Quantificação da morte celular induzida por citocinas em organoides colônicos humanos usando microscopia de fluorescência ao vivo
August 2nd, 2024
Este protocolo descreve um método simples e econômico para investigar e quantificar a morte celular em organoides colônicos humanos em resposta a perturbações citotóxicas, como citocinas. A abordagem emprega um corante de morte celular fluorescente (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopia de fluorescência ao vivo e software de análise de imagem de código aberto para quantificar as respostas de um único organoide a estímulos citotóxicos.
As citocinas inflamatórias interferon-gama e TNF-existem há centenas de milhões de anos e são essenciais para a defesa eficaz do hospedeiro contra patógenos intercelulares. Nosso grupo de pesquisa está tentando entender como essas citocinas funcionam para matar células, como células epiteliais no intestino e células cancerígenas. Os sistemas comumente usados para estudar os mecanismos de morte de células epiteliais intestinais incluem modelos de camundongos e linhagens de células cancerígenas imortalizadas.
Os organoides de teste em humanos são vantajosos, pois são gerados diretamente a partir de biópsias de pacientes e retêm muitas características fisiológicas e morfológicas do tecido original. Isso significa que eles aumentaram o valor translacional. A pesquisa de órgãos tem problemas com a reprodutibilidade de experimentos e tem vários desafios técnicos em comparação com a cultura de células tradicional.
As técnicas atuais para medir a morte celular de organoides também apresentam limitações. Alguns são apenas semiquantitativos, não medem a morte celular diretamente, não podem medir respostas organoides únicas ou requerem equipamentos caros e protocolos complexos. Nosso protocolo para análise quantitativa da morte de células organoides é direto, robusto e barato.
Usamos nosso protocolo para medir as respostas de um único organoide a combinações de citocinas citotóxicas, mas ele pode ser facilmente adaptado para estudar qualquer tipo de perturbação. Este método é útil para pesquisas sobre morte celular, função de barreira epitelial ou imunologia da mucosa. Recentemente, relatamos que o interferon-gama e o TNF-sinergizam para induzir a morte celular inflamatória em células epiteliais intestinais e células de câncer de cólon.
Eles fazem isso através da via de sinalização JAK1/2-STAT1. Em trabalhos futuros, desejamos entender que tipo de morte celular é essa e como JAK1 e JAK2 matam as células.
Visão Geral
Este estudo investiga os mecanismos de morte celular em organoides colônicos humanos em resposta a citocinas inflamatórias como interferon gama e TNF alfa. Ao utilizar um novo protocolo envolvendo corantes fluorescentes e microscopia de células vivas, a pesquisa fornece um método robusto para quantificar a morte celular em nível de organoides individuais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Mecanismos de morte celular em células epiteliais
- Respostas inflamatórias no tecido intestinal
- Pesquisa translacional usando organoides derivados de humanos
Fundamentos
- A importância das citocinas inflamatórias na defesa do hospedeiro
- Limitações dos sistemas experimentais tradicionais para estudar a morte celular
- Vantagens do uso de organoides derivados de pacientes para reprodutibilidade experimental
Métodos Utilizados
- Análise quantitativa de respostas citotóxicas em organoides
- Organoides colônicos humanos derivados de pacientes
- Ensaios de morte celular fluorescentes e técnicas de análise de imagem
Principais Resultados
- Demonstrou o efeito sinérgico das citocinas na indução da morte celular
- Quantificou respostas de organoides individuais ao tratamento
- Identificou as vias de sinalização envolvidas na morte celular induzida por citocinas
Conclusões
- O protocolo melhora a compreensão da morte celular epitelial em condições inflamatórias
- Este método pode informar futuros estudos sobre imunologia mucosa e intervenções terapêuticas
