nas regiões espaçadoras internas transcritas (ITS), que são usadas para identificar gênero (ITS1) e espécie (ITS2)1,26,27. Enquanto a sequência das subunidades do rDNA é altamente conservada entre Naegleria sp., o NRS da Naegleria sp. Varia muito, tanto em tamanho quanto em sequência, variando de aproximadamente 5,5 kbp a 10 kbp 1,15,16,17,18,19,20. A função do NRS em Naegleria é um território amplamente inexplorado, mas presume-se que contenha elementos regulatórios, incluindo, mas não se limitando a, uma origem de replicação, um promotor e uma sequência de terminação17. Com base nas sequências completas do CERE no GenBank, uma característica comum do Naegleria CERE é a presença de regiões repetidas no NRS que são ricas em A-T. A função dessas regiões é atualmente desconhecida.
A capacidade de transfectar trofozoítos de Naegleria permite o estudo de vários aspectos da biologia do CERE NRS, particularmente a dinâmica e os requisitos da replicação do CERE. Em Escherichia coli, G-quadruplexes foram identificados nas regiões promotoras de alguns genes28. Estruturas G-quadruplex também foram identificadas nos promotores de uma ampla variedade de eucariotos, incluindo camundongos, ratos, humanos e primatas não humanos29. A análise in silico de várias sequências CERE de comprimento total diferentes demonstra que várias áreas do NRS estão previstas para formar estruturas G-quadruplex. Uma área de estruturas G quadruplex previstas no NRS de vários Naegleria sp. está a montante do início do gene 18S. A capacidade de transfectar trofozoítos permitiria a exploração da identificação da região promotora do rDNA no CERE de Naegleria por meio da deleção/mutação de sequências a montante do rDNA. Da mesma forma, estudos semelhantes podem ser realizados para identificar sequências que encerram a transcrição do rDNA.
A retenção do CERE de comprimento total nos trofozoítos por várias passagens permitirá estudos que se concentram na identificação da área mínima do NRS necessária para a replicação do CERE. Embora uma região do CERE tenha sido identificada como a origem putativa da replicação20, não se sabe se estruturas secundárias fora da região são necessárias para a replicação do CERE ou se a região pode ser significativamente truncada e o ori permanecer funcional. Os elementos repetitivos no NRS são encontrados em todos os Naegleria sp. sequenciados até o momento 15,16,17,18,19,20. O propósito dessas sequências é atualmente desconhecido. Se eles existem como um elemento regulador, ou se eles são excluídos, o CERE se replicará nos trofozoítos ainda é desconhecido. As sequências repetitivas são específicas da espécie em Naegleria, mas não se sabe se as sequências de uma espécie podem funcionar em outra. Em suma, existem inúmeras questões sobre a biologia do CERE que agora podem ser abordadas usando a técnica aqui descrita.

