Name: Chanfro úmido de agulhas de microinjeção utilizando pressão de ar constante para feedback sobre a abertura da agulha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprenda a técnica de chanfro úmido com pressão de ar constante para preparar agulhas de microinjeção afiadas em insetos geneticamente modificados. Este método garante controle preciso do tamanho da abertura da agulha.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo para chanfro úmido de agulhas de microinjeção sob pressão de ar constante

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+Element+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+systems+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation systems in insects.</a> Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+Transgenesis%3A+Methods+and+Applications%22">Insect Transgenesis: Methods and Applications</a>. , CRC Press. Boca Rato. (2000).</li>
<li>Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).</li>
<li>Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable%2C+germ-line+transformation+of+Culex+Quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).</li>
<li>Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+transgenesis+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transformation+of+the+South+American+malaria+vector%2C+Anopheles+albimanus%2C+with+a+piggyBac%2FEGFP+transposon+vector+is+routine+and+highly+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.</a> Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+The+immune+deficiency+pathway+impacts+vector+competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major.</a> mBio. 10 (4), e01941(2019).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html">https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html</a> (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microcapilares de 1,0 mm de diâmetro externo</td> Óleo de pedestal de chanfro <td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>008</td><td></td></tr><tr><td>Clipe de para-lama de bicicleta</td><td>VeloOrange</td><td>R-clip 4-pack</td><td>https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack</td></tr><tr><td>Boom Stand Microscópio</td><td>AmScope</td><td></td><td>AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Microscópio Estéreo ou Chanfrador equivalente</td></tr><tr><td>BV-10</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Placa abrasiva de diamante&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>104F</td><td>Placa abrasiva de diamante - extra fina (0.2 &micro; a 1.0 &micro; tamanhos de ponta)</td></tr><tr><td>Junta, Buna-N</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>11761-2-pkg</td><td>Usado para selar a conexão em conectores T&nbsp; ou L, se ainda não estiver incluído com estas peças</td></tr><tr><td>Braçadeira</td> de <td>Mangueira Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>Conector de mangueira de 5000-2 pacotes</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>CT4-pkg</td><td>Precisa de 5 conectores de mangueira Suporte</td></tr> de agulha <tr><td>de microinjeção</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH3-10 Porta-agulha</td><td>para microcapilares de diâmetro externo de 1 mm</td></tr><tr><td>P-2000</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Qualquer extrator</td></tr><tr><td>de agulha Photo-Flo 200 Solução</td><td>B& H Foto, Vídeo e Áudio</td><td>BH #KOPF200P&nbsp; Agente</td><td>umectante</td>MFR #1464510</tr><tr><td>Manômetro</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>PG-100</td><td>0-100 psi medidor</td></tr> de <tr><td>pavio de referência</td><td>Sutter Instruments</td><td>X050300</td><td></td></tr><tr><td>suporte de pavio de referência</td><td>Sutter Instruments</td><td>M100019</td><td></td></tr><tr><td>Regulador</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>01-Mar</td><td>Precisa de portas #10-32 para conexões</td></tr><tr><td>Folha de Embalagem de Borracha 6 inx 6 in</td><td>Danco</td><td>Modelo # 59849</td><td></td></tr><tr><td>T fitting</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>15002-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>Barra</td><td></td><td></td> roscada <td>Uma haste roscada ou barra com extremidade roscada. Os fios devem ser 10-32.</td></tr><tr><td>Tubo de uretano</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>URH1-0804-BLT-050</td><td></td></tr></tbody></table>

chanfro úmido de agulhas de microinjeção utilizando pressão de ar constante para feedback sobre a abertura da agulha

Wet Beveling of Microinjection Needles Utilizing Constant Air Pressure for Feedback on Needle Opening

