Name: Vitrificação do tecido do córtex ovariano para atingir um estado vítreo de agregação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprenda a vitrificação do córtex ovariano para preservação da fertilidade em pacientes jovens com câncer. Este método oferece vantagens sobre a congelação lenta, com cinco partos bem-sucedidos relatados.

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<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação da viabilidade folicular em tecidos de córtex ovariano humano vitrificado

<table><tbody><tr><td>Frascos para injetáveis de 1,8 ml</td><td>VWR International GmbH</td><td>479-6837</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 4 poços</td><td>Gynemed</td><td>GYOOPW-FW04</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 ml Sarstedt</td><td></td><td>62.559.001</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Bacilol AF</td><td>Hartmann</td><td>973385</td><td></td></tr><tr><td>Calceína AM</td><td>Merck</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo 1A</td><td>Merck</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Cryosure DMSO</td><td>WAK Chemie</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz K&ouml; hler Chemie</td><td>00867288</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>CTS Gibco Life technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne pipeta auxiliar</td><td>Starlab</td><td>S7166-0010</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Euronda recipiente de esterilização</td><td>euronda</td><td>282021</td><td></td></tr><tr><td>G-MOPS+</td><td>Vitrolife</td><td>10130</td><td></td></tr><tr><td>Metal malhas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum tesoura</td><td>instrumentos de precisão mundial</td><td>501262102</td><td></td></tr><tr><td>N-Bath System</td><td>Nterilizer</td><td>N-Bath 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (PVP)</td><td>SAGE</td><td>ART-4005</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento substituto de soro (SSS)</td><td>Fujifilm Irvine scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td>Copo</td> <td>estérilSarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>Pinça estéril</td><td>Carl Roth</td><td>KL05.1</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Merck</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrificação do tecido do córtex ovariano para atingir um estado vítreo de agregação

