Um ensaio in vitro para estudar a migração plaquetária usando amarras Avidina-Biotina Funcionalizadas por RGD

As plaquetas são cruciais na prevenção da perda de sangue após lesão do vaso, no combate a infecções e na manutenção da integridade vascular durante a inflamação. Embora os tampões hemostáticos exijam a ativação coletiva e a agregação de plaquetas, seu papel na proteção dos vasos sanguíneos inflamados é desempenhado no nível de uma única célula. Nesse contexto, estudos recentes descobriram que as plaquetas podem migrar de forma autônoma, um processo dependente da mecanosenização de seu microambiente adesivo.

Essa abordagem permite o controle preciso das propriedades adesivas do substrato e serve como um ensaio in vitro simples para estudar os mecanismos subjacentes à migração plaquetária. Os resultados indicam que a ligação de plaquetas migratórias a ligantes de integrina pode exercer força capaz de interromper a ligação avidina-biotina. Este ensaio fornece um método simples e confiável para visualizar a migração plaquetária.

Combinado com imagens de células vivas, nos ajudará a entender melhor a interação e a regulação de diferentes componentes do citoesqueleto nessa importante função plaquetária. Para começar, sonicar lamínulas de vidro em ácido nítrico a 20% por um minuto, seguido de sonicação em isopropanol, etanol e água por um minuto cada. Trate as lamínulas pré-limpas com plasma de oxigênio em um limpador de plasma por dois minutos e, em seguida, monte-as com lâminas adesivas.

Agora encha o canal com 2,5 microlitros de PLL-PEG-biotina diluída em 97,5 microlitros de PLL-PEG e incube por 30 minutos em temperatura ambiente, depois lave três vezes com PBS. Em seguida, adicione 100 microlitros de neutravidina-FITC e incube por 30 minutos no escuro em temperatura ambiente, depois lave três vezes com PBS. Por fim, adicione 100 microlitros de biotina ciclo-RGD, incube por 30 minutos em temperatura ambiente e lave três vezes com PBS.

Depois de anestesiar o camundongo e remover a pele torácica, insira a agulha entre a segunda e a terceira costelas no lado esquerdo do esterno para retirar o sangue do coração. Misture o sangue com um mililitro de tampão de Tyrode e centrifugue a 70 g por 20 minutos em temperatura ambiente com o freio desligado, depois pegue a parte superior contendo plasma rico em plaquetas. Misture com três mililitros de tampão de Tyrode e adicione 100 nanogramas por mililitro de prostaciclina para evitar a ativação plaquetária.

Em seguida, centrifugue a 1200 g por cinco minutos em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de Tyrode. Em seguida, usando um hemocitômetro, meça a contagem de plaquetas.

Para começar, pegue as plaquetas de camundongo nos canais de revestimento cRGD de biotina-neutravidina-biotina e registre a migração de plaquetas vivas usando um microscópio invertido equipado com uma incubadora de palco. Para contar os números de adesão ou migração plaquetária, clique com o botão direito do mouse no menu suspenso da ferramenta ponto na barra de ferramentas e selecione a ferramenta multiponto. Extrair a distância de migração das amostras fixas medindo o comprimento da trajectória de migração impressa no revestimento de neutravidina-FITC.

Clique com o botão direito do mouse no menu suspenso da ferramenta de linha reta na barra de ferramentas e selecione a ferramenta de linha de mão gratuita. Para quantificar a forma das plaquetas, selecione Imagem, Ajustar e Limite na barra de ferramentas para gerar máscaras binárias segmentando plaquetas fluorescentes. Selecione descritores de forma em Analisar e Definir Medidas e, em seguida, selecione Exibir resultados usando Analisar e Analisar partículas.

As plaquetas exibiram migração ótima na concentração de 2,5% PLL-PEG-biotina. A migração foi reduzida em densidades de ligantes mais baixas e mais altas. As plaquetas se espalham inadequadamente na densidade de 1% do ligante, indicada por baixa área e perímetro, sugerindo ativação insuficiente da integrina.

Com densidade de 2,5% de ligante, as plaquetas se espalham de forma eficaz, interrompendo os ligantes cRGD e migrando. A alta densidade de ligantes fez com que as plaquetas se espalhassem sem polarização, reduzindo a migração devido à falha em quebrar os ligantes cRGD.