Diagnóstico post-mortem de raiva em animais pelo ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real LN34 atualizado e multiplexado

A raiva é cem por cento fatal e um diagnóstico rápido e preciso é necessário para garantir tratamento que salva vidas para quem mais precisa. Testes laboratoriais confiáveis são realmente cruciais para o controle da raiva. O CDC desenvolveu um protocolo passo a passo para testes de raiva por meio de transcritase reversa quantitativa PCR ou RT-PCR, utilizando um teste validado em tempo real do vírus Alisa chamado LN34, permitindo que laboratórios melhorem a precisão diagnóstica e apoiem esforços de prevenção da raiva.

Durante décadas, o teste de raiva baseou-se nos testes diretos de anticorpos de fluorescência chamados DFA ou FAT. No entanto, muitos laboratórios internacionais também utilizam RT-PCR para testes de raiva devido à sua excelente sensibilidade e precisão. O teste DFA para raiva exige microscópios especializados, armazenamento em cadeia de frio, treinamento especializado de equipe e reagentes têm apresentado escassez nos últimos anos, PCR e RT-PCR são agora amplamente utilizados para testes de patógenos.

Muitos laboratórios já possuem equipamentos e expertise em PCR e RT-PCR, e os reagentes necessários estão disponíveis em fornecedores comerciais. O custo é uma grande barreira para testes de raiva nas áreas com mais casos humanos de raiva. O CDC desenvolveu uma forma multiplex do ensaio LN34, que melhora os controles de qualidade e reduz o custo por amostra testada.

RT-PCR está sendo cada vez mais implementado para diagnósticos de raiva porque é amplamente utilizado para testar outros patógenos e os resultados são fáceis de interpretar. Mas usar um teste validado é extremamente importante, e garantir que o teste esteja funcionando como esperado é igualmente crítico. Nosso protocolo passo a passo inclui controles de qualidade, considerações de segurança e melhores práticas de PCR para ajudar os laboratórios a começarem.

Para começar, use equipamentos de proteção individual, incluindo óculos de segurança, um avental fechado na frente e dois pares de luvas. Limpe e desinfete a superfície de trabalho com composto de amônio quaternário ou outro desinfetante adequado para inativar o vírus da raiva. Coloque uma almofada absorvente revestida de plástico sobre a superfície de trabalho, usando um tecido coletor de bisturi limpo e descartável representando uma seção transversal completa do tronco encefálico e do cerebelo.

Para homogeneização e extração de RNA, finalmente, triture os tecidos necessários usando um bisturi de uso único. Espalhe o tecido moído com um swab e transfira o swab para um tubo pré-preenchido com buffer de homogeneização e esferas. Após descartar a luva externa usando desinfetante QAC diluído 1:256, limpe e desinfete a estação de trabalho, o equipamento e o exterior dos tubos da amostra.

Homogeneize as amostras com um mini batedor de contas por 60 segundos. E inspecionar visualmente os tubos. Deixe as amostras descansarem por cinco minutos em temperatura ambiente.

Por fim, limpe e desinfete a estação de trabalho, o equipamento e o exterior dos tubos de amostra com desinfetante QAC antes de prosseguir para a extração de RNA. Para começar, realize a descontaminação superficial do gabinete de segurança biológica usando QAC diluído a 1:256. Realize uma limpeza adicional para remover poeira ou outros contaminantes ambientais.

Coloque uma base de trabalho absorvente forrada de plástico sobre a plataforma de trabalho. Depois, organize os reagentes e as amostras no armário de biossegurança. Coloque todos os tubos de coleta em um suporte limpo para tubos de microcentrífuga.

Preencha um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 300 microlitros de etanol 100% para cada amostra de cérebro. Centrifuge as amostras homogeneizadas de cérebro em folhas a 10.000 a 16.000 G por dois minutos em uma microcentrífuga de mesa. Transfira o supernadante rosa transparente para um novo tubo estéril contendo 100% etanol, pipete para cima e para baixo para misturar e transferir 600 microlitros da mistura de sobrenadante de etanol para uma coluna de rotação em um tubo de coleta.

Centrifuge por um minuto até que o líquido passe pela coluna, descarte o fluxo e transfira cada coluna para um novo tubo de coleta. Adicione 400 microlitros de tampão pré-lavagem de RNA a cada coluna. Centrifuge a mistura a 10.000 a 16.000 G por 30 segundos e descarte o fluxo.

Retorne cada coluna ao mesmo tubo de coleta e repita a etapa de pré-lavagem uma segunda vez. Em seguida, adicione 700 microlitros de tampão de lavagem de RNA a cada coluna. Centrifugar a 10.000 a 16.000 G por dois minutos.

E transfera cuidadosamente para um tubo livre de RNase. Descarte o fluxo e o tubo coletor, depois remova e descarte as luvas externas. Agora adicione 50 microlitros de DNase e água livre de RNase diretamente à matriz da coluna e incube por 30 segundos.

Depois, centrifuge a 10.000 a 16.000 G por um minuto. Transfira cuidadosamente o RNA para um novo tubo microcentrífuga com topo de rosca e fundo plano rotulado para ensaio RT-PCR. Para começar, descongele um tampão RT-PCR de um passo, sem controle de molde, água livre de nuclease, espolvas e sondas em gelo, no espaço de preparação da mistura master.

Coloque uma enzima RT-PCR de um passo sobre gelo. Calcule o volume de cada reagente para as misturas multiplexadas LN34 e beta A Master Mixes. Designe poços para cada amostra em triplicado para o ensaio multiplexado LN34 usando um mapa de placas de 96 poços.

Após o vórtice e a rotação, dispense 23 microlitros de mistura multiplex LN34 Master em cada poço LN34 atribuído. Para configurar reações de controle de molde negativo, adicione dois microlitros de água de grau PCR em cada poço de controle de molde negativo. Coloque a placa de 96 poços no gelo.

Limpe a estação de trabalho com 70% de etanol. Agora, no espaço de trabalho da edição modelo, amostras de RNA descongeladas e alíquota de RNA artificial artificial no gelo em controle positivo e de uso único. Após o vórtice, centrifuge brevemente tubos contendo amostras de RNA, pipete dois microlitros de amostra ou RNA controle positivo para o poço correspondente.

Após adicionar todas as amostras, coloque a tampa adesiva óptica sobre os poços para selá-los completamente. Centrifuge a placa a 500 G por um minuto em temperatura ambiente, coloque a placa selada em um instrumento de PCR em tempo real ou quantitativo calibrado para matrizes fam e VIC Hex reporter. Ajuste o instrumento para os parâmetros de ciclo apropriados.

Após a execução, defina os valores limiar para 0,2 para LN34 e 0,05 para beta actina. Verifique as curvas de amostra de controle para ver se há problemas de qualidade. O ensaio LN34 mostrou curvas de amplificação bem-sucedidas com resultados positivos ultrapassando o limiar em valores distintos do limiar do ciclo quando observado em escala logarítmica.

E curvas de amplificação sigmoide em escala linear tanto para LN34 quanto para beta actina. Resultados negativos apresentaram linhas planas sem amplificação. Curvas de amplificação anormais foram identificadas, algumas apresentando aumentos lineares em vez de sigmoidais na fluorescência, indicando resultados atípicos.

Os gráficos multicomponentes correspondentes mostraram sinais fluorescentes ondulados irregulares em vez de curvas suaves esperadas. Destacando a necessidade de analisar gráficos de amplificação em vez de depender apenas dos valores de limiar do ciclo.