Name: Sistemas de co-cultura in vitro para reproduzir o ciclo de imunidade ao câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprenda a monitorar o ciclo de imunidade ao câncer usando sistemas de co-cultura in vitro com citometria de fluxo e modelos tumor-on-a-chip. Este protocolo oferece uma abordagem simples e confiável para estudar interações entre células cancerígenas e imunes.

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Monitoramento baseado em citometria de fluxo do ciclo de imunidade ao câncer 

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-immunity+cycle%3A+Indication%2C+genotype%2C+and+immunotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.</a> Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).</li>
<li>Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+privilege+of+cancer+stem+cells%3A+A+key+to+understanding+tumor+immune+escape+and+therapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure.</a> Cells. 10 (9), 2361(2021).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Es+of+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The three Es of cancer immunoediting.</a> Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).</li>
<li>Musella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+promote+cancer+cell+stemness+by+triggering+the+epigenetic+regulator+KDM1B%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B.</a> Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+immune+resistance+archetypes+in+solid+cancer+to+inform+next-generation+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (6), e006533(2023).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+cancer+cell+immunogenicity+and+antigen-specific+T-cell+cytotoxicity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Front Mol Biosci. 7, 612801(2020).</li>
<li>Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+automated+cytometry+in+the+new+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy.</a> Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).</li>
<li>Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+cytometry+practices+for+immuno-oncology%3A+A+multifaceted+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge.</a> Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).</li>
<li>Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> JoVE. (170), e61895(2021).</li>
<li>Mattei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoimmunology+meets+organs-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oncoimmunology meets organs-on-chip.</a> Front Mol Biosci. 8, 627454(2021).</li>
<li>Businaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+cancer+and+immune+cells%3A+exploring+complex+dynamics+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).</li>
<li>Vacchelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+antitumor+immunity+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1.</a> Science. 350 (6263), 972-978 (2015).</li>
<li>Maulana, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+cancer-on-chip+models+to+assess+immuno-oncology+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).</li>
<li>Lorenzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+control+antigen+retention+and+survival+of+CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+after+uptake+of+tumor+apoptotic+cells+leading+to+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.</a> J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).</li>
<li>Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+assessment+of+dendritic+cell-mediated+uptake+of+cancer+cell+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies.</a> Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).</li>
<li>Lucarini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Type+I+Interferons+and+5-Aza-2%27-Deoxycitidine+to+improve+antitumor+response+against+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).</li>
<li>Gutiérrez-Martínez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+cell-associated+antigens+by+MHC+Class+I+in+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets.</a> Front Immunol. 6, 363(2015).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+spatial+omics+in+dissecting+tumour+microenvironment+and+the+role+of+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI.</a> Front Oncol. 13, 1172314(2023).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics%3A+Navigating+to+the+golden+era+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research.</a> Clin Transl Med. 12 (1), 696(2022).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).</li>
<li>Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+flow+cytometry+automated+data+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Current trends in flow cytometry automated data analysis software.</a> Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O monitoramento da resposta imune anticancerígena é de extrema importância para elucidar e compreender as intrincadas interações moleculares e celulares que atuam no TME e apoiam uma batalha constante pela supremacia23. Aqui, detalhamos um protocolo simples assistido por mFC e ToC para o monitoramento e caracterização das etapas que constituem o ciclo de imunidade ao câncer. Com pequenas variações, este protocolo, baseado em linhagens celulares murinas e células imunes derivadas de camundongos, pode ser adaptado tanto para linhagens de câncer humanos imortalizados quanto para linhas de câncer primário e células imunes derivadas do sangue periférico humano. Além disso, combinando a inibição genética ou farmacológica de vias específicas e seus controles apropriados para cognatos, este protocolo permite a identificação de biomarcadores que regulam a imunovigilância e, portanto, a resposta a imunogênicos e imunológicos
O mFC permite a análise de alto rendimento de diversos parâmetros imunológicos e combina a capacidade de analisar milhões de células em um curto espaço de tempo com a possibilidade de identificar eventos raros, avaliar a proliferação e morte celular, detectar vários parâmetros de uma só vez em um pequeno volume de amostras e permite realizar análises moleculares e funcionais a jusante pós-classificação celular baseada em fluorescência9. Essas características, juntamente com o baixo custo, têm favorecido a acessibilidade do mFC e a ampla utilização em laboratórios clínicos e de pesquisa. No entanto, algumas limitações importantes permanecem. Primeiro, a análise de mFC requer dissociação tecidual para obter suspensões unicelulares durante a preparação da amostra, destruindo assim a informação espacial do tecido tumoral. O advento das tecnologias espaciais na última década, incluindo transcriptômica espacial de alto plexo, proteômica e epigenômica, expandiu nossa capacidade de traçar o perfil do TME analisando a posição das células cancerígenas, imunológicas e estromais e suas interações mútuas24. Em segundo lugar, o mFC permite a detecção de até dezesseis (ou mais) parâmetros de uma só vez e, portanto, não cobre todos os marcadores de identificação, maturação e status de ativação da célula em uma única amostra. Novamente, as tecnologias de ponta acima permitem a detecção de até cem parâmetros simultaneamente em resolução de célula única e até subcelular, como antes mesmode 25,26,27. Em terceiro lugar, o monitoramento imunológico de estudos longitudinais e comparativos requer protocolos reprodutíveis e a padronização de todas as etapas do fluxo de trabalho, incluindo aquisição e análise de dados. O gating manual convencional pode ser subjetivo e a manutenção do instrumento e as verificações de qualidade podem variar, o que afeta a mineração e a interpretação de dados. A aquisição automatizada e os plug-ins que implementam a análise de dados ajudam a minimizar a variabilidade dos dados28.
Os ToCs estão ganhando enorme atenção na pesquisa do câncer por sua capacidade de replicar de perto várias características do TME e substituir, pelo menos em alguns ambientes experimentais, tumores in vivo 12. Embora forneçam um modelo bastante realista da arquitetura tumor-tecido, complexidade multicelular e interação dinâmica entre os componentes celulares do TME, os ToCs ainda são incapazes de substituir totalmente os estudos em animais em termos de refletir a complexidade das respostas imunes sistêmicas, especificamente a matriz de mecanismos responsáveis pelo surgimento de etapas limitantes da taxa para cada uma das etapas do ciclo de imunidade ao câncer12, 29. Além desse aspecto, o campo da oncoimunologia continuará lucrando e se beneficiando do uso de ToCs, pois as rodadas e a velocidade da inovação científica os aproximam cada vez mais dos modelos in vivo 12.
Em conclusão, o protocolo descrito aqui serve como uma ferramenta analítica e de descoberta poderosa e simples para desvendar as complexidades dinâmicas do TME. Além disso, os recursos relacionados ao tempo e ao custo deste protocolo permitem sua viabilidade em larga escala. O desafio à frente é padronizá-lo para uso clínico para melhor informar e orientar as decisões de terapia para pacientes com câncer.

