Name: Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprenda métodos reprodutíveis para avaliar o comprometimento precoce de células T FH específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo. Esta técnica utiliza citometria de fluxo e manipulação gênica por vetor retroviral para otimizar o design de vacinas.

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Este estudo foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32300785 a X.C.), do Programa Nacional de Pós-Doutorado da China para Talentos Inovadores (nº. BX20230449 a X.C.), e o Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia (nº 2021YFC2300602 a L.Y.).

Decifrando o comprometimento precoce de células T auxiliares foliculares na infecção aguda por LCMV

<ol><li>O'shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+follicular+helper+cell+biology%3A+A+decade+of+discovery+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases.</a> Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).</li>
<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper t cells.</a> Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS+receptor+instructs+T+follicular+helper+cell+versus+effector+cell+differentiation+via+induction+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6.</a> Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+expressing+follicular+helper+CD4+T+cells+are+fate+committed+early+and+have+the+capacity+to+form+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory.</a> J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).</li>
<li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+BLIMP-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEF1+and+TCF1+orchestrate+T%28FH%29+differentiation+by+regulating+differentiation+circuits+upstream+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6.</a> Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF1+is+required+for+the+t+follicular+helper+cell+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection.</a> Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+TCF-1+initiates+the+differentiation+of+T%28FH%29+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection.</a> Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).</li>
<li>Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+control+the+expression+and+activity+of+bcl-6+in+th1+cells+to+regulate+flexibility+with+a+TFH-like+gene+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile.</a> Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).</li>
<li>Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+STAT1+is+required+for+IL-6-mediated+bcl6+induction+for+early+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation.</a> J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+ezh2+primes+the+early+differentiation+of+follicular+helper+T+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection.</a> Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+programs+T%28FH%29+differentiation+by+integrating+phosphorylation-dependent+activation+of+bcl6+and+polycomb-dependent+repression+of+p19ARF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF.</a> Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METTL3-dependent+m%286%29A+modification+programs+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).</li>
<li>Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+is+a+potent+negative+regulator+of+TFH+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation.</a> J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+KLF2+restrains+CD4%2B+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation.</a> Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+e3+ubiquitin+ligase+itch+is+required+for+the+differentiation+of+follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells.</a> Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).</li>
<li>Baumjohann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+cluster+mir-17%7E92+promotes+TFH+cell+differentiation+and+represses+subset-inappropriate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression.</a> Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+complex+mTORC2+promotes+the+longevity+of+virus-specific+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+by+preventing+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis.</a> Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).</li>
<li>Hale, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+memory+CD4%2B+T+cells+with+commitment+to+T+follicular+helper-+and+T+helper+1-cell+lineages+are+generated+after+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection.</a> Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium-GPX4+axis+protects+follicular+helper+t+cells+from+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis.</a> Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).</li>
<li>Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+MHC-class+II-restricted+TCR-transgenic+mice%3A+Effects+on+humoral+and+cellular+immune+responses+after+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection.</a> Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).</li>
<li>Grosjean, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+mouse+splenic+t+cells+for+ex+vivo+and+in+vivo+T+cell+receptor+stimulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).</li>
<li>Dowling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+bottom-up+proteomic+analysis+of+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).</li>
<li>Choi, Y. S., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+expression+in+TCR+transgenic+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells.</a> Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+expansion+and+retroviral+transduction+of+mouse+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells.</a> J Immunol Methods. 488, 112931(2021).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+CXCR5-+expressing+CD8%28%2B%29+T+cells+curtail+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection.</a> Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+B+helper+T+cells+express+CXC+chemokine+receptor+5%2C+localize+to+B+cell+follicles%2C+and+support+immunoglobulin+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production.</a> J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+mTORC1+promotes+the+generation+and+suppressive+function+of+follicular+regulatory+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells.</a> Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatase+pten+links+platelets+with+immune+regulatory+functions+of+mouse+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+identification+of+T%28fh%2913+cells+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human.</a> J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

A pesquisa no campo das células TFH tem sido destacada desde a descoberta da função especializada das células TFH em ajudar as células B. Estudos acumulados indicaram que a diferenciação de células TFH é um processo multiestágio e multifatorial30, em que o compromisso do destino das células TFH é determinado no estágio inicial5. Portanto, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes às células TFH diferenciadas precocemente é crucial para a biologia das células TFH e o design racional da vacina. Aqui, fornecemos métodos para acessar o compromisso de destino inicial de células TFH específicas do vírus e para manipular a expressão gênica em células TFH diferenciadas precocemente, explorando o modelo de infecção viral LCMV Armstrong, camundongo SM transgênico TCR e transdução mediada por retrovírus.