Vitrification of Ovarian Cortex Tissue to Achieve a Glassy State of Aggregation

Este protocolo apresenta os procedimentos para a preparação de meios de vitrificação, dispositivos de carregamento, vitrificação, preparação de meios de aquecimento rápido, aquecimento rápido e determinação da viabilidade folicular. Uma comparação direta da viabilidade folicular e fatores angiogênicos entre congelamento lento e vitrificação foi validada e publicada31,32.
O sucesso geral do protocolo de vitrificação descrito foi avaliado comparando a contagem de folículos vitais antes e depois da vitrificação/aquecimento rápido. A configuração experimental é mostrada na Figura 1 e os resultados são apresentados na Figura 6. Em 50 pacientes, foi observada uma contagem média de 77,98 folículos vitais antes da vitrificação e 62,99 após a vitrificação/aquecimento rápido, refletindo uma taxa de sobrevida de 80,8%. Isso não foi significativamente diferente de acordo com o teste de Wilcoxon33.
As grades metálicas são personalizadas individualmente com tesouras afiadas para um tamanho de 25 mm x 8 mm, que se encaixa nas tampas de criogenias de 1,8 mL, conforme mostrado na Figura 2A, C. Após a esterilização em autoclavagem a vapor, as grades e tampas dos frascos de 1,8 mL são montadas sob uma bancada de fluxo laminar, conforme indicado na Figura 2B. Essa configuração fornece uma fixação segura na tampa sem a necessidade de ações adicionais e oferece área suficiente para tecidos de vários tamanhos. Normalmente, pedaços de tecido de 5 mm x 10 mm para transplante e pedaços de 2 mm de diâmetro para avaliar a contagem de folículos vitais após o descongelamento rápido são vitrificados. Ambos os tamanhos se encaixam perfeitamente nas grades de metal.
O equilíbrio com soluções de vitrificação (VS1, VS2 e VS3) é conduzido em uma placa de 6 poços em um agitador de balanço à temperatura ambiente sob uma bancada de fluxo laminar, conforme mostrado na Figura 3. Os prazos do esquema garantem a absorção efetiva do crioprotetor etilenoglicol. Recomenda-se o uso de uma placa de 6 poços sobre vasos únicos, pois facilita o movimento rápido do tecido entre as soluções e ajuda a evitar confusões.
Para vitrificação vertical rápida em nitrogênio líquido, o tecido do córtex ovariano é cortado em pedaços adequados (Figura 4A). As amostras do córtex ovariano são colocadas em dispositivos de carregamento ( Figura 4B , C ) e submersas verticalmente em nitrogênio líquido ( Figura 4D ) para atingir um estado vítreo de agregação por meio de vitrificação. As grades metálicas escolhidas permitem o manuseio vertical do tecido, conforme mostrado na Figura 4D. Além disso, as grades metálicas são altamente condutoras termicamente, garantindo taxas de resfriamento rápidas de 22 °C a -196 °C, o que é uma etapa extremamente importante no processo de vitrificação.
Para aquecimento rápido, o RWS é preparado em um copo estéril a 37 ° C. ES, RS1 e RS2 são preparados em uma placa de 6 poços em um agitador à temperatura ambiente, conforme mostrado na Figura 5. O alto volume de RWS pré-aquecido evita que a solução esfrie excessivamente com a adição do tecido vitrificado e garante um ambiente consistentemente quente para o tecido durante todo o processo de aquecimento rápido.
Para avaliar e garantir altos padrões de qualidade, punções de biópsia de 2 mm x 2 mm são corados com calceína antes da vitrificação e após aquecimento rápido para determinar a viabilidade folicular usando microscopia de fluorescência34,35 (Figura 6). Os folículos viáveis emitem fluorescência verde a 495 nm após a captação intracelular de calceína. Alternativamente, a viabilidade folicular (Tabela 3) pode ser avaliada usando corantes vermelhos neutros36.
Seguindo as etapas descritas neste protocolo, o tecido ovariano é transformado em um estado vítreo de agregação, o que facilita altas taxas de sobrevivência após aquecimento rápido, conforme confirmado por microscopia de fluorescência.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig01.jpg"> 
Figura 1: Desenho do estudo. Amostras corticais ovarianas de 50 pacientes foram examinadas antes (frescas) e depois da vitrificação e aquecimento rápido para o número de folículos viáveis. Para cada grupo, dois pedaços de tecido de 2 mm de diâmetro foram cultivados por 24 h antes da avaliação da contagem de folículos. O tecido foi digerido com colagenase e corado com calceína para avaliar a viabilidade. O número de folículos viáveis foi determinado usando um microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig02.jpg"> 
Figura 2: Preparação dos dispositivos de carregamento. As grades metálicas foram cortadas no tamanho de 8 mm x 25 mm (A). As grades metálicas personalizadas foram esterilizadas em autoclave (B). As grades metálicas esterilizadas foram então inseridas em tampas de frascos de 1,8 mL, prontas para uso (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig03.jpg"> 
Figura 3: Preparação de soluções de vitrificação. As soluções de vitrificação (VS) foram preparadas e transferidas para uma placa de 6 poços. Os poços mostram o volume de cada solução e os tempos de incubação individuais utilizados no protocolo de vitrificação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig04.jpg"> 
Figura 4: Processamento e vitrificação do córtex ovariano. O tecido do córtex ovariano foi processado para criopreservação removendo a medula e cortando o tecido em pedaços de 5 mm x 10 mm (A). Após a incubação nas soluções de vitrificação mostradas na Figura 3, o tecido foi carregado no dispositivo de carga de vitrificação (B,C). Para vitrificação vertical rápida de amostras de córtex ovariano, as tampas com o tecido carregado foram rapidamente inseridas em nitrogênio líquido esterilizado (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig05.jpg"> 
Figura 5: Preparação de soluções de aquecimento rápido. Solução de aquecimento rápido (RWS), solução de equilíbrio (ES) e soluções de enxágue (RS) 1 e 2 foram preparadas e transferidas para uma placa de 6 poços. Os recipientes e poços mostram o volume de cada solução e os tempos de incubação correspondentes. Observe que o RWS é mantido a 37,2 ° C em uma placa de aquecimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig06.jpg"> 
Figura 6: Contagem de viabilidade. Para avaliar o número de folículos viáveis, pedaços de tecido de 2 mm de diâmetro foram digeridos com colagenase e corados com calceína. As imagens representativas mostram (A) coloração de calceína de 3 folículos recuperados antes da vitrificação. (B) Um folículo viável recuperado após vitrificação e aquecimento rápido. (C) Um folículo viável recuperado antes do congelamento lento. (D) Folículos viáveis recuperados após congelamento e descongelamento lentos. A viabilidade folicular é indicada pela calceína, um corante fluorescente verde que emite fluorescência verde quando convertido enzimaticamente por células viáveis a 495 nm. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>VS 1 (15 mL)</td>
			<td>Etilenoglicol</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 2 (15 mL)</td>
			<td>Etilenoglicol</td>
			<td>20%</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>10,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 3 (15 mL)</td>
			<td>Etilenoglicol</td>
			<td>35%</td>
			<td>5,25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sacarose</td>
			<td>0,5 mol/L</td>
			<td>2,57 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PVP</td>
			<td>5 % (m/v)</td>
			<td>0,75 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Composição das soluções de vitrificação (VS).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RWS (30 mL)</td>
			<td>Sacarose</td>
			<td>0,8 mol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8,22 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES (15 mL)</td>
			<td>Sacarose</td>
			<td>0,4 mol/L</td>
			<td>2,05 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS 1 e 2 (15 mL)</td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Composição da solução de aquecimento rápido (RWS), solução de equilíbrio (ES) e soluções de enxágue (RS). Esta tabela fornece os componentes e concentrações para a solução de aquecimento rápido (RWS), solução de equilíbrio (ES) e soluções de enxágue (RS) usadas no processamento pós-vitrificação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parâmetro</td>
			<td>Fresco</td>
			<td>Intervalo</td>
			<td>Rápido aquecido após vitrificação</td>
			<td>Intervalo</td>
			<td>n</td>
			<td>*Valor de p</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contagem de viabilidade folicular [n]</td>
			<td>77.98</td>
			<td>0-386</td>
			<td>62.99</td>
			<td>0.5-349</td>
			<td>50</td>
			<td>0.130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>77.95</td>
			<td></td>
			<td>80.02</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Teste de Wilcoxon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Resultados representativos da viabilidade folicular. Esta tabela apresenta os resultados das avaliações de viabilidade folicular antes da criopreservação e após o aquecimento rápido. Dois pedaços de tecido de 2 mm de diâmetro por paciente foram usados para contar o número de folículos viáveis antes e depois da vitrificação/aquecimento rápido. Amostras de tecido pareadas de 50 pacientes foram analisadas usando o teste de Wilcoxon.

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