Nas últimas décadas, a imunoterapia tem estado na vanguarda das opções de ponta para o tratamento do câncer. O aproveitamento do sistema imunológico com fins antitumorais forneceu uma poderosa prova de conceito para o benefício do paciente em diversas malignidades hematológicas e sólidas com prognósticos historicamente ruins. Como a imunoterapia está oferecendo uma oportunidade para cânceres difíceis de tratar, ela está experimentando um ritmo surpreendentemente rápido de progresso. Esse progresso pode ser, pelo menos em parte, atribuído à compreensão refinada da interação entre células cancerígenas e células imunológicas. Essa interação se assemelha a um "motor" de alimentação que o sistema imunológico aciona para destruir as células cancerígenas, o chamado ciclo de imunidade ao câncer. Essa resposta imune anticâncer progride em três níveis principais: reconhecimento, processamento e reação. Em primeiro lugar, na fase de reconhecimento, os antígenos tumorais (Ags) produzidos durante a formação do tumor são liberados por células cancerígenas moribundas no microambiente tumoral (TME, etapa 1) e engolidos por células dendríticas infiltrantes de tumor (DCs, etapa 2). Em seguida, na fase de processamento, as DCs apresentam os epítopos dos Ags tumorais capturados através das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), expressam em sua superfície níveis mais altos de moléculas coestimulatórias (etapa 3) e se movem para os linfonodos drenantes de tumor (dLNs) para apresentar sua carga às células T CD8 virgens (CD8N, etapa 4). Todas essas etapas convergem no processo final de reação durante o qual as células T CD8 (CD8CP) específicas do tumor são ativadas, amadurecem em células T CD8 efetoras (CD8E) e sofrem uma expansão clonal (etapa 5). As célulasCD8 E então deixam os dLNs e se casam através do sangue para o TME (etapa 6), onde reconhecem e se ligam especificamente às células cancerígenas por meio da interação entre seu receptor de células T (TCR) e seu tumor cognato Ags, liberam moléculas citotóxicas [ou seja, interferon (IFN)-γ, perforinas e granzimas (Grzs)] e matam as células cancerígenas (etapa 7)1, 2. A morte de células cancerígenas leva à liberação de mais Ags tumorais para alimentar o ciclo de imunidade ao câncer. Na verdade, por meio de todas essas etapas, o sistema imunológico destrói e rejeita as células cancerígenas com muito mais frequência do que se supunha. No entanto, em pacientes com câncer, pelo menos uma dessas etapas não funciona corretamente. Nós e outros mostramos que as células cancerígenas procuram interromper a resposta imune evoluindo para variantes mais agressivas e imunoprivilegiadas 3,4,5 ou prejudicando a eficácia das células T 6,7.
A pesquisa sobre o câncer e o desenvolvimento de medicamentos contra o câncer dependem de modelos experimentais que permitem o estudo da relação entre câncer e células imunes, a chamada onco-imunologia. Aqui são descritos modelos in vitro rápidos, confiáveis, reprodutíveis e de baixo custo que reproduzem de forma abrangente cada etapa do ciclo de onco-imunologia e oferecem uma visão rápida e clara dos conjuntos de características fenotípicas e funcionais da imunovigilância e, eventualmente, da imunoedição.
A citometria de fluxo multiparamétrica (mFC) é uma das ferramentas analíticas de célula única mais bem-sucedidas na pesquisa fundamental do câncer, diagnóstico e pesquisa translacional em ensaios clínicos de câncer. Como permite capturar simultaneamente mais recursos em cada célula, o mFC conquistou seu lugar como uma plataforma de análise padrão-ouro em onco-imunologia. Combina alta sensibilidade e especificidade com a possibilidade de medir vários padrões de expressão de proteínas e propriedades funcionais de forma rápida e reprodutível em um único nível celular a partir de suspensões celulares heterogêneas e até heterotípicas, como as do TME 8,9,10. Como os padrões de expressão fenotípica e funcional são sensíveis ao tempo, a atenção cuidadosa ao design do experimento, a seleção de painéis, controles e anticorpos titulados adequados e o processamento apropriado da amostra e o uso de instrumentação são críticos para a confiabilidade, comparabilidade e reprodutibilidade dos resultados e para interpretar com confiança o resultado do experimento11.
Dispositivos microfluídicos tumorais em um chip (ToCs) modelam o TME, permitindo a biomimética em microescala in vitro da dinâmica e interações do câncer e das células imunes 12,13,14,15. Especificamente, os ToCs são dispositivos de cultura de células microfluídicas multicanais capazes de hospedar diversos tipos de células organizadas em configurações de cultura bidimensionais (2D) ou tridimensionais (3D) e capazes de modelar com alta fidelidade e controlar com alta precisão, unidades estruturais e funcionais importantes, como interações celulares heterotípicas e fluxos de gradientes químicos que ocorrem fisiologicamente no TME12, 13,14,15. Em particular, a quimioatração e as trajetórias imunológicas, bem como a interação das células imunes com as células cancerígenas, podem ser monitoradas em tempo real e quantificadas por microscopia de lapso de tempo e análise de rastreamento automatizada 5,12,13,14,15,16. Além disso, os ToCs oferecem a possibilidade de analisar e manipular processos cruciais que regulam o início e a progressão do câncer e a resposta à terapia17.
Neste artigo, mFC com ToCs são combinados para estudar todos os níveis da resposta imune anticancerígena passando por fagocitose mediada por DC de Ags de câncer (etapas 1-3), cross-priming de células T (etapa 4), ativação e expansão clonal (esta última por meio da tecnologia de cicloadição catalisada por 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) e(I) [clique], uma metodologia altamente sensível e precisa, etapa 5), homing de célulasE CD8 para o TME (etapa 6) e, finalmente, morte de células cancerígenas mediadas por célulasE CD8 (etapa 7, Figura 1).
Este trabalho contribui para o esforço de estabelecer protocolos padrão simples, rápidos e confiáveis para estudar o ciclo de imunidade ao câncer. A melhoria e integração dos modelos mFC e ToC na pesquisa do câncer, dinâmica TME e resposta à terapia têm grande potencial, pois esses modelos fornecem fidelidade biológica junto com o controle experimental. Portanto, este protocolo ajuda a recriar, de maneira gradual, o ciclo de imunidade ao câncer, tornando possível caracterizar, monitorar e manobrar oportunamente os papéis dos atores celulares individuais e suas interações recíprocas na imunovigilância natural e adquirida. Em última análise, isso ajudará a refinar, reduzir e substituir estudos em animais, ao mesmo tempo em que fornece insights críticos para superar tumores e orientar o atendimento clínico. Finalmente, as vantagens e limitações do mFC e do ToC são discutidas criticamente e comparadas com tecnologias de ponta (por exemplo, análises espaciais de alto plex em uma única célula e até mesmo resolução subcelular) para impulsionar a pesquisa e a terapia da onco-imunologia.

