Name: Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprenda a isolar mitocôndrias para análise de supercomplexos respiratórios a partir de pequenas amostras de tecidos e culturas celulares. Este método permite estudar a biogênese mitocondrial e a organização do sistema OXPHOS.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa número "PGC2018-095795-B-I00" do Ministério de Ciência e Inovação (https://ciencia.sede.gob.es/) e pelas bolsas "Grupo de Referência: E35_17R" e bolsa número "LMP220_21" da Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) para PF-S e RM-L.

Fracionamento mitocondrial em pequenas amostras de tecido para análise de supercomplexos

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

As adaptações metodológicas introduzidas nos protocolos aqui descritos visam evitar perdas e aumentar o rendimento, mantendo as atividades do complexo mitocondrial (o que é crucial quando a disponibilidade de quantidades suficientes de amostras está comprometida) e reproduzir o padrão esperado de SCs do tecido ou da linhagem celular (ver Figura 2C). Com esse objetivo e como não é necessária uma alta pureza mitocondrial para detectar adequadamente os SCs, o número de etapas, tempos e volumes foi reduzido sempre que possível.
Assim, após a homogeneização e remoção de núcleos e células intactas por centrifugação de baixa velocidade, os sobrenadantes contendo as mitocôndrias são transferidos para tubos de polipropileno de 1,5 mL, e as centrifugações subsequentes para obtenção das frações mitocondriais brutas são realizadas em uma microcentrífuga, aumentando a velocidade e reduzindo os tempos e volumes em relação aos protocolos convencionais. Isso permite o processamento de várias amostras em um tempo relativamente curto: uma estimativa aproximada é que 10 amostras podem ser processadas em ~ 2-2,5 h (desde o início da homogeneização (etapa do protocolo 1.6. ou equivalente para tecidos) até a obtenção da fração SCs pronta para ser carregada em um gel (etapa do protocolo 3.7) e minimiza as perdas enquanto mantém as atividades. Outra mudança em relação aos protocolos originais do grupo de Schägger é substituir, após a solubilização por membrana para a obtenção da fração SCs, uma etapa de ultracentrifugação por uma centrifugação simples por microcentrífuga (etapa 3.4 do protocolo).
Existem algumas etapas críticas no procedimento. Primeiro, a eficiência da quebra celular, especialmente no caso de células cultivadas (ver nota após a etapa 1.8 do protocolo) e particularmente no caso de células pequenas. Tecidos e linhagens celulares apresentam um grau de dificuldade variável na quebra celular: por exemplo, no coração e no músculo, essa etapa costuma ser menos eficiente do que no fígado ou no baço, mas é compensada em rendimento porque os primeiros têm maior conteúdo mitocondrial. Uma alternativa para melhorar o rendimento mitocondrial quando isolado do músculo ou do coração seria o tratamento de amostras com tripsina antes da homogeneização. O cérebro é outro tecido que apresenta baixa eficiência na quebra celular devido à homogeneização manual, que é mais branda e menos eficiente e provavelmente também devido à maior variação dos tipos celulares nesse tecido, como já foi relatado anteriormente 42. Isso pode ser parcialmente compensado por uma segunda etapa de homogeneização, conforme sugerido em nosso protocolo (etapa 2.7.4). Por outro lado, se a quebra celular for excessiva, a amostra final contendo SCs pode estar contaminada com fragmentos de DNA nuclear que podem interferir no funcionamento eletroforético. Este problema é mostrado como um aumento na viscosidade da amostra quando a digitonina é adicionada para solubilizar as membranas mitocondriais e pode ser resolvido pelo tratamento com DNAse I.
Em segundo lugar, se a proporção detergente-proteína for muito baixa, isso resultaria em solubilização de membrana menos eficiente e na possibilidade de formação de agregados. Isso pode se mostrar nos géis como baixa resolução em SCs de alto peso molecular (ver Figura 4) ou como CIV dando várias bandas correspondentes a oligômeros43. Se a proporção for muito alta, isso pode levar à desagregação de SCs (principalmente IC-SCs). Em terceiro lugar, é importante evitar o aquecimento das amostras durante todo o procedimento (ver Figura 4) e evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento, pois eles podem afetar o status de montagem do SC.
Na Tabela 2, um resumo dos rendimentos esperados é apresentado para vários tipos de células e amostras de tecido. Os valores são aproximados e dependerão da eficiência de quebra da célula e da natureza da fonte. No caso dos tecidos, se o material de partida for congelado, ele tende a dar um rendimento maior do que com amostras frescas. É apresentada uma estimativa do número de pistas (considerando uma carga entre 50 e 60 μg de proteína mitocondrial por pista) que podem ser carregadas.
Os protocolos aqui apresentados abrangem uma variedade de tecidos e tipos de células com pequenas variações, podem ser usados com amostras frescas ou congeladas e requerem equipamentos simples e um custo relativamente baixo, não envolvendo o uso de kits de purificação ou gradientes caros. No entanto, eles podem precisar de algumas adaptações para serem usados com determinados tipos de células ou amostras, bem como quando populações mitocondriais específicas, como mitocôndrias sinápticas cerebrais ou mitocôndrias subsarcolemais musculares, por exemplo, são objeto de análise.
Uma vez que os papéis fisiológicos precisos, bem como o envolvimento potencial dos SCs em situações patológicas, ainda precisam ser definidos, é necessária a análise de sua dinâmica e dos fatores que afetam sua montagem, estabilidade e função. Nossos protocolos podem representar ferramentas valiosas que permitem obter resultados reprodutíveis nos padrões de SCs com amostras pequenas e de uma variedade de tipos de células e tecidos, particularmente quando várias condições experimentais precisam ser comparadas29.

