Name: Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 31 s
Description: Aprenda a formar organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina 3D para estudar tolerância imunológica e autoimunidade. Este método permite manter organoides por até seis semanas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Recriando o microambiente tímico com organoides derivados de iPSC

<ol><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).</li>
<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+thymus+and+its+impact+on+modern+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The function of the thymus and its impact on modern medicine.</a> Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).</li>
<li>Haddad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus-colonizing+cells+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus-colonizing cells during human development.</a> Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).</li>
<li>Cumano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+insights+into+immune+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New molecular insights into immune cell development.</a> Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).</li>
<li>Bautista, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+human+thymic+stroma+uncovers+novel+cellular+heterogeneity+in+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla.</a> Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).</li>
<li>Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cell+heterogeneity%3A+TEC+by+TEC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC.</a> Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).</li>
<li>Alves, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+progression+of+cortical+and+medullary+thymic+epithelial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments.</a> Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Tavian, M., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+human+hematopoietic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the human hematopoietic system.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).</li>
<li>Abramson, J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells.</a> Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Sharma, H., Moroni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+regenerative+approaches+for+thymus+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation.</a> Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix%2C+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins.</a> Sci STKE. 2002 (119), 6(2002).</li>
<li>Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).</li>
<li>Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+thymic+extracellular+matrix+improves+in+vivo+thymic+organoid+T+cell+output%2C+and+drives+in+vitro+thymic+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation.</a> Biomaterials. 118, 1-15 (2017).</li>
<li>Asnaghi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+extracellular+matrix-derived+scaffolds+support+graft-resident+thymopoiesis+and+long-term+in+vitro+culture+of+adult+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells.</a> Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).</li>
<li>Villegas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+thymic-derived+cells+display+medullary+thymic+epithelial+cell+phenotype+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality.</a> Front Immunol. 9, 1663(2018).</li>
<li>Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+TGF-%CE%B2+signaling+in+the+establishment+and+function+of+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla.</a> Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Campinoti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+thymus+by+postnatal+stromal+progenitor+cells+and+natural+whole-organ+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds.</a> Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+thymus+organoids+to+restore+thymic+function+and+induce+donor-specific+immune+tolerance+to+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts.</a> Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).</li>
<li>Provin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+generates+thymic+epithelium+that+supports+thymic+crosstalk+and+directs+dendritic-+and+CD4%2FCD8+T-cell+full+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development.</a> bioRxiv. 2023, 572664(2023).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+that+supports+host+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+thymic+epithelial+progenitor-like+cells+reconstitutes+the+thymic+microenvironment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).</li>
<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+to+thymic+epithelial+cells+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype.</a> Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).</li>
<li>Gras-Pena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+thymic+epithelial+cells+enhance+human+T+cell+development+in+a+xenogeneic+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).</li>
<li>Lai, L., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+thymic+epithelial+cell+progenitors+by+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+thymic+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).</li>
<li>Provin, N., Giraud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+thymic+epithelial+cells+and+generation+of+thymic+organoids%3A+Applications+for+therapeutic+strategies+against+APECED%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED.</a> Front Immunol. 13, 930963(2022).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+murine+thymopoiesis+from+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells.</a> Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).</li>
<li>Park, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+T+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), 3224(2020).</li>
<li>Flippe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reproducible+differentiation+of+hematopoietic+and+T+cell+progenitors+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).</li>
<li>Padonou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire-dependent+transcripts+escape+Raver2-induced+splice-event+inclusion+in+the+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium.</a> EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).</li>
<li>Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-oxygen+submersion+fetal+thymus+organ+cultures+enable+FOXN1-dependent+and+-independent+support+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis.</a> Front Immunol. 12, 652665(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-165</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (CD197)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: 3D12; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>Clone: M5E2; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HIB19; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD205</td><td>Clone BioLegend</td><td>FITC</td><td>: MG38; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HIT3a; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>Clone: 8G12; Diluição: 1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: RPA-T4; Diluição: 1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BV711</td><td>Clone: L200; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>PerCP</td><td>Clone: HI30; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: B159; Diluição: 1:200</td></tr><tr><td>CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>BV605</td><td>Clone: DREG-56; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD69</td><td>BD Biosciences</td><td>BV510</td><td>Clone: FN50; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>APC Clone: M-T701; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PeCy7</td><td>Clone: RPA-T8; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HIT8a; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>Dynabeads Pan Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HEA-125; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>Miltenyi</td><td>BV711</td><td>Clone: EBA-1; Diluição: 1: 200</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Miltenyi</td><td>130-127-858</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Biotechne R& D</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma Aldrich 341578</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLT3 L</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-19</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-886</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-07</td><td></td></tr><tr><td>RANK L</td><td>Biotechne R & D</td><td>6449-TEC</td><td></td></tr><tr><td>Solução de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-07</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605190</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>2605010</td><td></td></tr><tr><td>XVIVO10</td><td>Lonza</td><td>LONBE04-380Q</td><td></td></tr></tbody></table>

formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

O fluxo de trabalho do protocolo está resumido na Figura 4. Para este modelo de cultura organoide 3D, adotamos um hidrogel de trombina e fibrinogênio que já havia sido usado por nossa equipe para manter mTECs primários de camundongos por alguns dias, graças às pistas físicas e mecânicas que forneceu34. Após a polimerização, o gel deve apresentar uma estrutura de malha solta e esponjosa (Figura 5).
Após a fase inicial de semeadura e fixação, os organoides cresceram e se desenvolveram progressivamente tanto na superfície quanto nas camadas superiores do gel. Dependendo das propriedades do gel, das condições de semeadura e do número de organoides semeados no gel, os organoides formaram estruturas esféricas a oblongas (Figura 6) e ocasionalmente se fundiram para formar estruturas maiores. Dois subníveis específicos da organização foram observados dentro dos organoides após a primeira semana de cultura: primeiro, observamos estruturas longas semelhantes à projeção da superfície celular formadas por grandes células irradiando dos organoides e colonizando o hidrogel em todas as direções (Figura 6 e Figura 7). Em segundo lugar, observamos estruturas semelhantes a aglomerados formadas por células menores concentradas em torno dessas projeções celulares. Embora não tenhamos sido capazes de isolar os dois tipos de células para confirmar a hipótese do estudo, esse fenômeno é uma reminiscência dos arranjos 3D encontrados no córtex tímico, formados pela interação de cTECs individuais com um grande número de células T em desenvolvimento muito menores, conhecidas como complexos de células tímicas11 (Figura 8).
Em vários momentos durante a fase de cultura de organoides, avaliamos a composição celular dos organoides tímicos por citometria de fluxo e identificamos vários compartimentos principais: TEC (caracterizado como EPCAM+ CD45-), timócitos (EPCAM-CD45+ CD3+) (Figura 9), bem como um compartimento EPCAM-CD45+ CD3- compreendendo subconjuntos de não-timócitos hematopoiéticos tímicos. Mais detalhes podem ser encontrados em Provin et al.23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig01.jpg"> Figura 1: Caracterização da diferenciação de iPSC para TEP. (A) Exemplo de diferenciação de iPSC para TEP em D13, microscópio de contraste de fase invertida, 400x. Barra de escala: 500 μm. (B) Exemplo de gráfico de pontos, a proporção de células EPCAM+ entre as células DAPI- no dia 14 de diferenciação, imagem de FlowJo 10.0.7. (C) Imunocoloração contra DAPI (azul), PAX9 (vermelho) e KRT8 (verde), imunofluorescência e imagem confocal no dia 16 de diferenciação de iPSC para TEP. Setas brancas apontam para exemplos de coloração anti-PAX9. Barra de escala: 50 μm (D) Nível de expressão de FOXN1 (RQ a GAPDH) durante a diferenciação de iPS para TEP. TEC: Referência de controlo positivo, TEC humanos primários isolados de amostras de timo pediátrico. Gráfico do Prism (GraphPad versão 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig02.jpg"> Figura 2: Configuração experimental para formação de hidrogel, semeadura de organoides e distribuição do meio de cultura. (A) Placa de cultura com hidrogéis fundidos em inserções suspensas colocadas nas linhas superior e inferior. (B) Semeadura organoide: o cone da pipeta cortada contendo 1 organoide é colocado acima do hidrogel sem tocá-lo, e o organoide é suavemente semeado na superfície do gel. (C) O meio de cultura é depositado no poço de cultura posicionando a ponta da pipeta entre os braços do inserto suspenso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig03.jpg"> Figura 3: D0 da cultura de organoide tímico antes da semeadura (dias 13-15 do protocolo completo). (A) organoide produzido com TECs derivados da linha Lon71.019 iPS. (B) Organoide produzido com TECs derivados da linha MIPS203.003 iPS. Microscópio de contraste de fase invertida, 1000x. Barras de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig04.jpg"> Figura 4: Representação resumida de todas as etapas do protocolo. Amostras de timo pediátrico foram coletadas e dissociadas, e ETPs primárias de Lin-CD34+ CD7+ foram classificadas por citometria de fluxo. A diferenciação de células iPS foi conduzida em direção a uma identidade TEP. ETPs e TEPs derivados de iPS foram agrupados e semeados em placas de 96 poços de baixa ligação e agregados em organoides tímicos durante a noite. Os hidrogéis de fibrina foram preparados a partir de aprotinina, fibrinogênio e trombina e fundidos em inserções suspensas. Após a polimerização, os organoides foram semeados sobre os hidrogéis, e o meio de cultura da fase 1 foi adicionado aos poços. Os organoides foram mantidos em cultura por até 6 semanas. Criado em BioRender, licença de publicação AG26EFCZOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig05.jpg"> Figura 5: Organização e estrutura do hidrogel. Microscópio de contraste de fase invertida, 1000x. Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig06.jpg"> Figura 6: Organoides maduros e estrutura tridimensional. (A) Organoide tímico no dia 24 da cultura 3D, MIPS203,003 linha iPS. (B) Imagem composta de um organoide tímico no dia 32 da cultura 3D, linha Lon71.019 iPS. Microscópio de contraste de fase invertida. Barras de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig07.jpg"> Figura 7: Detalhe da estrutura dos organoides tímicos. (A) Organoide tímico no dia 32 da cultura 3D, linha L71.019 iPS. (B) Organoide tímico no dia 27 da cultura 3D, linha L80.002 iPS. Microscópio de contraste de fase invertida, 400x. Barras de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig08.jpg"> Figura 8: Detalhe da estrutura de um organoide tímico no dia 32 da cultura 3D. As setas brancas apontam para aglomerados de pequenos timócitos proliferando nas proximidades das células TEC. Microscópio de contraste de fase invertida, 400x. Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig09.jpg"> Figura 9: Proporção do compartimento de células T dentro dos organoides tímicos. (A) Exemplo de gráfico de pontos, proporção de células CD45 + CD3 + dentro das células vivas (DAPI-) em organoides tímicos no dia 35 da cultura 3D, imagem de FlowJo 10.0.7. A fração CD45+ CD3- compreende células hematopoiéticas não timócitos. (B) A proporção de células CD45 + CD3 + dentro de células vivas em organoides tímicos nos dias 17, 24/25, 32 e 39/40 da cultura 3D, n = 2 em duplicata técnica ou triplicada, gráfico do Prism (GraphPad versão 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Unidade</td>
			<td>Fase 1 médio Dia 14 até o Dia 18</td>
			<td>Fase 2 médio Dia 19 em diante</td>
		</tr><tr><td>Base</td>
			<td></td>
			<td>XVIVO10</td>
			<td>XVIVO10</td>
		</tr><tr><td>BMP4</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF8</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF10</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>IGF1</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FEG</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CLASSIFICAÇÃO L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>IL7</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FLT3 L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>CCAH</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>Glutamamax</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Suplementos e suas respectivas concentrações.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Aprotinina (μL)</td>
			<td>Trombina (μL)</td>
			<td>Fibrinogênio (μL)</td>
			<td>Fase 1 média</td>
			<td>Organoides (unidade)</td>
		</tr><tr><td>Placa de 24 poços</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>3 a 5</td>
		</tr><tr><td>Placa de 12 poços</td>
			<td>9.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Placa de 6 poços</td>
			<td>16</td>
			<td>240.8</td>
			<td>240.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>8 a 9</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Proporções necessárias de componentes para preparação de hidrogéis e organoides de semeadura em placas de 6, 12 e 24 poços.