O procedimento descrito acima produz agulhas de microinjeção consistentemente afiadas. Agulhas afiadas são caracterizadas por serem capazes de se inserir em embriões de insetos coriões moles, como embriões de mosquitos, com pouca ou nenhuma resistência da membrana embrionária. Quando os embriões de mosquito são microinjetados para modificação genética, a membrana do embrião é relativamente elástica. Empurrar uma agulha cega contra a membrana do embrião fará com que ela recue (Figura 4B). Quando a agulha é puxada para trás, a membrana recupera sua forma. Com pressão suficiente, a agulha cega acabará rasgando a membrana e o embrioplasma provavelmente vazará. Quanto mais afiada a agulha, menos recuo ocorre quando a agulha é pressionada contra a membrana do embrião (Figura 4E). Em vez de rasgar a membrana, uma agulha afiada deslizará através da membrana, causando pouco ou nenhum dano ao embrião. Com uma agulha ideal, quase não haverá recuo da membrana do embrião à medida que a agulha desliza para dentro do embrião.
A Instalação de Transformação de Insetos da Universidade de Maryland (UM-ITF) é uma instalação de serviços que cria insetos geneticamente modificados para clientes na academia e na indústria. A instalação usa agulhas chanfradas para a microinjeção de embriões de mosquitos. Durante o período entre janeiro de 2023 e dezembro de 2023, a UM-ITF injetou 12.795 embriões de Aedes em 56 projetos de clientes (Tabela 1). O uso de agulhas chanfradas ajudou a UM-ITF a manter uma eclosão média pós-injeção de 31% em todos os projetos (Tabela 2). Além disso, o UM-ITF conseguiu manter uma taxa de sucesso de injeção de 96%, conforme determinado pelo acompanhamento pós-projeto com os clientes (Tabela 2). O sucesso da injeção é uma medida de se os materiais de injeção (guias CRISPR, proteína Cas9, plasmídeos de vetor de transposon, etc.) injetados foram entregues aos embriões do projeto de uma maneira em que esses materiais foram capazes de criar uma modificação genética, basicamente, havia evidência de criação de CRISPR Indel, inserção do vetor baseado em transposon do cliente ou inserção de um vetor de controle de qualidade de injeção (o transposon termina com um promotor mais marcador). Em outras palavras, as injeções eram boas o suficiente para produzir modificação genética, se os componentes injetados estivessem funcionando corretamente. Existem muitos fatores que contribuem para o sucesso de um projeto de modificação genética, e microinjeções de qualidade com agulhas afiadas são um fator chave de sucesso. A biselagem de agulhas utilizando o procedimento descrito no protocolo acima permite que a UM-ITF produza agulhas de microinjecção afiadas de qualidade de forma consistente, permitindo assim que a UM-ITF dê injecções consistentemente bem sucedidas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático dos componentes do sistema de ar e conexão ao microcapilar. O ar é fornecido à agulha capilar através de um sistema de tubos de uretano a partir de um suprimento de ar (ar doméstico ou cilindro de ar). Os tubos de uretano são conectados ao regulador (R) e ao manômetro por conexões de mangueira (HC), que consistem em um conector de mangueira e uma braçadeira de mangueira. A conexão da mangueira é aparafusada em uma conexão fêmea de 10-32 roscas na base do regulador (R) e do manômetro. Um conector T (T) é conectado ao regulador (R) para derramar ar entre o manômetro e o porta-agulha (NH). A tubulação de uretano é conectada ao porta-agulha por um conector luer (LC) que é fornecido com o porta-agulha (NH). A conexão com o suprimento de ar varia de acordo com o suprimento de ar usado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig02.jpg"> Figura 2: Peças do manipulador e configuração de ar. Peças do manipulador: a. botão de ajuste grosso, b. botão de ajuste fino, c. Pinça, d. porta-agulha WPI, e. medidor de ângulo, f. braçadeira de retenção e clipe de pára-choque de bicicleta, g. adaptador luer e conector de mangueira luer e h. tubulação de uretano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig03.jpg"> Figura 3: Colocação da agulha em relação à rotação da placa abrasiva. (A) Colocação adequada da agulha durante o chanfro. A agulha a ser chanfrada deve ser colocada na placa abrasiva rotativa orientada em algum lugar entre perpendicular à rotação e alinhada com a rotação, onde a rotação se afasta da ponta da agulha. (B) Colocação inadequada da agulha. A rotação da placa abrasiva nesta orientação faz com que a superfície da placa abrasiva empurre a ponta da agulha em vez de passar por baixo e além da ponta. Nesta orientação, o chanfro pode não ocorrer suavemente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig04.jpg"> Figura 4: Comparação da inserção da agulha por agulhas não perfurocortantes e perfurocortantes. (A-C) Agulha não perfurocortante e (D-F) Agulha perfurocortante. (A) e (D) foram capturados antes que a agulha entrasse em contato com o embrião; (B) e (E) estão no ponto imediatamente anterior à agulha perfurar a membrana embrionária, e (C) e (F) estão logo após a perfuração da agulha. A seta branca em (B) indica o recuo da membrana do embrião porque uma pressão maior deve ser aplicada para que uma agulha não afiada perfure. A seta preta em (E) indica a falta de recuo devido ao piercing da agulha feito facilmente por causa de uma agulha afiada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Projetos de Aedes da UM-ITF de janeiro de 2023 a dezembro de 2023. Lista dos projetos de microinjeção de Aedes da UM-ITF com o número de embriões injetados para cada projeto, o número de larvas que eclodiram desses embriões injetados e a porcentagem de larvas que eclodiram por embrião injetado total. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Quadro 2: Resultados do projecto Aedes da UM-ITF. A UM-ITF é uma instalação de serviços que fornece serviços de microinjeção para modificação genética de insetos. A tabela lista o número de projetos de Aedes injetados pela ITF de janeiro de 2023 a dezembro de 2023. O número de clientes que responderam a solicitações de acompanhamento do projeto nas quais a resposta indicava sucesso ou falha do projeto de injeção. O número de projetos bem-sucedidos, em que um projeto bem-sucedido foi aquele em que os materiais de injeção foram microinjetados em um momento e local no embrião em desenvolvimento, de modo que as injeções foram capazes de produzir uma modificação genética, e o número de projetos que foram considerados não bem-sucedidos devido à falta de modificação genética. A taxa média de eclosão para projetos de microinjeção de Aedes durante o período de janeiro de 2023 a dezembro de 2023. A taxa de sucesso do projeto e a taxa de resposta do cliente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/table%202_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Chanfro úmido de agulhas de microinjeção utilizando pressão de ar constante para feedback sobre a abertura da agulha