Supercomplexos (SCs) são associações supramoleculares entre complexos individuais da cadeia respiratória 1,2. Desde a identificação inicial das CTs e a descrição de sua composição pelo grupo de Schägger 2,3, posteriormente confirmada por outros grupos, estabeleceu-se que elas contêm complexos respiratórios I, III e IV (IC, CIII e CIV, respectivamente) em diferentes estequiometrias. Duas populações principais de SCs podem ser definidas, aquelas contendo CI (e CIII sozinho ou CIII e CIV) e com peso molecular muito alto (MW, começando ~ 1,5 MDa para o SC menor: CI + CIII2) e aquelas contendo CIII e CIV, mas não CI, com tamanho muito menor (como CIII2 + CIV com ~ 680 kDa). Esses SCs coexistem na membrana mitocondrial interna com complexos livres, também em diferentes proporções. Assim, enquanto o CI é encontrado principalmente em suas formas associadas (ou seja, em SCs: ~ 80% no coração bovino e mais de 90% em muitos tipos de células humanas)3, o CIV é muito abundante em sua forma livre (mais de 80% no coração bovino), com o CIII mostrando uma distribuição mais equilibrada (~ 40% em sua forma livre mais abundante, como um dímero, em coração bovino).
Embora sua existência seja agora geralmente aceita, seu papel preciso ainda está em debate 4,5,6,7,8,9,10. De acordo com o modelo de plasticidade, podem existir diferentes proporções de CTs e complexos individuais, dependendo do tipo de célula ou do estado metabólico 1,7,11. Essa natureza dinâmica da montagem permitiria que as células regulassem o uso dos combustíveis disponíveis e a eficiência do sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS) em resposta às mudanças ambientais 4,5,7. As CCs também podem contribuir para controlar a taxa de geração de espécies reativas de oxigênio e participar da estabilização e renovação de complexos individuais 4,12,13,14. Modificações do estado de montagem do CS têm sido descritas em associação com diferentes situações fisiológicas e patológicas15,16 e com o processo de envelhecimento17.
Assim, mudanças nos padrões de SC têm sido descritas em leveduras dependendo da fonte de carbono utilizada para o crescimento2 e em células de mamíferos cultivadas quando a glicose é substituída por galactose4. Modificações também foram relatadas no fígado de camundongos após jejum8 e em astrócitos quando a oxidação de ácidos graxos mitocondriais é bloqueada18. Além disso, uma diminuição ou alterações nas CSs e OXPHOS foram encontradas na síndrome de Barth19, insuficiência cardíaca20, vários distúrbios metabólicos21 e neurológicos 22,23,24 e diferentes tumores 25,26,27,28. Se essas alterações na montagem e nos níveis de CS são uma causa primária ou representam efeitos secundários nessas situações patológicas ainda está sob investigação15,16. Diferentes metodologias podem fornecer informações sobre a montagem e função dos SCs; Estes incluem medições de atividade 8,29, análise ultraestrutural30,31 e proteômica32,33. Uma alternativa útil que está sendo cada vez mais empregada e é o ponto de partida para algumas das metodologias mencionadas anteriormente é a determinação direta do status de montagem do SC por eletroforese nativa azul (BN) desenvolvida para esse fim pelo grupo de Schägger34,35.
Essa abordagem requer procedimentos reprodutíveis e eficientes para obter e solubilizar membranas mitocondriais e pode ser complementada por outras técnicas, como análise de atividade em gel (IGA), eletroforese de segunda dimensão e western blot (WB). Uma limitação nos estudos sobre a dinâmica do SC por eletroforese de BN pode ser a quantidade de células iniciais ou amostras de tecido. Apresentamos uma série de protocolos para a análise da montagem e função do SC, adaptados dos métodos de grupo de Schägger, que podem ser aplicados a amostras de células ou tecidos frescos ou congelados a partir de apenas 20 mg de tecido.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Ácido aminocapróico</td><td>Fluka Analytical</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Organics</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamino&nbsp; benzidina (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos graxos livres BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Teflon pilão</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 Anticorpo Monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Géis de Mini Proteína NativePAGE 3 a 12%</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Aditivo Tampão Catódico (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Running Buffer (20x)&nbsp;</td>Anticorpo monoclonal <td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Sal de tetrazólio nitroazul (NBT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb (NO3) 2</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>PDVF Membrana</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>Fenazina metassulfato (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA Anticorpo Monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina/penicilina</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 Anticorpo Monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Nas últimas décadas, as evidências acumuladas sobre a existência de supercomplexos respiratórios (SCs) mudaram nossa compreensão da organização da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, dando origem à proposta do "modelo de plasticidade". Este modelo postula a coexistência de diferentes proporções de CTs e complexos dependendo do tecido ou do estado metabólico celular. A natureza dinâmica da montagem em SCs permitiria que as células otimizassem o uso dos combustíveis disponíveis e a eficiência da transferência de elétrons, minimizando a geração de espécies reativas de oxigênio e favorecendo a capacidade das células de se adaptarem às mudanças ambientais. 
Mais recentemente, anormalidades na montagem de SC foram relatadas em diferentes doenças, como distúrbios neurodegenerativos (doença de Alzheimer e Parkinson), Síndrome de Barth, síndrome de Leigh ou câncer. O papel das alterações da montagem do CS na progressão da doença ainda precisa ser confirmado. No entanto, a disponibilidade de quantidades suficientes de amostras para determinar o status da montagem do SC é muitas vezes um desafio. Isso acontece com biópsias ou amostras de tecido que são pequenas ou precisam ser divididas para múltiplas análises, com culturas de células que têm crescimento lento ou vêm de dispositivos microfluídicos, com algumas culturas primárias ou células raras, ou quando o efeito de determinados tratamentos caros tem que ser analisado (com nanopartículas, compostos muito caros, etc.). Nesses casos, é necessário um método eficiente e fácil de aplicar. Este trabalho apresenta um método adaptado para obter frações mitocondriais enriquecidas a partir de pequenas quantidades de células ou tecidos para analisar a estrutura e função de SCs mitocondriais por eletroforese nativa seguida de ensaios de atividade em gel ou western blot.

