Name: Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda técnicas de microscopia de folha de luz para imagem de embriões de peixe-zebra em estágios iniciais. Este método oferece resolução celular e reduz fotobranqueamento em estudos de biologia do desenvolvimento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo de microscopia de folha de luz multiview refinada para embriões de peixe-zebra

<ol><li>Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+and+its+potential+for+understanding+developmental+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Keller, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+morphogenesis%3A+Technological+advances+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168(2013).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+Light+sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+Light+sheet+microscope+for+imaging+mouse+pre-implantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development.</a> Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+Light+sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+image+fusion+improves+resolution+in+three-dimensional+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy.</a> Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).</li>
<li>Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+imaging+axis+microscopy+improves+resolution+for+thick-sample+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications.</a> Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+for+long-term+light+sheet+microscopy+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+symmetry+of+zebrafish+embryos+requires+somite+surface+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension.</a> Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).</li>
<li>Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+imaging+and+analysis+identify+pan-embryo+cell+dynamics+of+germlayer+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish.</a> Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hörl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigStitcher%3A+Reconstructing+high-resolution+image+datasets+of+cleared+and+expanded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples.</a> Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).</li>
<li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Icha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+sheet+fluorescence+microscopy+to+image+zebrafish+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development.</a> J Vis Exp. (110), e53966(2016).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+Light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).</li>
<li>Aigouy, B., Prud'homme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantitative+analysis+of+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues.</a> Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).</li>
<li>Mancini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+size+and+deltaA+expression+predict+adult+neural+stem+cell+decisions+along+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression.</a> Science Adv. 9, 7519(2023).</li>
<li>Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+timing+of+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis+to+external+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+remodeling+of+extracellular+matrix+orients+epithelial+sheet+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding.</a> Science Adv. 9, 2154(2023).</li>
<li>Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+multicellular+specimens+with+real-time+optimized+tiling+Light+sheet+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy.</a> Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+Light+sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>York, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+early+endosomal+maturations+emerge+from+a+stochastic+trigger-and-convert+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism.</a> Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathfinding+by+identified+zebrafish+motoneurons+in+the+absence+of+muscle+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers.</a> J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).</li>
<li>Rohde, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+timing+drives+the+vertebrate+segmentation+clock%27s+wave+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern.</a> eLife. , 13:RP93764 (2024).</li>