O receptor de quimiocina CXCR5 é um importante marcador de superfície que distingue as células TFH de outros subconjuntos de células TH CD4 + 6,7,8,31, necessitando assim do método de coloração CXCR5 de alta especificidade e sensibilidade na pesquisa com células T FH. No estudo, um método de coloração de estreptavidina-biotina CXCR5 em três etapas foi demonstrado na identificação do subconjunto de células TFH (Figura 1C). Embora a perda de especificidade seja um problema complicado para abordagens de coloração de anticorpos de dois ou três estreptococos de alta sensibilidade, verificou-se que o sinal de fluorescência pela coloração de anticorpos CXCR5 em três etapas se sobrepôs quase completamente ao sinal GFP em células T CXCR5-GFP29 repórter SM CD4 + no dia 3 após a infecção (Figura 1D), sugerindo a obtenção de especificidade e sensibilidade pelo método de coloração de anticorpos CXCR5 em três etapas. De fato, essa estratégia de coloração CXCR5 de três estreptococos é testada e confiável e ajudou os pesquisadores a investigar melhor a biologia das células TFH 11,14,15,21, bem como outros tipos de células T que expressam CXCR5 29,32.
Após a infecção e imunização, o compromisso com o destino das células TFH é geralmente modelado por uma diferenciação bifurcada de células T CD4 + virgens em células TFH ou células TH efetoras não TFH 2,3,30. Este estudo mostrou a bifurcação equilibrada de células TFH e TH1 em células T SM CD4 + transferidas. Além disso, essas células T CD4+ SM transferidas são de quantidade celular adequada no estágio inicial da infecção, atuando assim como um modelo adequado para estudar a diferenciação de células TFH. Certamente, a expressão ectópica de Bcl-6 mediada por retrovírus em células T SM CD4+ transferidas foi fortemente tendenciosa para a diferenciação de células TFH em comparação com a de células T CD4+ de controle (86,6% vs. 53,8%) (Figura 3C), o que está alinhado com o relatório anterior6 e comprova ainda mais a precisão dos protocolos descritos no estudo. Alternativamente, os protocolos acima mencionados também podem ser aplicados ao knock-down mediado por retrovírus de genes interessados (por exemplo, bcl6, Tcf7) em células T SM CD4 + ativadas precocemente11 (dados não mostrados).
Uma limitação no protocolo é a questão do tempo (mais de 2 h no total) e o processo de várias etapas do método de coloração CXCR5 de três etapas. Alternativamente, os métodos de coloração CXCR5 de uma etapa18,33 ou 4,9,34 de duas etapas também foram aplicados na pesquisa com células TFH. Uma comparação da especificidade/sensibilidade desses métodos de coloração CXCR5 é necessária.
Em resumo, o estudo atual forneceu protocolos para acessar células TFH específicas de vírus diferenciados precocemente e investigar gene(s) interessado(s) que potencialmente regulam a diferenciação de células TFH . Esses protocolos alimentarão as investigações do comprometimento precoce do destino das células TFH .

Encontrando diferentes patógenos ou ameaças, as células T CD4 + virgens adaptam suas respostas imunes diferenciando-se em vários subconjuntos de células T auxiliares (TH) com funções especializadas1. No cenário de infecção viral aguda, uma grande parcela de células T CD4+ virgens se diferencia em células T auxiliares foliculares (TFH) que fornecem ajuda às células B 2,3. Diferente de outros subconjuntos de células TH CD4 + (por exemplo, células TH1, TH2, TH9 e TH17), as células TFH expressam um nível substancial de CXCR5, que é o receptor de quimiocina para a quimiocina CXCL13 de células B, permitindo que as células TFH migrem para os folículos das células B. Nos folículos das células B, as células TFH auxiliam as células B cognatas a iniciar e manter as reações do centro germinativo, permitindo assim a rápida produção de anticorpos de alta afinidade e memória humoral de longo prazo 2,3.