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

formation-human-thymus-organoids-three-dimensional-fibrin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo a preparação de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo é demonstrada.

Reaggregate Culturas Thymus

O estudo de células epiteliais tímicas medulares in vitro não teve sucesso, pois os sistemas de cultura 2D atuais não imitam o cenário in vivo. O sistema de cultura 3D aqui descrito - um modelo de cultura organotípica de pele modificada - provou ser superior na recapitulação da proliferação, diferenciação e manutenção da expressão gênica promíscua.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Este vídeo demonstra um protocolo para enriquecer células epiteliais tímicas (TECs) com gradiente de densidade para isolamento de FACS. Também mostra o uso de peptídeos EAK16-II/EAKIIH6 para promover a formação de agregados TEC. Os microambientes do hidrogel EAK16-II/EAKIIH6 fornecem a configuração 3-D necessária para manter a sobrevivência e a função dos TECs.

Promover 3-D agregação de células FACS purificada epiteliais tímicos com EAK 16-II / EAKIIH6 de auto-montagem Hidrogel

O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

Aqui, demonstramos um modelo organoide de três etapas (expansão bidimensional [2D], estimulação 2D, maturação tridimensional [3D]) oferecendo uma ferramenta promissora para pesquisa fundamental de tendões e um potencial método livre de andaimes para engenharia de tecidos tendinosos.

Demonstração de Cultura de Folha de Células Auto-Montadas e Geração Manual de um Organoide 3D Semelhante a Tendão/Ligamento usando Fibroblastos Dérmicos Humanos

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Este protocolo descreve um método definido baseado em hidrogel para gerar organoides mamários humanos que recapitulam características-chave da morfogênese mamária em um sistema de cultura tridimensional controlado.

Um método definido à base de hidrogel para gerar organoides mamários humanos tridimensionais que recapitulam a morfogênese mamária

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Aprenda a formar organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina 3D para estudar tolerância imunológica e autoimunidade. Este método permite manter organoides por até seis semanas.

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

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