Name: Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a induzir morte celular em macrófagos THP-1 diferenciados com PMA usando LPS e ATP. Este método combina citometria de fluxo e microscopia eletrônica para analisar piroptose, apoptose e necroptose em respostas inflamatórias.

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Expressamos nossa grande gratidão a Jiayi Sun e Lu Yang do Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Farmácia da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, pela assistência com citometria de fluxo, Cuiping Chen do Laboratório Estadual de Recursos de Medicina do Sudoeste Chinês, pela ajuda com microscopia eletrônica de varredura. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [82104491], pela Fundação de Ciências Naturais de Sichuan [2023NSFSC0674] e pela Fundação de Ciências de Pós-Doutorado da China [2021M693789].

1. Linhagem celular e cultura celular
<ol><li>Cultive a linha celular monocítica humana THP-1 em meio de cultura completo RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultive as células a 37 ° C em ar umidificado com 5% de CO2 . Subcultura de células a cada 2-3 dias. NOTA: THP-1 é uma célula de suspensão, selecione para alterar metade do meio para subcultura. Ao observar muitos fragmentos de células ao microscópio óptico, centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente. Ressuspenda as células no meio de cultura celular completo fresco pré-aquecido.</li>
	<li>Use células (nas passagens 4-10) na fase de crescimento logarítmico para todos os experimentos. Quando as células estão em boas condições e fase de crescimento logarítmico, elas são redondas, brilhantes, densas e sem aglomerados e fragmentos de células ao microscópio óptico a 100 x.</li>
</ol>2. Diferenciação de células THP-1
<ol><li>Prepare uma solução de estoque de PMA com uma concentração de 1 mM (dissolva 1 mg de PMA em 1,62 mL de dimetilsulfóxido). Diluir a solução-mãe de PMA com meio de cultura celular completo até obter uma concentração final de trabalho de 100 nM.</li>
	<li>Recolher as células da placa de cultura para um tubo de centrifugação estéril de 10 ml. Centrifugue a 300 x g por 3 min à temperatura ambiente, ressuspenda as células com 3 mL de meio de cultura completo contendo PMA.</li>
	<li>Abra o contador de células e o software de contagem. Pipetar 20 μL de suspensão de células para a placa do contador de células e insira-o na placa do contador de células. Clique em Preview B1, gire o botão na parte inferior direita do instrumento e ajuste a distância focal para tornar as células com centro brilhante com contornos claros no software. Clique em Contar para iniciar a contagem.</li>
	<li>Com base nos resultados da contagem, use meio de cultura completo contendo PMA para ajustar a densidade celular para 1 x 106 células / mL. Células de sementes em uma placa de 6 poços, incubar a placa por 24 h a 37 ° C e 5% de CO2 antes de iniciar o tratamento adicional.</li>
</ol>3. Tratamento de células THP-1
<ol><li>Prepare uma solução estoque de LPS com uma concentração de 1 mg / mL (dissolva 1 mg de LPS em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS)). Diluir a solução-mãe de LPS com meio isento de soro até obter uma concentração final de trabalho de 1 μg/ml. Preparar uma solução-mãe de ATP de Na2com uma concentração de 500 mM (dissolver 0,3026 g de ATP em 1 ml de PBS).</li>
	<li>Aspire o meio contendo PMA dos poços e lave com PBS 1x. Adicione meio sem soro ao grupo de controle e meio sem soro contendo LPS ao grupo modelo. Incubar a placa durante 6 h a 37 °C + 5% de CO2 antes de prosseguir com o tratamento adicional.</li>
	<li>Após 6 h, adicionar a solução-mãe de ATP ao grupo de modelos até uma concentração final de trabalho de 500 nM. Incubar a placa durante 45 min a 37 °C + 5% CO2 antes de prosseguir.</li>
</ol>4. Análise por citometria de fluxo (método 1)
<ol><li>Preparação de amostras experimentais<ol><li>Semeie e incube as células em placas de 6 poços de acordo com a etapa 2. Estabeleça quatro grupos de controle sem tratamento: um controle sem coloração, dois controles de coloração simples (um para cada mancha) e um controle de coloração dupla. Estabeleça um grupo de tratamento e trate de acordo com a etapa 3.</li>