<table><tbody><tr><td>Microtubos de 1,5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Litografia de feixe eletrônico de 100 kV</td> Placas de Petri <td>Vistec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 100 mm&nbsp;</td>Placas de 12 poços <td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Euroclone</td><td>&nbsp; ET3012</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 e 50 mL Corning</td><td>&nbsp;</td><td>352096; 352070</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; Filtro de célula M&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431750</tr><tr><td>Tubos de poliestireno de 5 mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>120180</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de célula M&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431751</tr><tr><td>frasco de 75 cm2 tratado para cultura de células</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp; ET7076</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes</td><td></td><td></td><td></td>adsorventes</tr><tr><td>Allumin foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD107a (LAMP-1) Anticorpo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-319</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD25 (7D4) Anticorpo&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-678</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD3 (17A2) anti-camundongo</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Plus Kit de Solução de Fixação/Permeabilização com BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Transporte de Proteína BD GolgiPlug (Contendo Brefeldina A)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555029</tr><tr><td>Inibidor de Transporte de Proteína BD GolgiStop (Contendo Monensina)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>US Biological, Salem</td><td>A1312</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Anticorpo Monoclonal (N418)</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Anticorpo Monoclonal (17B5)</td><td>eBioscience</td><td>17-1371-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Anticorpo monoclonal (17A2)</td><td>eBioscience</td><td>25-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD44 (IM7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD45 (30-F11)</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4528</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD69 (H1.2F3)</td><td>eBioscience</td><td>48-0691-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD95 (APO-1/Fas) (15A7)</td><td>eBioscience</td><td>53-0951-82</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de contagem de células</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td></td></tr><tr><td>Máscaras de quartzo de cromo</td><td>MB W& A, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Kit de Ensaio de Citometria de Fluxo</td><td>Invitrogen</td><td>C10635</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de Fluxo CytoFLEX</td> Kit de Remoção de Células Mortas <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4053L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Flowjo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granzyme B Anticorpo monoclonal (NGZB)</td><td>eBioscience</td><td>12-8898-82</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td> <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hotplate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células humificadas (37 ° <, 5% de CO sub > 2 )</td> Máquina de gelo <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Brema Ice Makers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN gama Monoclonal Anticorpo (XMG1.2)</td> <td>eBioscience</td><td>11-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2015</td><td>Adobe Systems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de Incucito 2022A</td> do Instituto Nacional de Saúde <td></td> ImageJ Sartorius <td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Cytotox Dye para Contagem de Células Mortas</td> Sistema de Análise de Células Vivas <td>Sartorius</td><td>4632</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Incucyte SX5&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td>Microscópio de Imagem de Células Vivas Fluorescentes Inteligente <td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JuLi</td><td>Bulldog Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bancada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Laboratório Refrigerador de Laboratório (4&deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança de Laboratório (Classe II)</td><td>Angelantoni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Aqua Fixável</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas de IR Próximo Fixável</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Colunas MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201; 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separadores MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-10; 130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular de fibrossarcoma de camundongo MCA205</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC173</td><td></td></tr><tr><td>Biobiologicamente controlado biotrófico equipado com cabine</td><td></td><td></td><td></td>de segurança Classe II</tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002552</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>Microsoft, Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: C57BL / 6J</td><td>O Laboratório Jackson 000664</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de Células T Naive CD8a +, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-543</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Litografia óptica</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G sal de sódio e sulfato de estreptomicina</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D/1</td><td></td></tr><tr><td>Auxiliar de pipeta</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA&</td><td>nbsp; 4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PKH67 Kits de Ligante de Célula Fluorescente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH67GL-1KT</td><td>kit</td></tr> de <tr><td>lamínula de plástico</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de Propídio</td><td>Thermo Scientific</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Gravação de Íons Reativos</td><td>Oxford plasmalab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Pipetas</td><td>sorológicas EuroClone ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>(2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Corning-Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; </td><td></td>CLS4489</tr><tr><td>Série de Centrífugas SL 16</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004031</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis estéreis, pinças cirúrgicas, tesouras e alicates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas estéreis (1&ndash; 10 &mu; L, 20&ndash; 200 &mu; L, 1000 &mu; L)</td> <td>EuroClone Spa, Milão, Itália</td><td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; </td><td></td>ECTD01005</tr><tr><td>SU-8 3000 series</td><td>MicroChem corp, Newton, (MA)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Conjunto de perfuradores de biópsia dérmica</td><td>Kai Medical, Tedpella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Anticorpo monoclonal (H57-597)</td> <td>eBioscience</td><td>12-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Banho</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>termostáticoTemporizador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMCS&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360</td><td></td></tr><tr><td>Mancha Azul de Tripano (0,4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA com Vermelho de Fenol</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador</td><td></td><td></td><td></td> a vácuo</tr></tbody></table>