Após a infecção viral aguda, o comprometimento precoce do destino das células TFH específicas do vírus ocorre dentro de 72 h 4,5 e é controlado pelo linfoma de células B repressor transcricional-6 (Bcl-6) 5 , 6 , 7 , 8 , que atua como o "regulador mestre" que governa as decisões de destino das células TFH. A deficiência de Bcl-6 embota severamente a diferenciação das células TFH, enquanto a expressão ectópica de Bcl-6 promove substancialmente o compromisso do destino das células TFH. Além do Bcl-6, várias moléculas estão envolvidas na instrução do comprometimento precoce do destino das células TFH. Os fatores de transcrição TCF-1 e LEF-1 iniciam a diferenciação de células TFH por meio da indução de Bcl-6 9,10,11. A inibição do Blimp1, tanto por Bcl-6 quanto por TCF-1, é necessária para o comprometimento precoce do destino das células TFH 11,12. STAT1 e STAT3 também são necessários para a diferenciação precoce de células TFH 13. Além disso, as modificações epigenéticas pela histona metiltransferase EZH214,15 e m6A metiltransferase METTL316 ajudam a estabilizar os programas transcricionais de células TFH (especialmente Bcl6 e Tcf7) e, assim, preparar o compromisso inicial do destino das células TFH. Embora avanços, incluindo as moléculas acima mencionadas e outras, resumidas em outro lugar3, tenham sido feitos na compreensão dos regulamentos transcricionais e epigenéticos do compromisso inicial do destino das células TFH, moléculas anteriormente desconhecidas ainda precisam ser aprendidas.
No modelo de camundongo de infecção pelo vírus da coriomeningite linfocítica aguda (LCMV), as células T CD4+ SMARTA (SM) congênitas transgênicas TCR transferidas adotivamente, que reconhecem especificamente o epítopo da glicoproteína LCMVI-A bGP66-77, sofrem diferenciação de células TFH ou TH1 durante a infecção viral. Este padrão de diferenciação de bifurcação TFH /T H1 suporta o avanço do modelo de infecção SM / LCMV aguda no estudo da biologia de células TFH específicas do vírus. De fato, o modelo de infecção SM/LCMV agudo tem sido amplamente utilizado no campo de pesquisa de células TFH e desempenhou um papel crucial nas descobertas marcantes na biologia celular TFH. Isso inclui a identificação do Bcl-6 mencionado acima como o fator de transcrição definidor de linhagem de células TFH 5,6, bem como outros fatores transcricionais importantes (por exemplo, Blimp-16, TCF-1 / LEF 9,10,11, STAT1 / STAT313, STAT517, KLF218 e Itch19) orientando a diferenciação de células TFH, regulações pós-transcricionais ( por exemplo, METTL316 e miR-17 ~ 9220) da diferenciação de células TFH, memória e plasticidade de células TFH 21,22 e estratégias racionais de vacinação direcionadas às células TFH (por exemplo, selênio23).