		<li>Após o tratamento, aspirar todo o sobrenadante dos poços e lavar com PBS 2x. Adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (não EDTA) a cada poço e incube na incubadora por 30 s.</li>
		<li>Adicione 1 mL de meio de cultura completo RPMI-1640 a cada poço para impedir o descolamento da célula e colete as células no tubo de 5 mL. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 1 mL de PBS para ressuspender as células. Coloque os tubos com células em banho-maria a 37 °C durante 3 min. Centrifugue todas as amostras a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Dilua 200 μL de tampão de ligação 5x com 800 μL de água destilada para tampão de ligação 1x. Adicione 100 μL de tampão de ligação 1x para ressuspender as células e transfira as células para o tubo de 5 mL.</li>
		<li>Adicione 5 μL de solução de anexina V-PE a um tubo de células do grupo controle por 10 min e 5 μL de solução de 7-AAD a outro tubo de células do grupo controle por 5 min (como controles de coloração simples separadamente). Agite suavemente cada tubo para misturar, corante e incubar as amostras em temperatura ambiente protegida da luz. Adicione 400 μL de PBS a cada tubo e vore suavemente para encerrar a incubação.</li>
		<li>Adicione 5 μL de solução de Anexina V-PE aos tubos restantes e incube por 5 min em temperatura ambiente. Agite suavemente cada tubo para misturar, corante e incubar as amostras em temperatura ambiente protegida da luz. Após 5 min, adicione 5 μL de solução de 7-AAD por 5 min em temperatura ambiente. Adicione 400 μL de PBS a cada tubo e vortex suavemente para encerrar a incubação.</li>
		<li>Filtrar a suspensão celular com uma malha de nylon de 35 μm que faz parte dos tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml. Coloque o tubo no gelo e aguarde o teste. Misture suavemente antes de testar e insira-o no instrumento.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometria de fluxo<ol><li>Use citômetro de fluxo de classificação de células ativado por fluorescência para teste. Abra o software de análise de dados do citômetro de fluxo e confirme o desempenho do detector e do laser. Clique no citômetro e escolha Inicialização de fluidos, aguarde o sistema estar pronto. Exclua as bolhas da câmara de fluxo clicando em Citômetro > Modos de limpeza > Célula de fluxo de desgaseificação.</li>
		<li>Clique em Experimento, selecione em sequência Nova pasta, Experimento, Espécime, Tubo e Editar nome. Uma seta em forma pentagonal na frente do tubo, fica verde quando acende.</li>
		<li>Clique no ícone do Citômetro FACSCelesta (um ícone de tecla de atalho), selecione Parâmetro e, em seguida, selecione Sinal FSC, SSC e PE . Clique no ícone de Planilha Global (um ícone de tecla de atalho) para estabelecer o histograma PE. Para o citómetro de fluxo utilizado neste estudo, utilizar PE para a anexina V a 586 nm e traçar uma plotagem no eixo X; PerCP-Cy5.5 para 7-AAD a 700 nm e plotagem no eixo Y.</li>
		<li>Insira a amostra de controle não corada primeiro no instrumento. Clique no ícone de Painel de Aquisição (um ícone de tecla de atalho), adquira um mínimo de 10.000 eventos da população desejada. Exclua detritos usando uma porta (P1) em um gráfico de pontos FSC-A e SSC-A. Ajuste a taxa de fluxo para velocidade média e registre dados. Ajuste a tensão para colocar a população de células na diagonal do histograma FSC/SSC e clique em Reiniciar. Ajuste a taxa de fluxo para velocidade média e registre dados.</li>
		<li>Clique em Próximo tubo, execute os controles de coloração simples da Anexina V e 7-AAD para ajustar a compensação. Execute os tubos restantes e colete dados.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Imagem SEM (Método 2)
<ol><li>Preparação de amostras experimentais<ol><li>Semeie e incube as células em placas de 6 poços de acordo com a etapa 2 e trate de acordo com a etapa 3.</li>
		<li>Após o tratamento, aspire todo o sobrenadante dos poços e lave 2x com PBS. Adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (não EDTA) a cada poço e incube na incubadora por 30 s.</li>