<li>Haynes, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLC4+shapes+axon+arbors+during+development+and+mediates+adult+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior.</a> eLife. 11, e74270(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agarose, baixa temperatura de gelificação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12022</td><td></td></tr><tr><td>Versão FIJI</td><td></td><td></td><td>: ImageJ 1.54f</td></tr><tr><td>Contas de látex, poliestireno modificado com carboxilato, vermelho fluorescente, 0.5 &mu; m tamanho médio de partícula, suspensão aquosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcrição</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM1340</td><td>Para transcrição in vitro de plasmídeo H2A-mCherry</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Manga de PTFE AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Parede +/-0.05&nbsp;</td><td>Adtech Inovações em Fluoroplásticos</td><td>STW15</td><td>Tubos de PTFE</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>Limpador Ultrassônico</td><td>Labman</td><td>LMUC3</td><td>Ultrasonicator</td></tr><tr><td>Zeiss LightSheet 7 System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Orientar a amostra de maneira precisa é uma parte vital do uso eficiente de uma configuração de microscopia. No entanto, a orientação manual das amostras muitas vezes não é possível ao usar um sistema de folha de luz multiview, dada a necessidade de preparar as amostras em um tubo. Portanto, para verificar se existem posições estereotipadas que os embriões assumem dentro do córion, os embriões de peixe-zebra foram fotografados em 70% de epiboly (cerca de 7 h pós-fertilização (hpf)), uma vez que a imagem de lapso de tempo da gastrulação aos estágios iniciais de somitos foi o foco deste estudo. Quando as amostras foram preparadas imediatamente antes da imagem a 70% de epibolia, os embriões não mostraram orientação específica que é frequentemente observada nas amostras. Como isso geralmente não é desejável, as amostras foram preparadas bem antes da gastrulação e armazenadas em tubos de microcentrífuga na temperatura apropriada até o início da imagem. Nessas condições, a 70% de epibólia (N = 3; n = 87 embriões), as orientações embrionárias podem ser classificadas em (1) Horizontal, quando o eixo animal-vegetal (AV) do embrião era ortogonal ao eixo longo do tubo polimérico, (2) Vertical, quando o eixo AV era paralelo ao eixo longo do tubo polimérico, e, (3) Oblíquo, quando o eixo AV estava em ângulo agudo (Figura 3A). A posição horizontal foi a menos representada, enquanto as posições vertical e oblíqua foram igualmente observadas (Figura 4).
Quando os embriões foram deixados nas trompas, os embriões ficaram estáveis nessas respectivas posições até 90% epiboly, após o que a maioria dos embriões mudou de orientação. Portanto, uma segunda rodada de documentação de orientações no estágio de brotamento da embriogênese (cerca de 10 hpf) foi necessária para levar em conta as orientações alteradas. Isso foi realizado para amostras preparadas independentemente. Para a imagem dos estágios iniciais do somito, foi relatado anteriormente que um embrião com sua notocorda ortogonal ao eixo longo do tubo de polímero era a orientação ideal, pois permite a visualização de múltiplos somitos bilaterais se formando ao longo do eixo15. Quando as amostras foram preparadas antes da gastrulação (N = 3, n = 93 embriões), cerca de 25% dos embriões exibiram essa orientação (Figura 4) e esses embriões permaneceram estáveis nessa orientação até pelo menos o estágio de 8-somito, consistente com relatos anteriores15. O restante dos embriões exibiu várias outras orientações no estágio de brotamento (classificados na Figura 3B e Figura 4); no entanto, muitos deles foram reorientados para a posição horizontal durante a formação inicial do somito. Curiosamente, uma porcentagem semelhante de embriões apresentou uma orientação horizontal no estágio de gema, independentemente de a amostra ter sido preparada antes da gastrulação, a 70% de epibolia ou imediatamente antes do estágio de gema. Assim, o tempo de preparação da amostra parece menos crítico para a orientação horizontal de interesse para os estágios de imagem do somito, ao contrário do que foi observado para a imagem em 70% de epibólia.
A vantagem de um sistema multiview é a capacidade de visualizar a mesma amostra de vários ângulos. No entanto, para embriões de peixe-zebra nos estágios mencionados, o número de visualizações necessárias para obter a resolução celular em todo o embrião não é claro. Para caracterizar isso, os embriões de peixe-zebra foram fotografados usando uma objetiva de 20x/1 NA no braço de detecção com um fator de zoom de 1, que correspondeu a uma espessura de folha leve de 4,57 μm. Sob essas configurações, o embrião cobriu todo o campo de visão de uma câmera sCMOS com um tamanho de pixel de 6,5 μm e uma área de 1920 por 1920 pixels. A microinjeção de mRNA para um fluoróforo marcado com histonas (H2A-mCherry) em embriões de estágio de 1 célula obtidos de uma linhagem transgênica que marcou filamentos de actina (Utr-GFP) permitiu a visualização de núcleos e membranas celulares no embrião. Para realizar a fusão multiview de embriões com diferentes intervalos angulares, a aquisição de 360° dos embriões transgênicos duplos, bem como dos grânulos no tubo, foi realizada a cada 30° (n = 3 embriões a 70% de epibolia; n = 3 embriões em estágio de gema) ou 45° (n = 3 embriões em 70% de epíbulo; n = 3 embriões em 70% de epíbulo; n = 3 embriões em fase de gema) intervalos com cerca de 100 cortes em cada ângulo e um intervalo de corte de 2 μm. Ao pular ângulos alternados durante o processamento da imagem, as aquisições de 30° e 45° forneceram adicionalmente os conjuntos de dados de 60° e 90°.