sistemas de co-cultura in vitro para reproduzir o ciclo de imunidade ao câncer

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

A pesquisa fundamental do câncer e o desenvolvimento de terapias eficazes de contra-ataque dependem de estudos experimentais que detalham as interações entre o câncer e as células imunológicas, o chamado ciclo de imunidade ao câncer. Os sistemas de cocultura in vitro combinados com citometria de fluxo multiparamétrica (mFC) e dispositivos microfluídicos tumor-on-a-chip (ToCs) permitem o monitoramento e a caracterização simples, rápidos e confiáveis de cada etapa do ciclo de imunidade ao câncer e levam à identificação dos mecanismos responsáveis por inclinar o equilíbrio entre a imunovigilância e a imunoevasão do câncer. Uma compreensão completa das interações dinâmicas entre câncer e células imunes fornece insights críticos para superar os tumores e acelerará o ritmo da personalização e otimização terapêutica nos pacientes. Especificamente, aqui detalhamos um protocolo direto assistido por mFC e ToC para desvendar as complexidades dinâmicas de cada etapa do ciclo de imunidade ao câncer em linhagens de células de câncer murino e células imunes derivadas de camundongos e nos concentramos na imunovigilância. Considerando os recursos relacionados ao tempo e ao custo deste protocolo, ele certamente é viável em larga escala. Além disso, com pequenas variações, este protocolo pode ser adaptado a linhagens de células cancerígenas humanas e células imunes derivadas do sangue periférico humano e combinado com inibição genética e/ou farmacológica de vias específicas para identificar biomarcadores de resposta imune.