O presente estudo descreve métodos reprodutíveis para acessar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus, incluindo (1) estabelecer um modelo de camundongo quimera SM infectado com LCMV agudo adequado para acessar células TFH diferenciadas precocemente, (2) realizar colorações de citometria de fluxo de moléculas relacionadas a células TFH diferenciadas precocemente e (3) realizar manipulação de genes baseada em vetor retroviral em SM CD4 + Células T. Esses métodos serão úteis para estudos que investigam o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído Fix Solution, 4% PFA</td><td>Beyotime</td><td>P0099-500mL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtro de células m</td><td>Merck</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR V&alpha; 2 (clone B20.1)</td><td>Biolegend</td><td>127812</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)</td><td>Biolegend</td><td>110724</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD25 (clone PC61)</td><td>Biolegend</td><td>101910</td><td>1:200 diluição</td></tr><tr><td>B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) camundongo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22321-10</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-camundongo F4/80 Anticorpo (clone BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Biotina Rato anti-camundongo CD11c (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Biotina Rato anti-Rato CD19 (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Biotina Rato anti-camundongo CD8a (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Biotina Rato anti-camundongo NK-1.1 (clone PK136)</td><td>Biolegend</td><td>108704</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Biotina Rato anti-camundongo TER-119/Células Eritróides (clone TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>1:200 diluição</td></tr> de <tr><td>albumina de soro bovino, BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)</td><td>Biolegend</td><td>644816</td><td>diluição 1:100</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)</td><td>Biolegend</td><td>135220</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>C57BL/6J (B6) camundongo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CXCR5-GFP knock-in repórter</td><td></td><td></td><td>Em casa; a linha de camundongos knock-in CXCR5-GFP foi gerada pela inserção de uma construção IRES-GFP após o quadro de leitura aberto de Cxcr5.</td></tr><tr><td>DMEM 10% médio Meio</td><td></td><td></td><td>DMEM contendo 10% FBS</td></tr><tr><td>Meio DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>FACSFortesa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, FBS</td><td>Sigma</td><td>F8318</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo (versão 10.4.0)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de tampão de coloração Foxp3/Fator de Transcrição</td><td>Invitrogen</td><td>00-5523-00</td><td>O kit contém três reagentes: a. Concentrado de Fixação/Permeabilização (4X); b. Diluente de Fixação/Permeabilização; c. Tampão de Permeabilização.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato IgG de cabra (H + L), laboratórios de vetor biotinilado</td><td></td><td>BA-9400-1,5</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System</td><td>Tampão</td> de isolamento científico <td></td><td></td>ThermoFisher</tr><tr><td></td><td>Tampão FACS contendo 0,5% BSA e 2mM EDTA</td>LCMV GP61-77 peptídeo (GLKGPDIYKGVYQFKSV) Empresa Chinesa de Peptídeos <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Coloração de Células Mortas Próximas ao IR Fixável LIVE/DEAD, para excitação de 633 ou 635 nm</td><td>Life Technologies</td><td>L10199</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>MigR1</td><td>addgene</td><td>#27490</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)</td><td>Biolegend</td><td>104508</td><td>1:200 diluição</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)</td><td>BD Biosciences</td><td>561522</td><td>diluição 1:50</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Solarbio</td><td>H8761</td><td></td></tr><tr><td>Purificado Rato Anti-Rato CXCR5 (clone 2G8)</td><td>BD Biosciences</td><td>551961</td><td>diluição 1:50</td></tr><tr><td>PerCP monoclonal de rato anti-rato CD4 (clone RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100538</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>recombinante murino IL-2</td><td>Gibco</td><td>212-12-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Beyotime</td><td>C3702-500mL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 meio</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 2%</td><td></td><td></td> <td>RPMI 1640 meio contendo 2% de camundongo transgênico FBS</td></tr><tr><td>SMARTA (SM) TCR</td><td></td><td></td><td>A linha transgênica SM TCR em nosso laboratório é um presente do Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Além disso, esta linha de camundongos também pode ser obtida no The Jackson Laboratory (stain#: 030450).</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de coloração <td>PBS contendo 2% de FBS e 0,01% de NaN3</td></tr><tr><td>Estreptavidin PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>Diluição 1:200</td></tr><tr><td>TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)&nbsp;</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>6444S</td><td>1:400 diluição</td></tr><tr><td>TFH tampão</td><td></td><td></td><td>de coloração de células tampão FACS contendo 1% de BSA e 2% de soro</td></tr><tr><td>de camundongo TransIT-293 reagente</td><td>Mirus Bio</td><td>MIRUMIR2700</td><td></td></tr></tbody></table>

acesso à diferenciação precoce de células t cd4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por lcmv agudo

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

As células T auxiliares foliculares (TFH) são percebidas como uma linhagem independente de células T CD4+ que auxilia as células B cognatas na produção de anticorpos de alta afinidade, estabelecendo assim imunidade humoral de longo prazo. Durante a infecção viral aguda, o compromisso de destino das células TFH específicas do vírus é determinado na fase inicial da infecção, e as investigações das células TFH diferenciadas precocemente são cruciais para entender a imunidade humoral dependente de células T e otimizar o design da vacina. No estudo, usando um modelo de camundongo de infecção pelo vírus da coriomeningite linfocítica aguda (LCMV) e o camundongo SMARTA (SM) transgênico TCR com células T CD4 + reconhecendo especificamente o epítopo da glicoproteína LCMVI-A bGP66-77, descrevemos procedimentos para acessar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus com base em colorações de citometria de fluxo. Além disso, ao explorar a transdução retroviral de células T SM CD4 + , métodos para manipular a expressão gênica em células TFH específicas de vírus diferenciados precocemente também são fornecidos. Portanto, esses métodos ajudarão em estudos que exploram o(s) mecanismo(s) subjacente(s) ao comprometimento precoce de células TFH específicas do vírus.