		<li>Adicione 1 mL de meio de cultura completo RPMI-1640 a cada poço para impedir o descolamento da célula e colete as células no tubo de 5 mL. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Fixe as células com 500 μL de fixador de microscópio eletrônico (dialdeído glutárico a 2,5%, sais de fósforo 100 mM) por 2 h à temperatura ambiente, seguido de durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare a solução de alúmen de cromo: Adicione 1,0 g de gelatina a 100 mL de água ultrapura, aquecimento em banho-maria a 70 ° C e mexa uniformemente. Adicione 0,05 g de alúmen de cromo, mexa uniformemente e filtre com papel de filtro. Mergulhe a lamínula limpa em solução de alúmen de crómio durante 2 h a 37 °C e seque-a num forno a 37 °C para utilização posterior. NOTA: O objetivo é evitar o descolamento celular durante o experimento.</li>
		<li>Colete as células da solução fixa. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente. Adicione 100 μL de PBS e sopre suavemente as células. Deixe cair a suspensão da célula na lamínula e deixe repousar por 5 min. Aspire todo o sobrenadante e lave 3x com PBS por 5 minutos de cada vez. NOTA: A operação deve ser realizada suavemente para evitar o descolamento da célula. Não agite vigorosamente, mova-se lentamente e adicione líquido lentamente ao longo da parede.</li>
		<li>Adicione 500 μL de fixação de ácido ósmico a 1% por 1 hora. Aspire todo o sobrenadante e lave 3x com PBS por 5 minutos de cada vez.</li>
		<li>Desidratar as amostras sucessivamente em uma série de concentrações de etanol (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) por 15 min por solução de EtOH. NOTA: Os vidros de cobertura podem ser mantidos em 100% EtOH por vários dias a 4 °C, mas devem secar o mais rápido possível para evitar desidratação excessiva.</li>
		<li>Ligue o secador de ponto crítico, abra o tanque de CO2 , resfrie a câmara a 10 °C. Embrulhe rapidamente a amostra com papel de filtro quando a pressão da câmara for de 0 psi e coloque-a na câmara.</li>
		<li>Abra a válvula de entrada, observe através da janela de observação de CO2 , aumente o nível de CO2 do líquido entre as duas linhas vermelhas (não exceda o limite superior), feche a válvula de entrada. Mergulhe a amostra por 10 min. Abra as válvulas de admissão e escape simultaneamente para equalizar o CO2 por 1 min (o COlíquido 2 desloca o EtOH). Feche a válvula de escape para elevar o nível de CO2 do líquido para a posição especificada, feche a válvula de admissão.</li>
		<li>Defina a temperatura para 35 °C e a pressão a 1250 psi. Assim que a temperatura e a pressão se estabilizarem, despressurize a 100 psi/min. Retire a amostra quando a pressão da câmara for zero e desligue o instrumento.</li>
		<li>Monte as amostras em suportes de amostras de alumínio SEM usando fita condutora. Empregue um revestidor de pulverização catódica para cobrir as amostras com uma camada (2-5 nm) de ouro.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagiologia<ol><li>Use SEM de emissão de campo frio de alta resolução para geração de imagens. Defina a tensão de aceleração do SEM para 3 kV. Defina a distância de trabalho para 10 mm. Defina a ampliação para 1.000x para observar o panorama. Defina a ampliação para 5.000x e 20.000x para localizar a membrana plasmática e obter a imagem da amostra. NOTA: O processo de visualização de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA via MEV é semelhante a outros tipos de células e tecidos e depende dos instrumentos utilizados. A referência14 fornece um protocolo SEM detalhado com vídeos de acompanhamento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Análise de mecanismos de morte celular desencadeados por LPS/ATP em células THP-1

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<li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+in+inflammatory+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer.</a> Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).</li>
<li>Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+and+the+cellular+consequences+of+gasdermin+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores.</a> Semin Immunol. 69, 101803(2023).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINJ1+mediates+plasma+membrane+rupture+during+lytic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death.</a> Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).</li>
<li>Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necroptosis-Oh+my%21+The+many+ways+a+cell+can+die%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die.</a> J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).</li>