A capacidade das DCs CD11c +, o subconjunto de fagócitos amplamente conhecido especializado para apresentação cruzada21,22 e fechado conforme mostrado na Figura 2A, de engolir corpos apoptóticos de células cancerígenas MCA205 irradiadas por UV que foram previamente marcadas com o ligante de células fluorescentes PKH67 foi avaliada por mFC. Como esperado, as DCs CD11c + capturaram eficientemente células MCA205 apoptóticas in vitro a 37 ° C, mas não a 4 ° C (Figura 2B, etapas 1-3 do ciclo de imunidade ao câncer). Para caracterizar ainda mais a maturação da DC após a captação de Ag tumoral, a expressão superficial de moléculas ligantes de coestimulador e checkpoint imunológico foi verificada e comparada em DCs pré e pós-fagocitose (DCN e DCPHAGO, respectivamente). As células DCPHAGO mostraram níveis significativamente aumentados de CD86 e MHC-II, juntamente com níveis reduzidos de PDL1 (Figura 2C, etapa 4 do ciclo de imunidade ao câncer). Além disso, a expansão clonal de células T CD8 uma vez cruzadas por DCPHAGO (CD8CP) foi avaliada avaliando a incorporação do análogo da timidina EdU (etapa 5 do ciclo de imunidade ao câncer). Ao bloquear adequadamente as células T CD3 + CD8 + vivas ( Figura 3A ), verificou-se que ~ 20% doCD8 CP, representando os clones que expressam a molécula CD95 e portando TCRs específicos para Ag do tumor (Figura suplementar 1), sofreram proliferação em comparação com células T CD8 virgens (CD8N, Figura 3B). Usando modelos ToC (Figura 3C), foi avaliada a capacidade do CD8C-P de detectar e reagir à quimioatração por alarminas liberadas por células cancerígenas, espelhando assim o homing de células T CD8 específicas do tumor para o TME (etapa 6 do ciclo de imunidade ao câncer). Especificamente, os ToCs foram empregados para permitir e seguir a atração química e física e a interação entre células imunes não aderentes, movendo-se da câmara imune para a câmara tumoral e células cancerígenas aderentes que repousam na câmara tumoral. Microfotografias tiradas em diferentes momentos pós-co-cultura mostraram uma migração progressiva de CD8C-P para células cancerígenas através do cruzamento de microcanais (Figura 3C). De interesse foi que as células imunes que se aproximam podem interagir de forma estável e eficiente com as células cancerígenas em 24 h, 48 h e 72 h (Figura 3D). Finalmente, foi analisada a resposta do CD8C-P alojado no TME e reestimulado por Ags (CD8E) apresentado no câncer, avaliando-se, por meio do mFC, os níveis de expressão superficial dos marcadores de ativação CD69 precoce (Figura Suplementar 2A) e CD44 tardio, CD25 (Figura 4A), bem como a expressão de membrana dos marcadores de reatividade tumoral CD137 (Figura 4B) e CD107a (Figura Suplementar 2B) em comparação com CD8N e CD8C-P (Etapa 7 do ciclo de imunidade ao câncer). Também avaliamos a produção intracelular das moléculas citotóxicas Grz-B (Figura 5A) e IFN-γ (Figura 5B). Curiosamente, todos esses níveis de marcadores aumentaram progressiva e significativamente e atingiram uma escolha de expressão em 72 h de co-cultura, refletindo assim uma ativação tardia e eficaz. Assim, as células MCA205 co-cultivadas cognatas sofreram níveis significativos de morte mediada por CD8E, conforme revelado por um sistema de análise de células vivas e análises de mFC (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do protocolo experimental para estudar o ciclo de imunidade ao câncer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig02.jpg"> Figura 2: Captação e apresentação de Ag de células cancerígenas mediadas por DC. (A) Estratégia de gating para análise de DC mFC. Durante a aquisição do mFC e a análise dos dados, as amostras foram fechadas