O gênero Naegleria contém mais de 45 espécies, embora seja improvável que todos os membros da espécie tenham sido identificados1. A naegleria pode existir de diferentes formas: como trofozoítos (amebas), como flagelados ou, quando os recursos são severamente limitados, como cistos 1,2,3,4. O gênero Naegleria é reconhecido por sua única espécie particularmente perigosa, Naegleria fowleri, conhecida como 'a ameba comedora de cérebro' (revisada em 1,2,3,4,5,6,7), que é a causa da meningoencefalite amebiana primária quase universalmente fatal.
Naegleria codifica seu rDNA no CERE localizado no nucléolo. O sequenciamento completo dos genomas de três espécies de Naegleria confirma a ausência de rDNA no genoma nuclear 8,9,10,11. Com base nas sequências CERE de comprimento total limitadas, o CERE varia de aproximadamente 10 kbp a 18 kbp de comprimento. CERE de cada espécie de Naegleria carrega um único cistron de rDNA (contendo o DNA ribossômico 5.8, 18 e 28S) em cada um dos aproximadamente 4.000 CERE por célula 12,13,14. Além do rDNA, cada CERE tem uma grande sequência não-rDNA (NRS). Os tamanhos do CERE variam entre as espécies; as diferenças são principalmente devidas ao comprimento variável do NRS, já que as sequências de rDNA são altamente conservadas em todo o gênero 1,15,16,17,18,19,20. O mapeamento de uma única origem de replicação do DNA dentro do N. gruberi CERE NRS21 fornece forte suporte para a hipótese de que Naegleria CERE se replica independentemente do genoma nuclear.
N. gruberi é uma ameba não patogênica frequentemente usada para estudar a biologia de Naegleria . Desenvolvemos uma metodologia para transformar trofozoítos de N. gruberi com um clone de CERE da mesma espécie para testar a hipótese de que as amebas de Naegleria toleram e replicam independentemente o CERE dentro dos trofozoítos. Isso foi conseguido transformando N. gruberi com um clone completo de N. gruberi CERE em trofozoítos e seguindo os destinos do clone CERE do doador por reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma visão geral do protocolo é descrita na Figura 1. Os dados aqui apresentados demonstram que o clone do doador pode ser detectado por meio de pelo menos sete passagens em cultura de tecidos, bem como ser mantido por encistamento e excistamento. Esses estudos formam a base para um meio de dissecar como o CERE se replica, bem como explorar seu uso como vetor para transfectar Naegleria.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bio Rad</td><td>161-3102</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7330</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de Cultura de Gelo</td><td></td><td></td> Triturado, T-75 Thermo Scientific 130190 <td></td></tr><tr><td></td> Placa de Cultura, 6 poços Corning 3506 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-4527</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M</td><td>Affymetrix</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de Gel de Eletroférese</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6052-45</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes, 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-8751</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Fólico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876-25G</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de Aquecimento</td><td>Thermo Scientific</td><td>88871001</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Ferro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>372870-256</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magneisum</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>MySpin 12</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>N. gruberi</td><td>ATCC</td><td>30224</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Nucleico</td><td>Chem Impex Int' l</td><td>#01625</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>pGEM</td><td>Promega</td><td>P2251</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Unidade de fonte de alimentação de eletroforse</td><td>Bio Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>MCB Reagentes</td><td>SX0420</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio, dibásico</td><td>Centrífuga de mesa Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td></td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Tris, base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ViaFect Reagente</td><td>Promega</td><td>E4981</td><td></td></tr><tr><td>pesa a balança</td><td>Denver Instruments</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

transfecção de um clone molecular de rdna de naegleria gruberi em trofozoítos de n. gruberi

Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites

Todos os genes ribossômicos dos trofozoítos de Naegleria são mantidos em um elemento circular fechado contendo DNA ribossômico extracromossômico (rDNA) (CERE). Embora pouco se saiba sobre o CERE, uma análise completa da sequência do genoma de três espécies de Naegleria demonstra claramente que não há cistrons de rDNA no genoma nuclear. Além disso, uma única origem de replicação do DNA foi mapeada no N. gruberi CERE, apoiando a hipótese de que o CERE se replica independentemente do genoma nuclear. Esta característica do CERE sugere que pode ser possível usar o CERE projetado para introduzir proteínas estranhas em trofozoítos de Naegleria . Como primeiro passo para explorar o uso de um CERE como vetor em Naegleria, desenvolvemos um protocolo para transfectar N. gruberi com um clone molecular do CERE de N. gruberi clonado em pGEM7zf+ (pGRUB). Após a transfecção, o pGRUB foi prontamente detectado em trofozoítos de N. gruberi por pelo menos sete passagens, bem como por encistamento e excistamento. Como controle, os trofozoítos foram transfectados com o vetor backbone, pGEM7zf+, sem as sequências de N. gruberi (pGEM). O pGEM não foi detectado após a primeira passagem após a transfecção em N. gruberi, indicando sua incapacidade de se replicar em um organismo eucariótico. Esses estudos descrevem um protocolo de transfecção para trofozoítos de Naegleria e demonstram que a sequência de plasmídeo bacteriano em pGRUB não inibe a transfecção e replicação bem-sucedidas do clone CERE transfectado. Além disso, este protocolo de transfecção será fundamental para entender a sequência mínima do CERE que impulsiona sua replicação em trofozoítos, bem como identificar regiões regulatórias na sequência não ribossômica (NRS).