As imagens adquiridas foram então registradas usando as informações do grânulo e os detalhes do registro foram transferidos para o conjunto de dados do embrião, conforme descrito na seção do protocolo. O registro bem-sucedido usando o plug-in BigStitcher foi alcançado para as diferentes aquisições, exceto para o conjunto de dados de 90°, o que provavelmente se deve à menor cobertura da amostra de cada ângulo. Para superar isso, os embriões foram fotografados a cada 90 ° com cerca de 400 fatias em cada ângulo e um intervalo de fatia de 2 μm, nos estágios de 70% de epibólia e gema, que foram registrados com sucesso (n = 3 embriões para cada estágio).
O próximo passo foi realizar a fusão multiview e a deconvolução dos conjuntos de dados registrados. Isso foi feito com redução de 4x para acelerar a computação. Como visto na representação de núcleos a partir de vistas individuais e um embrião reconstruído com múltiplas visualizações (Figura 5), as vistas individuais cobrem um campo de visão menor, que, após a fusão, produziu uma imagem de todo o embrião. Para a representação, os núcleos foram detectados usando o Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon), um plugin baseado em FIJI, que pode ser adicionado na seção "Gerenciar sites de atualização" do menu "Ajuda" em FIJI e acessado no menu de plugins uma vez adicionado. Para a detecção, as respectivas imagens foram primeiro convertidas para o formato XML / hdf5 e, em seguida, a detecção nuclear foi realizada usando o plug-in 'Detecção' do Mastodon com um detector DoG (Diâmetro 6 μm e Limite de Qualidade 80).
Entre as diferentes imagens fundidas, o conjunto de dados de 90° mostrou um fundo muito alto mais profundo na amostra, tornando-o inadequado para realizar qualquer quantificação. Assim, ao contrário de amostras menores, como embriões de Drosophila, que frequentemente foram fotografados com um intervalo de 90° em outros estudos 9,22, o mesmo não é recomendado para imagens de embriões de peixe-zebra iniciais usando uma objetiva de 20x/1 NA. Entre os conjuntos de dados fundidos de 30°, 45° e 60°, qualitativamente, não houve diferença substancial nas informações dos núcleos (Figura 6B, linha superior); no entanto, estruturas mais finas, como limites de células, pareciam muito melhor resolvidas com o conjunto de dados fundidos de 30 ° em comparação com o restante (Figura 6C, linha superior).
Para confirmar essa observação, o Mastodon foi usado para detectar núcleos nas imagens fundidas obtidas a partir de imagens a cada 30°, 45° e 60°. Três regiões nas imagens fundidas, uma a uma profundidade de 20 μm (Figura 6A), 50 μm e 100 μm da superfície do embrião, foram escolhidas para a análise. Para comparar a eficiência da detecção de núcleos entre imagens, a detecção foi realizada conforme descrito acima, com parâmetros idênticos em imagens fundidas de diferentes intervalos angulares. Em todas as regiões analisadas, todos os núcleos foram detectados, independentemente das imagens fundidas obtidas a cada 30°, 45° ou 60° (Figura 6B, linha inferior). Assim, estruturas globulares, como núcleos, podem ser visualizadas em qualquer um dos intervalos angulares acima sem perda de informação.
Para analisar os limites celulares, foi utilizado o Tissue Analyzer23, um plugin FIJI usado rotineiramente para segmentar células 24,25,26. Semelhante ao Mastodon, o plug-in Tissue Analyzer pode ser adicionado na seção "Gerenciar sites de atualização" do menu "Ajuda" em FIJI e acessado no menu de plug-ins uma vez adicionado. Os limites das células foram segmentados usando o algoritmo de bacia hidrográfica com parâmetros padrão e um forte desfoque variando de 1,5 a 2, dependendo da profundidade do tecido, e um desfoque fraco de 1. Esses parâmetros foram mantidos constantes em todas as análises, facilitando uma comparação direta. Quando as imagens segmentadas foram comparadas manualmente com as imagens de entrada originais, foram observados erros, onde o software falhou em detectar um limite de célula ou desenhou limites de célula inexistentes (Figura 6C, linha inferior). O número de erros cometidos pelo plug-in do analisador de tecidos foi normalizado para o número total de ligações detectadas na região e calculado como 'Erro de segmentação de limite'. Embora esses erros estivessem presentes em todas as regiões analisadas, o número de erros aumentou drasticamente nas imagens fundidas obtidas a partir de imagens em intervalos angulares de 45° e 60°, em comparação com 30° (Figura 6D). Isso indicou que a resolução nas imagens fundidas era cada vez pior quando o intervalo angular era aumentado. Assim, para segmentar estruturas mais finas, como limites de células, um intervalo angular mais estreito permite um processamento mais fácil a