Características das células TFH específicas do vírus de diferenciação precoce durante a infecção aguda por LCMV Para investigar o compromisso de destino inicial de células TFH específicas do vírus, células T SM CD4 + congênitas virgens que reconhecem especificamente o epítopo LCMV GP IA, A,B GP66-77, foram transferidas adotivamente para receptores CD45.2 + C57BL / 6. No dia seguinte, esses receptores foram infectados por via intravenosa com uma alta dose de LCMV Armstrong agudamente resolvido (Figura 1A). No dia 3 após a infecção, os esplenócitos dos receptores C57BL/6 foram analisados por citometria de fluxo, e os resultados indicaram uma grande quantidade de células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas (~10% do total de células T CD4+) (Figura 1B), o que forneceu um número suficiente de células T CD4+ específicas para o vírus para investigação posterior. Análises adicionais de células T CD4+ SM transferidas mostraram co-expressão de CXCR5 e Bcl-6/TCF-1 e expressão recíproca de CXCR5 e CD25/T-bet, definindo assim as linhagens TFH (CXCR5+Bcl-6+ ou CXCR5+TCF-1+) e TH1 (CXCR5-CD25+ ou CXCR5-T-bet+) (Figura 1C). Para avaliar a especificidade e a sensibilidade da coloração de anticorpos CXCR5 apresentada no estudo, cruzamos ainda mais a linha de camundongos CD45.1+ SM acima mencionada com a linha de camundongos CXCR5-GFP knock-in, que foi gerada pela inserção de uma construção IRES-GFP após o quadro de leitura aberto de Cxcr529. Em seguida, as células SM repórter CD45.1+ CXCR5-GFP foram transferidas para receptores C57BL/6. Esses receptores foram infectados com LCMV Armstrong e seus esplenócitos foram analisados no dia 3 após a infecção. De fato, o sinal de fluorescência pelo método de coloração de anticorpos CXCR5 no estudo se sobrepôs finamente ao sinal GFP em células T CXCR5-GFP repórter29 SM CD4 + transferidas no dia 3 após a infecção (Figura 1D), indicando a alta especificidade do método de coloração de anticorpos CXCR5 em três etapas.
Superexpressão de Bcl-6 baseada em retrovírus em células T SM CD4+ A Bcl-6 é uma das moléculas mais importantes na promoção da diferenciação de células TFH 6,7,8. Para verificar a confiabilidade do protocolo atual no acesso a células TFH diferenciadas precocemente, as células T CD45.1+ SM CD4+ foram ativadas in vivo e transduzidas com sobrenadante de retrovírus de células 293T transfectadas por plasmídeo de plasmídeo de superexpressão de MigR1 ou MigR1-Bcl6 (Figura 2 e Figura 3A). As células T SM CD4 + transduzidas por retrovírus foram transferidas adotivamente para receptores C57BL / 6, que foram então infectados com LCMV Armstrong ( Figura 3B ). No dia 3 após a infecção, encontramos uma bifurcação equilibrada de células TFH e TH1 em células T MigR1-SM CD4 +, enquanto uma diferenciação predominante direcionada a células TT FH em células T MigR1-Bcl6-SM CD4 + (Figura 3C). Consistentemente, o nível de expressão de Bcl-6 foi aumentado em células T CD4 + MigR1-Bcl6-SM em comparação com células T MigR1-SM CD4 + (Figura 3D). Portanto, o fenótipo que a diferenciação de células TFH 6 orientada pela expressão ectópicade Bcl-6 foi finamente reproduzido seguindo o protocolo atual.