A PCR de trofozoítos que foram transfectados com pGRUB demonstra que o CERE transfectado é detectado através de pelo menos sete passagens dos trofozoítos, bem como encistamento e excistamento (Figura 4). Os primers usados na PCR recoecem tanto para o vetor pGEM quanto para a sequência CERE, garantindo assim que a PCR não detecte CERE nativo. A PCR após a transfecção de pGEM em trofozoítos indicou que o pGEM foi negativo (Figura 4), indicando que o plasmídeo vazio não foi retido pelas amebas. A Figura 4 demonstra que o pGEM foi perdido na primeira passagem - passagens subsequentes, enquistamento e excistamento foram todos negativos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig01v3.jpg"> Figura 1: Fluxograma do procedimento de transfecção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig02.jpg"> Figura 2: Trofozoítos de N. gruberi (estirpe NEG-M) em cultura. (A) Em condições normais de cultura a 25 °C, os trofozoítos de N. gruberi têm uma morfologia amebóide e aderem aos frascos/placas de cultura. A seta indica um pseudópode que é usado para impulsionar o trofozoíto direcionalmente. (B) Após a incubação da cultura de N. gruberi no gelo, os trofozoítos tornam-se redondos em morfologia e não aderentes. (C) Após incubação em meio de encistamento por 24-48 h, N. gruberi trofozoítos tornam-se encistados. Barras de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig03.jpg"> Figura 3: Construção pGRUB usada para transfectar N. gruberi (NEG-M). O CERE de comprimento total de N. gruberi (cepa EBM, 14.007 pb; vermelho) foi clonado em pGEM7Zf (+) (2.997 pb; verde), resultando em uma construção de 17.004 pb. As setas em cada plasmídeo indicam a localização dos primers de PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig04.jpg"> Figura 4: Resultados de PCR detectando pGRUB e pGEM transfectados em trofozoítos de N. gruberi . A PCR demonstra que o pGRUB é detectado em trofozoítos transfectados por meio de pelo menos sete passagens, encistamento (En) e excistamento (Ex). O pGEM é perdido após a primeira passagem dos trofozoítos. P1 = passagem 1, P7 = passagem 7. Os controles negativos (neg) não receberam DNA na PCR, enquanto os controles positivos (pos) são pGRUB ou pGEM de entrada na PCR. Os tamanhos de produto esperados são 656 pb (pGRUB) e 337 pb (pGEM). As figuras à esquerda do painel A indicam o tamanho das faixas mais brilhantes da escada de DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome do Primer</td>
			<td colspan="2">Sequência - 5'-&gt;3'</td>
			<td>Tm</td>
			<td>Tamanho do produto</td>
		</tr><tr><td>pGEM-forward</td>
			<td colspan="2">CTCTTCGCTATTACGCCAGC</td>
			<td>54</td>
			<td>337 pb</td>
		</tr><tr><td>pGEM-reverso</td>
			<td colspan="2">TTGTGTGGAATTGTGAGCGG</td>
			<td></td>
			<td>337 pb</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-para a frente</td>
			<td colspan="2">AGCCCCCGATTTAGAGCTTG</td>
			<td>60.5</td>
			<td>656 pb</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-reverso</td>
			<td colspan="2">TCGGCTAGAAATGAAGTGAGGAC</td>
			<td></td>
			<td>656 pb</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Primers de PCR e condições usadas nesses estudos.
Arquivo Suplementar 1: A sequência da construção pGRUB de 17.004 pares de bases. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve uma metodologia para transfectar trofozoítos de Naegleria gruberi com uma construção que é mantida durante a passagem de trofozoítos in vitro, bem como por meio de encistamento e excistamento.

Transfecção de um clone molecular de rDNA de Naegleria gruberi em trofozoítos de N. gruberi

All ribosomal genes of Naegleria trophozoites are maintained in a closed circular extrachromosomal ribosomal DNA (rDNA) containing element (CERE). While ...

transfection-molecular-clone-naegleria-gruberi-rdna-into-n-gruberi

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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