sequencialmente (1) para morfologia plotando FSC-A e SSC-A; (2) para singlets plotando FSC-A e FSC-H; e (3) para viabilidade traçando Near-IR e SSC-A. As células viáveis foram finalmente analisadas para o marcador de superfície específico CD11c. (B) Análise mFC da capacidade dos CD11c + DCs de engolir corpos apoptóticos de células cancerígenas MCA205 marcadas com PKH67 e irradiadas por UV a 37 ° C e 4 ° C (etapas 1-3 do ciclo de imunidade ao câncer). Gráficos biparamétricos representativos e um histograma mostrando a porcentagem de células CD11c + PKH67 + (média ± s.e.m. com um ponto de dados individual, um experimento representativo de três é mostrado). (C) análise mFC de moléculas de superfície de ligantes de checkpoint coestimulatório e imunológico em DCs pré e pós-fagocitose (DCN e DCPHAGO, respectivamente; etapa 4 do ciclo de imunidade ao câncer). Os histogramas representam a porcentagem (média ± s.e.m. e pontos de dados individuais, n = 3 experimentos independentes) de células CD11c+CD86+, CD11c+MHC-II+ e CD11c+PDL1+. (B) Teste t de Student bilateral não pareado com correção de Welch em comparação com 4 °C. (C) Teste t de Student bilateral não pareado em comparação com DCN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig03.jpg"> Figura 3: Proliferação de células T CD8 e tráfego para células cancerígenas após cross-priming. (A) Estratégia de bloqueio para análise de células T CD3 + CD8 + . Durante a aquisição do mFC e a análise dos dados, as amostras foram fechadas sequencialmente (1) para morfologia plotando FSC-A e SSC-A; (2) para singlets plotando FSC-A e FSC-H; e (3) para viabilidade traçando Aqua e SSC-A. As células viáveis foram finalmente analisadas para a coloração EdU de proliferação específica. (B) análise mFC da expansão clonal de células T CD8 por meio da tecnologia EdU (etapa 5 do ciclo de imunidade ao câncer). Os histogramas monoparamétricos representam a porcentagem (média ± s.e.m. com ponto de dados individual, um experimento representativo em cada três é mostrado) de proliferação de células T CD8 virgens de EdU+ e cruzadas (CD8N e CD8C-P, respectivamente). (C, D) Modelo microfluídico ToC de células T CD8 homing para o TME (etapa 6 do ciclo de imunidade ao câncer). (C) Planimetria esquemática de um ToC. As duas câmaras de cultura laterais, que abrigam células imunes e cancerígenas, são conectadas por canais de tamanho mícron (largura = 12 μm, comprimento = 10 μm, altura = 10 μm). Os compartimentos de cultura de células têm 1 mm de largura, 8 mm de comprimento e 100 μm de altura. As microfotografias geradas durante as gravações de lapso de tempo representam a migração de CD8C-P para células cancerígenas em diferentes momentos (de 0-72 h; barra de escala, 100 μm). (D) São mostrados gráficos que representam as trajetórias de CD8C-P individuais (n = 100 células por condição) em direção às células-alvo cancerígenas (manchas pretas) dentro de 24-72 h (barra de escala, 10 μm). (A) Teste t de Student bilateral não pareado com correção de Welch em comparação com CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig04.jpg"> Figura 4: Reatividade tumoral de células T CD8 após reestimulação com células cancerígenas vivas. (A) Análise mFC dos níveis de expressão superficial de CD44, marcadores de ativação de CD25 em células T CD8 reestimuladas por Ags (CD8E) apresentados ao câncer (etapa 7 do ciclo de imunidade ao câncer) até 72 h. Gráficos biparamétricos representativos e um histograma mostrando a porcentagem de células T CD44 + CD25 + CD8 em CD8N, CD8CP, CD8E em 48 h e 72 h (média ± s.e.m. e pontos de dados individuais, n = 3 experimentos independentes). (B) análise mFC da expressão de membrana do