jusante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig01.jpg"> Figura 1: Preparo de amostras usando tubos de polímero. (A) Um tubo de polímero dos tubos de microcentrífuga armazenados é retirado usando uma pinça. (B) Conectando o tubo à ponta de uma micropipeta de 200 μL. (C) Aspiração de embriões com a ajuda de uma pipeta para dentro do tubo. (D, E) Um tubo de polímero com embriões em estágio de botão visíveis na parte inferior do tubo. (F) Os tubos de polímero são colocados em uma placa de Petri com E3 para solidificar a agarose. (G) Armazenamento dos tubos de polímero em um tubo de microcentrífuga preenchido com E3. (H) Suporte de amostra montado com o tubo de polímero montado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig02.jpg"> Figura 2: Fluxo de trabalho de análise de imagem multivisualização e registro usando contas. (A) O pipeline de análise de imagem multivisualização. (B) A imagem mostra a janela "Multiview Explorer" no BigStitcher, um plugin FIJI, onde cada visualização aparece como uma única linha e contém informações sobre o ângulo, canal, registro, pontos de interesse e PSF. Todos os comandos discutidos no protocolo aparecem quando uma visualização é selecionada e seguida por um clique com o botão direito, conforme ilustrado no menu pop-up. As visualizações selecionadas podem ser visualizadas na janela BigDataViewer, como mostrado. (C) Uma imagem representativa do grânulo antes (esquerda) e depois do registro (direita) obtida a partir de imagens em intervalos angulares de 30 °. Todas as vistas angulares foram selecionadas e exibidas. Barras de escala: 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig03.jpg"> Figura 3: Visão geral das orientações padrão do embrião. Imagens representativas das orientações em que os embriões se enquadram no córion em 70% dos estágios de epibólia (A) e botão (B). A linha superior em cada painel mostra imagens de campo claro obtidas do sistema de folha de luz, e a linha inferior mostra desenhos animados representativos. As setas em (B) indicam a posição da notocorda, que foi usada para identificar a orientação. Ap, poste animal; Vp, pólo vegetal; A, anterior; P, posterior. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig04.jpg"> Figura 4: Estatísticas de diferentes orientações embrionárias. (A) A coluna empilhada indica as porcentagens de embriões que se enquadram nas orientações indicadas em 70% epiboly quando as amostras são preparadas antes da gastrulação. (B) As colunas empilhadas indicam as porcentagens de embriões que se enquadram nas orientações indicadas nos estágios de gema, quando as amostras são preparadas antes da gastrulação (esquerda), em 70% de epiboly (meio) e nos estágios de gema (direita). N, o número de ninhadas independentes das quais os embriões foram obtidos; n, o número total de embriões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig05.jpg"> Figura 5: Representação de núcleos de um embrião reconstruído multiview. (UMA)O gráfico de dispersão 3D representa núcleos detectados em um embrião reconstruído com múltiplas visualizações fotografado em um intervalo angular de 30̛°. Cada círculo representa um núcleo e o centróide das posições dos núcleos é plotado. As coordenadas nucleares foram obtidas usando o Mastodon, um plugin FIJI. (B) Gráficos de dispersão 3D de núcleos de três vistas representativas do mesmo embrião - as representações estão separadas por 60 °. As cores para cada núcleo foram atribuídas aleatoriamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig06.jpg"> Figura 6: Comparação de informações em escala celular em imagens fundidas. (A) A imagem à esquerda mostra um instantâneo de um embrião reconstruído com múltiplas visualizações a uma profundidade de 20 μm da superfície. O círculo amarelo representa a região usada para análise posterior. Barras de escala: 50 μm (em todos os painéis). (B) Imagens brutas representativas de núcleos a 20 μm de profundidade da superfície do embrião a partir de três conjuntos de dados fotografados a cada 30 °, 45 ° e 60 °, respectivamente (topo). Núcleos detectados (em verde) nas mesmas imagens pelo Mastodon, um plugin FIJI (abaixo). (C) Imagens brutas representativas a 20 μm de profundidade da superfície do embrião a partir de três conjuntos de dados fotografados a cada 30 °, 45 ° e 60 °, respectivamente, usando o marcador de actina, Utr-GFP (topo). Os limites segmentados pelo Tissue Analyzer, um plug-in FIJI, são mostrados para as mesmas imagens (parte inferior). As setas indicam erros cometidos pelo Tissue Analyzer na segmentação de limites, com a seta amarela representando um limite ausente e a seta branca representando limites detectados incorretamente quando visualmente nenhum limite parece existir. (D) O gráfico de caixa mostra a porcentagem de erros que o Tissue Analyzer cometeu entre embriões reconstruídos multiview fotografados a cada 30°, 45° e 60° em diferentes profundidades. As barras de erro indicam 1,5 vezes o intervalo interquartil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