Os rendimentos das mitocôndrias obtidos seguindo os protocolos descritos acima variam dependendo de vários fatores, como a linha celular ou tipo de tecido, a natureza das amostras (ou seja, se são usados tecidos frescos ou congelados) ou a eficiência do processo de homogeneização. Os rendimentos esperados de mitocôndrias de diferentes linhagens celulares e tecidos são coletados na Tabela 2. Uma vez obtidas as frações mitocondriais, o próximo passo é a análise do padrão das CTs respiratórias, que é realizada após a solubilização da amostra mitocondrial bruta e separação eletroforética por BN-PAGE, seguida de análise de IGA ou imunodetecção de WB. A Figura 1 mostra o aspecto das faixas de gel não coradas logo após a corrida e o padrão de bandas após a coloração padrão de Coomassie de uma linha celular cultivada e uma amostra mitocondrial de fígado de camundongo.
Na Figura 2A, B, podem ser observadas diferenças claras entre os padrões de montagem SC em células humanas e de camundongo após o uso de ensaios de IGA. Assim, o complexo livre I é observado em células de camundongos, enquanto não é detectável nas mitocôndrias humanas. O padrão complexo IV-IGA é muito semelhante em ambas as linhagens de células humanas (Figura 2B), embora apresente diferenças entre as duas linhagens de células de camundongos analisadas na Figura 2A. Essas diferenças se devem ao fato de que as células BL6 expressam uma variante mutante do SCAF18.
Os padrões SC, obtidos com o protocolo de isolamento mitocondrial aqui descrito para trabalhar com amostras pequenas, são mantidos em relação aos protocolos "convencionais" usados para amostras maiores. Isso pode ser visto na Figura 2C, comparando as pistas 1 e 6 (obtidas após isolamento mitocondrial usando um protocolo convencional de 3 g de fígado e 1,1 g de BAT) com, respectivamente, as pistas 2 e 5 (obtidas usando os protocolos aqui apresentados de cerca de 0,1 g de ambos os tecidos). Conforme proposto no modelo de plasticidade, a proporção relativa de complexos respiratórios e SCs varia dependendo do tipo de célula e do estado metabólico. Conforme mostrado na Figura 2C, D, os diferentes tecidos mostram diferentes padrões de montagem SC. Assim, as mitocôndrias cerebrais apresentam níveis muito baixos de complexo livre I e maior proporção de CTs quando comparadas com os demais tecidos, e o BAT é caracterizado por seus baixos níveis de CV (Figura 2A) e altas quantidades de SC III + IV (Figura 2D). As mitocôndrias cardíacas apresentam altos níveis de SCs e CV. Os padrões de montagem CV são muito semelhantes entre a linhagem celular cultivada e uma amostra mitocondrial de fígado de camundongo (Figura 2E).
A montagem de SC também pode ser analisada por WB, conforme mostrado na Figura 3 , para duas amostras obtidas de células de controle de baço e tumorais. Nesse caso, 30-50 μg de proteína mitocondrial geralmente são suficientes para detectar os diferentes complexos e SCs com os anticorpos específicos. A Figura 4 mostra algumas das principais armadilhas que podem acontecer durante a aplicação desses protocolos. Gradientes de gel errados podem produzir padrões de migração anormais e indesejados, como na Figura 4A, pista 1, onde os SCs permanecem próximos ao poço na parte superior da pista devido a uma concentração de acrilamida acima do normal no gel. A incubação das amostras, mesmo por tempos relativamente curtos, em altas temperaturas (aqui 37 ° C e 40 ° C por 10 min) causa degradação de SCs e CI (Figura 4A pistas 2-4). Da mesma forma, a proporção detergente-proteína é crítica para bons resultados e resolução adequada do gel. Abaixo de uma proporção de 2 g de digitonina/g de proteína, a resolução da banda é progressivamente reduzida e na concentração mais baixa (0,5 g/g) apenas um esfregaço na área correspondente aos SCs é visível (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> Figura 1: Padrão de complexos e supercomplexos