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig01.jpg"> Figura 1: Análises de citometria de fluxo do comprometimento precoce do destino de células SMT FH durante a infecção por LCMV Armstrong. (A) Projeto experimental. As células T CD4+ esplênicas foram colhidas de camundongos CD45.1+ SM e, em seguida, transferidas adotivamente para receptores C57BL/6 (CD45.2+). No dia seguinte, esses receptores foram infectados com LCMV Armstrong. No dia 3 após a infecção, as células SM CD45.1+ transferidas dos baços dos receptores foram analisadas por citometria de fluxo. (B) Dados representativos de citometria de fluxo mostrando a estratégia de gating de células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas dos baços dos receptores no dia 3 após a infecção por LCMV Armstrong. (C) Dados representativos de citometria de fluxo mostrando co-colorações de CXCR5 e outras moléculas associadas a células TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 e T-bet) em células CD45.1+ SM transferidas dos baços de receptores no dia 3 após a infecção por LCMV Armstrong. (D) Dados representativos de citometria de fluxo mostrando co-colorações de anticorpo conjugado com fluorescência contra CXCR5 e sinal GFP em células SM repórter CD45.1+ CXCR5-GFP transferidas dos baços dos receptores no dia 3 após a infecção por LCMV Armstrong. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig02.jpg"> Figura 2: Transdução retroviral em células T SM CD4+ . (A) Diagrama esquemático de produção e transdução retroviral em células T SM CD4+ . Para a produção de retrovírus, as células 293T semeadas em uma placa de 6 poços foram transfectadas com plasmídeos de DNA alvo quando a densidade celular atinge ≥80% de confluência. Em seguida, o sobrenadante de cultura celular contendo retrovírus foi coletado 72 h após a transfecção e imediatamente usado ou armazenado a -80 °C. Para transdução retroviral em células T SM CD4+ , um camundongo CD45.1+ SM foi injetado por via intravenosa com 200 μg de LCMV GP61-77 Em seguida, o baço foi dissecado de camundongo SM 16-18 h após a injeção do peptídeo, e o status de ativação das células T CD4+ esplênicas foi detectado. As células T SM CD4+ ativadas foram transduzidas com sobrenadante de cultura contendo retrovírus e cultivadas in vitro por 48 h antes de acessar a eficiência de transdução. (B) Imagem de microscopia de fluorescência de GFP em células 293T transfectadas por DNA plasmidial. Barra de escala: 400 μm. (C) Análise por citometria de fluxo dos níveis de expressão de CD25 e CD69 em células T CD4+ virgens esplênicas de camundongo virgem (virgen, à esquerda) ou células T SM CD4+ esplênicas de camundongo SM injetado com peptídeo LCMV GP61-77 (ativado, à direita). (D) Análise de citometria de fluxo da expressão de GFP em células T SM CD4+ transduzidas por retrovírus (transduzidas, à esquerda) ou células T SM CD4+ não transduzidas por retrovírus (não transduzidas, à esquerda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig03.jpg"> Figura 3: Efeitos da superexpressão de Bcl-6 no compromisso do destino das células SM TFH. (A) Mapas lineares de backbones retrovirais de MigR1 (painel superior) e vetor MigR1 modificado com região Bcl6 CDS a montante de IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (painel inferior). (B) Desenho experimental. As células T SM CD4+ transduzidas por MigR1 ou MigR1-Bcl6 foram transferidas adotivamente para receptores C57BL/6 (CD45.2+) um dia antes do LCMV Armstrong. No dia 3 após a infecção, as células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas do baço dos receptores foram analisadas por citometria de fluxo. (C) Análise de citometria de fluxo de CXCR5 e CD25 em células T GFP+ SM CD4+ transduzidas por MigR1 ou MigR1-Bcl6. Os números adjacentes à porta indicam as frequências das células TFH nas células T SM CD4+. (D) Análise de citometria de fluxo do nível de expressão de Bcl-6 em células T SM CD4+ transduzidas por MigR1 ou MigR1-Bcl6. MFI, intensidade média de fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

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