marcador de reatividade tumoral CD137 em CD8E. Gráficos biparamétricos representativos e um histograma mostrando a porcentagem de células T CD137 + CD8 em CD8N, CD8CP, CD8E em 48 h e 72 h (média ± s.e.m. e pontos de dados individuais, um experimento representativo de três é mostrado). (A, B) Teste ANOVA ordinário de uma via seguido de correção de Bonferroni em comparação com CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig05.jpg"> Figura 5: Produção de células T CD8 de Grz-B e IFN-γ. (A) Análise mFC dos níveis de expressão intracelular de Grz-B em CD8E (etapa 7 do ciclo de imunidade ao câncer). Gráficos de histograma representativos mostrando o MFI de células T Grz-B + CD8 em CD8N, CD8CP, CD8E em 48 h e 72 h (média ± s.e.m. e pontos de dados individuais, n = 3 experimentos independentes). (B) análise mFC de IFN-γ intracelular em CD8E. Gráficos de histograma representativos mostrando a porcentagem de células T IFN-γ+ CD8 em CD8N, CD8 CP, CD8E em 48 h e 72 h (média ± s.e.m. e pontosde dados individuais, n = 3 experimentos independentes). (A, B). Teste ANOVA ordinário de uma via seguido de correção de Bonferroni em comparação com CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig06.jpg"> Figura 6: Morte tumoral mediada por células T CD8. (A) Análise mFC da morte de células CD45- impulsionada por CD8E após 72 h de co-cultura (etapa 7 do ciclo de imunidade ao câncer). Os histogramas representam a porcentagem (média ± s.e.m. e pontos de dados individuais, n = 3 experimentos independentes) de células PI+CD45− moribundas. (B) Análise de células vivas da morte de células cancerígenas mediadas por CD8E. Imagens representativas e um gráfico mostrando a incorporação de Cytotox Red por células cancerígenas moribundas e mortas (um experimento representativo de três é mostrado). (A) Teste t de Student bilateral não pareado em comparação com células cancerígenas isoladas (CTR). (B) Teste de Mann-Whitney bicaudal comparado com CTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Os gráficos de histograma representam o IMF de CD95+TCR-β+ CD8N e CD8C-P. Teste t de Student bilateral não pareado em comparação com CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%201_revised.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Ativação de células T CD8. (A) Análise mFC dos níveis de expressão de superfície do marcador de ativação precoce de CD69 em CD8E (etapa 7 do ciclo de imunidade ao câncer). Gráficos biparamétricos representativos e um histograma mostrando a porcentagem de células T CD69 + CD8 em CD8N, CD8CP, CD8E em 48 h e 72 h (média ± s.e.m. e pontos de dados individuais, um experimento em três). (B) análise mFC da expressão de membrana da proteína associada ao lisossomo CD107a em CD8E. Gráficos biparamétricos representativos e um histograma mostrando a porcentagem de células T CD107a + CD8 em CD8N, CD8CP, CD8E em 48 h e 72 h (média ± s.e.m. e pontos de dados individuais, um experimento representativo de três é mostrado). (A, B). Teste ANOVA ordinário de uma via seguido de correção de Bonferroni em comparação com CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%202_revised%20.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Quadro suplementar 1: Mistura de anticorpos na etapa 3.3.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui, detalhamos um protocolo simples, rápido e confiável assistido por citometria de fluxo multiparamétrico e tumor em um chip para monitorar e caracterizar as etapas que constituem o ciclo de imunidade ao câncer. De fato, uma compreensão completa das interações entre câncer e células imunológicas fornece insights críticos para superar os tumores e orientar o atendimento clínico.