<li>Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell-derived+exosomes%3A+messages+from+dying+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells.</a> Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).</li>
<li>Imre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+signalling+in+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Cell death signalling in virus infection.</a> Cell Signal. 76, 109772(2020).</li>
<li>Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL%3A+Functions+beyond+serving+as+the+Executioner+of+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis.</a> Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+macrophages+deal+with+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">How macrophages deal with death.</a> Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin+activates+the+coagulation+cascade+through+gasdermin+D-dependent+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure.</a> Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).</li>
<li>Gong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT-III+acts+downstream+of+MLKL+to+regulate+necroptotic+cell+death+and+its+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences.</a> Cell. 169 (2), 286-300 (2017).</li>
<li>Dong, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell+surface+expression+of+phosphatidylserine+in+ovarian+carcinoma+effusions+using+the+annexin-V%2F7-AAD+assay%3A+clinical+relevance+and+comparison+with+other+apoptosis+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters.</a> Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Electron+Microscopy+%28SEM%29%2C+JoVE+Science+Education+Database%2C+Analytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2024).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste manuscrito, dois métodos foram usados para detectar a morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. A dupla coloração com anexina V/7-AAD foi usada, e os resultados foram analisados por citometria de fluxo da coloração global. Tal como acontece com outras análises de citometria de fluxo, um grupo de células não coradas e dois grupos de células coradas simples foram configurados para excluir resultados falsos positivos e falsos negativos. Os resultados mostram que após a estimulação com LPS/ATP, várias células perderam a integridade da membrana, indicando que a morte celular pode ter ocorrido. Este método de detecção nos permite avaliar a morte celular de células inteiras. Vale ressaltar que a dupla coloração com Anexina V/7-AAD não é suficiente para distinguir entre piroptose, apoptose e necroptose. Nos estágios iniciais dessas três formas, o PS será exposto fora da membrana plasmática e a coloração com Anexina V é positiva. A integridade da membrana é perdida durante o estágio final dessas três formas, e os resultados da coloração mostram coloração duplamente positiva. Portanto, usamos o MEV para observar melhor as possíveis formas de morte celular que podem ocorrer.
Na apoptose, ocorre a formação de poros BAX / BAK na membrana externa mitocondrial, subsequente encolhimento celular e bolhas da membrana celular. A necroptose emprega MLKL para abrir os poros da membrana celular, enquanto o sinal de piroptose ativa a gasdermina para formar poros na membrana celular. Vale ressaltar que tanto a piroptose quanto a necroptose são acompanhadas por ruptura da membrana celular na fase final. No entanto, os poros da gasermina são muito maiores do que os poros da MLKL, portanto, os poros da gasdermina não têm seletividade iônica. As células necroptóticas exibem edema significativo na morfologia15. Em última análise, eles terminam em ruptura da membrana. Independentemente da via de sinalização a montante da ativação da permeabilidade da membrana celular, as alterações na membrana celular acompanham essas três formas de morte celular. Usamos o SEM para observar melhor a membrana celular, o que fornece uma maneira intuitiva de examinar a morte celular. Observamos as características da piroptose, incluindo bolhas de membrana e ruptura da membrana, e necroptose, incluindo inchaço celular e ruptura da membrana, consistentes com características estudadas por pesquisadores anteriores15. Observamos bolhas de membrana e encolhimento celular, consistentes com as características de apoptose estudadas por pesquisadores anteriores16.