Microinjection needles are a critical tool in the delivery of genome modification reagents, CRISPR components (guide RNAs, Cas9 protein, and donor ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Poland, R. et al. Microinjeção de cérebro de roedores para estudar substratos moleculares do comportamento motivado. J. Vis. Exp. (2015)Neste vídeo, uma configuração de microinjeção cheia de água que consiste em uma seringa e um tubo de microinjetor é usada para a administração precisa do medicamento. Um rato com uma cânula guia pré-implantada é submetido a microinjeção cerebral direcionada, permitindo a administração precisa de agentes terapêuticos em animais acordados com danos mínimos...

Entrega baseada em microinjeção de um agente terapêutico em um cérebro de roedor acordado

Fonte: Vanegas, M. I., et al. Sistema de microinjeção para infusão combinada de drogas e eletrofisiologia. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um dispositivo microfluídico baseado em microeletrodo que fornece solução de medicamento através de um tubo capilar, usando uma solução de marcador à base de óleo para rastreamento preciso de volume e permitindo registro neural simultâneo e infusão de medicamento.

Sistema de microinjeção baseado em microfluídica para infusão combinada de drogas e eletrofisiologia

Fonte: Paolone, G., et al. Agulhas personalizadas para microinjeções no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra uma injeção de microagulha de cérebro de roedor usando uma microagulha de quartzo com orifícios. A microagulha é conectada a uma seringa e microbomba para controlar a taxa de entrega. A agulha com a solução injetável é inserida no cérebro com a velocidade de entrega definida como baixa. Uma vez posicionado, a velocidade de entrega é aumentada. A agulha é retirada...

Microinjeção de cérebro de roedor usando uma microagulha de quartzo

Roedores são um modelo apropriado para investigar os substratos moleculares do comportamento e transtornos psiquiátricos complexos. A microinjeção cerebral em roedores acordados pode ser usada para elucidar substratos de doenças. Um método de microinjeção cerebral eficiente e personalizável, bem como a execução de um paradigma operante que quantifica a motivação, é apresentado.

Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

Descrevemos aqui um protocolo para o microinjection do cérebro de roedores que usa agulhas de quartzo. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e assegurar a entrega confiável, mesmo em regiões profundas. Além disso, eles podem ser adaptados às necessidades de pesquisa pelos projetos personalizados e podem ser reutilizados.

Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

O peixe-zebra é um sistema de modelo que tem muitos recursos valiosos, incluindo claridade ótica, rápido desenvolvimento externo e, de particular importância para o campo de audição e equilíbrio, localizado externamente células sensoriais do cabelo. Este artigo descreve como transgênico zebrafish pode ser usado para ensaiar tanto cabelo-célula mechanosensation e função pré-sináptica em toto.

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Apresentamos um sistema de microinvacinação projetado para eletrofisiologia e entrega assistida de sondas experimentais (ou seja, nanossensores, microeletrodos), com infusão opcional de medicamentos. Componentes microfluídicos amplamente disponíveis são acoplados a uma cânula contendo a sonda. Um protocolo passo a passo para a construção de microinjectrodes está incluído, com resultados durante a infusão de muscimol no córtex de macaco.

Sistema de microininjeção para infusão combinada de drogas e eletrofisiologia

O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática...

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Aprenda a técnica de chanfro úmido com pressão de ar constante para preparar agulhas de microinjeção afiadas em insetos geneticamente modificados. Este método garante controle preciso do tamanho da abertura da agulha.

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