mitocondriais após a separação de BNGE de mitocôndrias permeabilizadas por digitonina de uma linha celular de cultura (L929Balbc) e fígado de camundongo. As faixas à esquerda (1 e 2) representam o aspecto do gel não corado logo após a corrida, onde apenas o CV é detectável, enquanto as faixas à direita (3 e 4) mostram o padrão das faixas após a coloração de Coomassie. Abreviaturas: BNGE = eletroforese em gel Blue Native; CV = complexo V; SCs = supercomplexos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> Figura 2: Análise IGA de mitocôndrias isoladas de diferentes linhagens celulares e tecidos de camundongos. (A, B) Atividade em gel dos complexos indicados em mitocôndrias isoladas de (A) linhagens celulares de camundongo ou (B) humanas. L929Balbc é uma linha celular transmitocondrial, gerada em nosso laboratório pela transferência de mitocôndrias de plaquetas de camundongo Balb/cJ para células ρ°L929neo, conforme descrito anteriormente40,41. Os fibroblastos BL6 são uma linhagem celular imortalizada gerada em nosso laboratório a partir de uma biópsia de orelha de um camundongo BL6. (C) Padrões de CI-IGA de mitocôndrias de camundongos isoladas usando um método convencional começando com 3 g de fígado (pista 1) e com 1,1 g de BAT (pista 6) ou o protocolo apresentado aqui e começando com cerca de 0,1 g de tecido em todos os casos (pista 2, fígado; pista 3, coração; pista 4, cérebro e pista 5 BAT). (D) Padrões CIV-IGA (realizados após CI-IGA mostrados no painel 2C, pistas 2-5) no fígado de camundongo, coração, cérebro e mitocôndrias BAT. (E) Atividade CV-IGA analisada em células cultivadas em camundongos e fígado. Cerca de 60-75 μg de proteína mitocondrial por pista foram carregados. Abreviaturas: IGA = atividade no gel; SCs = supercomplexos; IC = complexo I; BAT = tecido adiposo marrom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> Figura 3: Imunodetecção de WB dos diferentes complexos e supercomplexos mitocondriais em amostras de baço. Após a separação Blue Native PAGE de complexos mitocondriais e SCs obtidos de amostras de controle de baço (Baço M9) e tumor (Tumor M9), eles foram transferidos para uma membrana de PVDF e hibridizados sequencialmente com anticorpos que reconhecem as subunidades CI, CIII, CIV e CII indicadas (painéis AD, respectivamente). Cerca de 50 μg de proteína mitocondrial foram carregados por pista. Os asteriscos indicam o sinal restante de um western blot anterior. Abreviaturas: SC = supercomplexo; IC = complexo I; CIII = complexo III; CIV = complexo IV; CII = complexo II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> Figura 4: Armadilhas na análise SC por Blue-Native PAGE. CI IGA-análise de mitocôndrias isoladas de (A) fígado de camundongo fresco e (B) fígado de rato congelado sob diferentes condições de solubilização. (A) Pista 1, concentração errada de gradiente de gel (8-13% em vez dos 3-13% normais). Pistas 2-4, amostras incubadas por 10 min no gelo ou a 37 °C e 40 °C antes do carregamento, respectivamente. (B) Padrão após IGA para IC de mitocôndrias obtidas de fígado de rato congelado usando diferentes proporções de digitonina/proteína para solubilização. Abreviaturas: SC = supercomplexo; PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida; IC = complexo I; IGA = atividade no gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Média</td>
			<td colspan="3">Composição</td>
		</tr><tr><td>Tampão hipotônico</td>
			<td colspan="3">MOPS 10 mM, sacarose 83 mM, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampão hipertônico</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS, 250 mM de sacarose, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampão de homogeneização A</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sacarose, pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Tampão de homogeneização AT</td>