light-sheet-microscopy-imaging-mounting-strategies-for-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este artigo descreve a preparação de amostras para microscopia de fluorescência de folha de luz. Ele também demonstra um método para montar embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo, o que permite a gravação de filmes de longo lapso de tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas.

Preparação de amostras de microscopia de folha de luz: montagem de embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo

O desenvolvimento do peixe-zebra pode ser seguido ao longo de dias com microscopia folha de luz quando os embriões estão embutidos em tubos de polímero opticamente clara com agarose de baixa concentração.

Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish

A microscopia de fluorescência de folha de luz é uma excelente ferramenta para imagens do desenvolvimento embrionário. Permite a gravação de filmes de longo lapso de tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas. Demonstramos sua aplicação para o desenvolvimento de imagens do olho do peixe-zebra em amplas escalas espaço-temporais e apresentamos um pipeline para fusão e deconvolução de conjuntos de dados multiview.

Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

Aqui, apresentamos um método de montagem versátil que permite a imagem de lapso de tempo de longo prazo do desenvolvimento posterior do corpo de embriões vivos de peixe-zebra sem perturbar o desenvolvimento normal.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Aqui, é fornecido um protocolo para imagens de lapso de tempo de morfogênese ocular usando um microscópio de folha de luz comercialmente disponível e uma estação de trabalho de processamento de imagem para analisar os dados resultantes. Este protocolo detalha os procedimentos para anestesia embrionária, incorporando em baixa temperatura de fusão agarose, suspensão na câmara de imagem, configuração dos parâmetros de imagem e, finalmente, analisando os dados de imagem usando software de análise...

Visualizando Morfogênese Ocular por Microscopia de Folha de Luz usando rx3:GFP Zebrafish Transgênico

Descrevemos ferramentas otimizadas para estudar o coração de zebrafish in vivo com microscopia de fluorescência de folha de luz. Especificamente, sugerimos linhas transgênicas cardíacas brilhantes e apresentamos novas técnicas de incorporação e imobilização suaves que evitam defeitos de desenvolvimento e coração. Um possível pipeline de aquisição e análise de dados adaptado à imagem cardíaca também é fornecido.

Microscopia de Folha de Luz da Dinâmica Cardíaca Rápida em Embriões de Zebrafish

O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento de órgãos em embriões de peixe-zebra, usando um microscópio de dissecação de fluorescência capazes de realizar seccionamento óptico e estratégias simples de reajuste para corrigir desvio focal e planar.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

Aqui, apresentamos uma nova técnica para cultivar embriões de galinha ex ovo para imagens de lapso de tempo usando luz transmitida e microscopia de fluorescência. O sanduíche de papel de filtro submerso é uma variante da técnica de suporte de papel de filtrobem estabelecida 1 que permite a cultura de embriões de pintinhos totalmente submersos em um meio de cultura líquido.

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo Ex Ovo Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Aprenda técnicas de microscopia de folha de luz para imagem de embriões de peixe-zebra em estágios iniciais. Este método oferece resolução celular e reduz fotobranqueamento em estudos de biologia do desenvolvimento.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Explorar mais vídeos