Sistemas de co-cultura in vitro para reproduzir o ciclo de imunidade ao câncer

Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between ...

co-culture-in-vitro-systems-to-reproduce-the-cancer-immunity-cycle

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Expansão ex vivo de células tumorais T-reativa por Meios de 1/Ionomycin Bryostatin eo Common Gamma Cadeia Formulação Citocinas

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de desafio tumoral repetitivo para avaliar o potencial de morte tumoral repetitiva das células T CAR durante altas cargas de células tumorais. Além disso, as células T CAR podem ser analisadas usando citometria de fluxo para determinar as diferentes subpopulações de células T CAR na amostra.

Ensaio de desafio de tumor repetitivo: um ensaio de cultura in vitro para avaliar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para potencial de morte de tumor repetitivo

As células iniciadoras de tumor (TICs) podem representar um alvo terapêutico viável para o tratamento do câncer de ovário, uma doença altamente recorrente e fatal. Apresentamos um protocolo para condições de cultura que enriquecem para esta população de células altamente tumorigênicas.

Em Enriquecimento vitro de câncer de ovário de iniciação Células Tumorais

Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

Aqui, descrevemos um método in vitro co-cultura para recursivamente desafio tumor-alvo as células T, que permite a análise fenotípica e funcional da atividade antitumoral de célula T.

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho experimental que permite a análise ex vivo da estimulação de células T humanas em um sistema de co-cultura alogênica com células tumorais pré-tratadas.

Análise da atividade de células T humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas

O protocolo descreve um método para criar um modelo organoide de câncer colorretal derivado do paciente (CCR) co-cultivado com linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) para estudar suas interações e potencial terapêutico. Este modelo fornece uma plataforma pré-clínica para explorar as respostas imunes no microambiente tumoral e prever a eficácia da terapia baseada em TIL para o tratamento personalizado do CCR.

Estabelecimento de um sistema de co-cultura de organoides tumorais colorretais derivados de pacientes e linfócitos infiltrantes de tumor (TILs)

Este protocolo descreve a reprogramação in vivo de células cancerígenas de camundongo em células dendríticas tipo 1 dentro do microambiente tumoral por meio da expressão forçada dos fatores de transcrição PU.1, IRF8 e BATF3.

Reprogramação In Vivo Tratável de Células Tumorais para Células Dendríticas Convencionais Tipo 1

Aprenda a monitorar o ciclo de imunidade ao câncer usando sistemas de co-cultura in vitro com citometria de fluxo e modelos tumor-on-a-chip. Este protocolo oferece uma abordagem simples e confiável para estudar interações entre células cancerígenas e imunes.

Sistemas de co-cultura in vitro para reproduzir o ciclo de imunidade ao câncer

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