			<td colspan="3">225 mM manitol, 1 mM EGTA, 75 mM de sacarose, 0,01% BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Tampão de Homogeneização AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM manitol, 1 mM EGTA, 75 mM de sacarose, 0,02% BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Tampão de amostra BN</td>
			<td colspan="3">50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 2 mM Ácido aminocapróico, 1 mM EDTA pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Solução de digitonina</td>
			<td colspan="3">10% de digitonina em 50 mM de NaCl, 50 mM de Imidazol, 5 mM de aminocapróico, 4 mM de PMSF</td>
		</tr><tr><td>Buffer de carregamento BN</td>
			<td colspan="3">5% de Coomassie Blue G em ácido aminocapróico 0,75 M</td>
		</tr><tr><td>Tampão catódico BN A</td>
			<td colspan="3">50 mM de tricina, 15 mM de Bis-Tris pH = 7,0 (4 °C), 0,02% G-250 (Coomassie azul brilhante G-250)</td>
		</tr><tr><td>Tampão catódico BN B</td>
			<td colspan="3">50 mM de tricina, 15 mM de Bis-Tris pH=7,0 (4 °C), 0,002% G-250</td>
		</tr><tr><td>Amortecedor de ânodo BN</td>
			<td colspan="3">50 mM Bis-Tris, pH=7,0</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA do Complexo I</td>
			<td colspan="3">5 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL NADH, 2,5 mg/mL Nitroblue Tetrazolium (NBT)</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA do Complexo II</td>
			<td colspan="3">Tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,4, succinato de sódio 20 mM, metossulfato de fenazina (PMS) 0,2 mM, NBT 2,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA do Complexo III</td>
			<td colspan="3">Tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,2, diaminobenzidina a 0,05% (DAB)</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA complexo IV</td>
			<td colspan="3">Mesma solução que CIII mais 50 μM citocromo c</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA do complexo V</td>
			<td colspan="3">35 mM Tris, 270 mM de glicina pH 8,3, 14 mM MgSO4, 0,2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>Solução de coloração</td>
			<td colspan="3">Corante Coomassie R-250 a 0,25% em 40% de metanol e 10% de ácido acético</td>
		</tr><tr><td>Solução de descoloração/fixação</td>
			<td colspan="3">40% de metanol, 10% de ácido acético</td>
		</tr><tr><td>Buffer de transferência</td>
			<td colspan="3">48 mM Tris, 39 mM de glicina, 20% de metanol</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Buffers e composição de mídia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tipo de célula/tecido</td>
			<td>Montante inicial</td>
			<td>Rendimento esperado (μg de proteína mitocondrial)</td>
			<td>Número de pistas (50-60 μg/pista)</td>
		</tr><tr><td>Células cultivadas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MDA-MB-468</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>Derivado de 143B</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>200-350 μg</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>Fibroblastos de camundongo</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>150-200 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>Coração</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>Músculo esquelético</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>Fígado</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>Baço</td>
			<td>50 mg</td>
			<td>150-250 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>MORCEGO</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>200-300 μg</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>Cérebro</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>250-300 μg</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Rendimentos esperados de mitocôndrias de diferentes tipos de células e tecidos de camundongos. As frações mitocondriais obtidas do coração ou do músculo esquelético são mais puras do que as obtidas de outros tecidos. Assim, quantidades menores podem ser carregadas nos géis (*).

