Estabelecimento de um modelo minimamente invasivo de embolia pulmonar em ratos usando coágulos sanguíneos autólogos

O escopo de nossa pesquisa é melhorar a confiabilidade e a reprodutibilidade de modelos de roedores para embolia pulmonar que imitam a fisiopatologia humana. Nosso objetivo é responder como técnicas minimamente invasivas são usadas para induzir modelos de EP, esperando que facilitem o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Nossos protocolos geram coágulos sanguíneos autólogos de maneira padrão e induziram modelos de PE de roedores cirúrgicos com invasividade mínima, melhorando assim a confiabilidade e a reprodutibilidade dos experimentos com animais de EP. Revelamos que a resolução do coágulo é rápida em roedores. Isso explica por que um modelo de hipertensão pulmonar tromboembólica crônica é difícil de estabelecer. As técnicas de visualização de coágulos aqui guiarão o desenvolvimento de um modelo animal CTAP confiável. Somos um laboratório conjunto de engenharia biomédica e equipes clínicas cardiovasculares. Com este modelo, nosso laboratório se concentrará no desenvolvimento de novas estratégias de prevenção de tromboembolismo e complicações para EP com base em soluções avançadas de biomateriais.

[Narrador] Para começar, posicione o animal anestesiado na plataforma de operação em decúbito dorsal. Estenda os dois membros horizontalmente do corpo e estenda os membros posteriores para expor adequadamente a região da virilha. Usando fita médica, prenda o animal nesta posição. Use um barbeador elétrico para raspar os pelos ao redor do esterno e da virilha. Em seguida, espalhe o creme depilatório nos pelos residuais e desinfete a pele três vezes com iodopovidona. Insira uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa de um mililitro verticalmente a uma profundidade de oito milímetros para perfurar a veia cava craniana esquerda ou direita. Em seguida, segure a seringa e puxe suavemente o êmbolo para trás para criar pressão negativa dentro do cilindro. Retire gradualmente a agulha até que o sangue flua. Em seguida, mantenha essa posição até que 0,3 mililitros de sangue sejam coletados. Para a preparação do coágulo sanguíneo, empurre o sangue coletado para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, puxe o sangue para o tubo de silicone do gerador de trombo de fabricação própria até que a coluna de sangue tenha 10 centímetros de comprimento. Aguarde 30 minutos para permitir que o sangue coagule. Em seguida, lave a coluna de sangue do trombo em uma placa de Petri contendo solução salina normal. Depois, usando uma tesoura fina, corte a coluna de trombo em coágulos sanguíneos uniformes, cada um com quatro milímetros de comprimento. Puxe de 15 a 25 coágulos para o injetor de fabricação própria pré-preenchido com dois mililitros de solução salina normal. Após desinfetar a área cirúrgica do rato anestesiado, faça uma incisão na pele de cinco milímetros acima da origem dos vasos epigástricos superficiais na região da virilha. Usando um microscópio estereoscópico de ampliação de 10x, separe uma fina camada de gordura subcutânea para expor os vasos epigástricos superficiais. Isole cuidadosamente a veia epigástrica superficial da artéria, nervo e tecido adiposo. Em seguida, controle o lado distal com um 8-0 sutura estéril e prenda a sutura com um micro grampo. Controle o lado proximal com um 8-0 laço de sutura estéril preso a outro micro grampo. Amarre a alça distal e corte a veia com um cauterizador. Em seguida, faça uma pequena incisão transversal no lado distal da veia isolada e lave o sangue restante no lúmen da veia com solução salina normal. Quando a veia estiver limpa, use uma micropinça para aumentar a incisão venosa. Para embolização, insira suavemente a agulha do injetor de fabricação própria na veia através da incisão da veia. Prenda a agulha com um terceiro grampo para evitar que escorregue para fora da veia. Em seguida, empurre lentamente o êmbolo para administrar uma pequena quantidade de solução salina normal. Continue empurrando o êmbolo para administrar coágulos na veia femoral através do acesso superficial à veia epigástrica. Ligue a veia com a sutura proximal. Finalmente, suturar a incisão. Após a eutanásia do rato com overdose de isofluran, corte as costelas com uma tesoura grande e abra o tórax evitando danos aos pulmões e grandes vasos. Agora insira a agulha do dispositivo de infusão no ventrículo esquerdo. Abra a válvula do dispositivo de infusão para permitir a infusão de solução salina heparinizada. Usando uma tesoura, corte a veia cava inferior e o apêndice esquerdo para permitir a drenagem. Controle a velocidade de perfusão em 50 mililitros por minuto. Após a perfusão, usando uma seringa de 10 mililitros cheia de solução de paraformaldeído a quatro por cento, perfure o tronco da artéria pulmonar através do ventrículo direito. Fixe o tecido pulmonar realizando profusão de paraformaldeído a quatro por cento através dos pulmões para um volume total de 30 mililitros. Para visualização da árvore arterial pulmonar, adicione uma quantidade igual de diluente ao composto de fundição de silicone. Depois de misturar a mistura, adicione cinco por cento de agente de cura e misture a mistura novamente. Em seguida, coloque um mililitro da mistura em uma seringa de um mililitro. Esgote o ar e insira a agulha no tronco da artéria pulmonar através do ventrículo direito. Pressione suavemente o êmbolo para permitir que a mistura de silicone preencha a árvore arterial pulmonar. Coloque toda a massa em uma placa de Petri antes de armazená-la em uma geladeira de quatro graus Celsius durante a noite para permitir que a mistura de fundição cristalize. Mergulhe os pulmões sequencialmente em soluções de álcool etílico a 25%, 50%, 75%, 95% e 100% cada uma por 24 horas. Mergulhe os pulmões desidratados em salicilato de metila por 24 horas. Imediatamente após a embolização, os pulmões extraídos apresentaram coágulos sanguíneos autólogos e áreas com infarto pulmonar. Uma carga maior de êmbolos resultou na maior área de infarto pulmonar. Em comparação com as amostras de pulmão colhidas imediatamente após a embolização, as amostras de pulmão coletadas 24 horas após a embolização mostraram áreas de infarto marcadamente diminuídas, indicando um forte potencial intrínseco de fibrinólise em ratos. Esta figura mostra a árvore arterial pulmonar após a moldagem e limpeza do tecido para pulmões normais e para pulmões de embolia pulmonar.