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

Nossa pesquisa está focada em entender melhor a biogênese mitocondrial, em particular, a organização e regulação do Sistema OXPHOS, e também em definir o papel que as mitocôndrias desempenham em doenças que vão do câncer a distúrbios neurodegenerativos. As mitocôndrias desempenham papéis múltiplos e essenciais na célula, condicionando todo o seu metabolismo e sobrevivência. Estamos lentamente aumentando nosso conhecimento da complexidade mitocondrial e sua contribuição para os mecanismos de adaptação celular na saúde e na doença.Contribuímos para estabelecer um novo modelo de organização para o sistema OXPHOS, o modelo de plasticidade que integra propostas anteriores e assume a coexistência de supercomplexos e complexos livres em diferentes proporções para otimizar sua função e permitir adaptações celulares. Nosso protocolo permite partir de pequenos tecidos ou amostras de cultura de células para obter quantidades suficientes de proteína mitocondrial para analisar a montagem e o status e função de supercomplexos por eletroforese nativa azul ou outras técnicas. Podemos fazer isso de forma reprodutível em pouco tempo com um equipamento simples e relativamente com baixos custos.

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve o procedimento para isolar mitocôndrias de tecidos de câncer de ovário humano usando centrifugação de velocidade diferencial em combinação com centrifugação por gradiente de densidade. As mitocôndrias isoladas podem ser usadas para análise proteômica do proteoma mitocondrial do câncer de ovário humano.

Isolamento mitocondrial: uma técnica para isolar mitocôndrias de amostra de tecido de câncer de ovário humano

Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é &lt;30 min, em comparação com 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Como as mitocôndrias são apenas uma pequena percentagem da célula vegetal, eles precisam ser purificado para uma gama de estudos. Mitocôndrias podem ser isoladas em uma variedade de órgãos da planta por homogeneização, seguida de centrifugação gradiente diferencial e densidade para obter uma fração mitocondrial altamente purificada.

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

As mitocôndrias se especializaram ribossomas que divergiram de suas contrapartes bacterianas e citoplasmáticas. Aqui nós mostramos como mitoribosomes pode ser obtido em seu compartimento nativo em células HEK. O método envolve o isolamento de mitocôndrias de células de suspensão e consequente purificação de mitoribosomes.

Isolamento rápido do Mitoribosome de células HEK

Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Apresentamos um protocolo em duas etapas para isolamento de mitocôndrias de alta qualidade que é compatível com a descoberta e quantificação de proteínas em escala de proteoma. Nosso protocolo não requer engenharia genética e, portanto, é adequado para estudar mitocôndrias de quaisquer células e tecidos primários.

Isolamento sem etiquetas em duas etapas de mitocôndrias para melhor descoberta e quantificação de proteínas

Estudos bioenergéticos e metabolômicos sobre mitocôndrias revelaram seu papel multifacetado em muitas doenças, mas os métodos de isolamento para essas organelas variam. O método detalhado aqui é capaz de purificar mitocôndrias de alta qualidade de várias fontes de tecido. A qualidade é determinada pelas taxas de controle respiratório e outras métricas avaliadas com respirometria de alta resolução.

Isolamento mitocondrial robusto de tecido cardíaco de roedores 

Aprenda a isolar mitocôndrias para análise de supercomplexos respiratórios a partir de pequenas amostras de tecidos e culturas celulares. Este método permite estudar a biogênese mitocondrial e a organização do sistema OXPHOS.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células

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