Em estudos anteriores, a combinação de LPS e ATP foi frequentemente usada para induzir piroptose. Curiosamente, observamos características de apoptose e necroptose. Embora todas as três formas possam ocorrer na morte celular induzida por LPS / ATP, estudos anteriores mostraram que a piroptose continua sendo o modo dominante de morte. O LPS é um dos padrões moleculares associados a patógenos mais caracterizados. O ATP liberado pelas células moribundas tem uma alta concentração dentro da célula. O ATP extracelular é um dos padrões moleculares associados ao perigo17. LPS / ATP é um método clássico de estimulação em duas etapas para induzir a piroptose. A pesquisa mostrou que a adição de ATP às células estimuladas por LPS pode ativar rapidamente a caspase-118, enquanto o silenciamento do gene da caspase-1 pode reverter significativamente a morte celular induzida por LPS / ATP19. Em estudos anteriores, também encontramos ativação induzida por LPS / ATP de proteínas-alvo apoptóticas e necroptóticas20,21. Embora o LPS/ATP seja um indutor clássico de piroptose, ele também pode induzir apoptose e necroptose.
Na verdade, essas três formas geralmente não existem de forma independente e se interferem entre os estágios do sinal. Por exemplo, as proteínas gasdermina têm como alvo as mitocôndrias para promover a liberação do citocromo c para aumentar a via apoptótica mitocondrial22. A ativação da caspase-3 pode clivar a gasdermina E e, em seguida, desencadear a piroptose23. Um estudo sugere que a sinalização MLKL/PIPK3 está envolvida na ativação dos inflamassomas NLRP324. Essa conversa cruzada complexa levou ao conceito de PANoptose, definida como uma via inflamatória de morte celular programada regulada pelo complexo PANoptossomo com características-chave de piroptose, apoptose e / ou necroptose que não podem ser explicadas por nenhuma dessas vias de morte celular programada sozinha25. Como o conceito de PANoptose foi proposto, os cientistas descreveram a ocorrência de morte celular programada de forma mais abrangente, o que também destaca a complexidade da morte celular programada. Enquanto isso, isso também indica as limitações desse método de pesquisa. Embora a piroptose seja considerada dominante na morte celular induzida por LPS/ATP, não se pode determinar a proporção dessas formas de morte ou se todas elas existem, mesmo envolvendo outras formas de morte programada. Esta pode ser uma área a ser investigada no futuro.
Este protocolo é baseado na morte de macrófagos induzida por LPS e ATP. Descrevemos um método de teste do todo para o indivíduo, que também é aplicável a outros modelos e células. Os resultados indicam que as células podem ter sofrido piroptose, apoptose ou necroptose, que não se limita à piroptose, ajudando os pesquisadores a entender melhor a morte celular após a estimulação com LPS e ATP e escolher um método experimental melhor. Em estudos anteriores, a coloração dupla com Anexina V/7-AAD ou Anexina V/PI foi comumente usada para indicar a ocorrência de apoptose26,27, alguns pesquisadores também a utilizaram para estudar a apoptose28. Na verdade, não podemos distinguir entre os três tipos de morte celular por meio dessas duplas colorações. Este protocolo lembra aos pesquisadores, especialmente iniciantes, que a coloração dupla de Anexina V / 7-AAD ou Anexina V / PI não pode qualificar o tipo de morte celular. Ele só pode mostrar danos celulares e morte como um todo ou indicar que a célula pode ter sofrido alguma forma de morte. Em pesquisas mais direcionadas, é necessário introduzir um grupo de controle que iniba outras mortes para mostrar que a morte do programa está à mão. Da mesma forma, mais pesquisas mecanicistas investigarão os alvos críticos de diferentes mortes programadas.
Além disso, durante a preparação do experimento, descobrimos que atualmente existem muitos procedimentos experimentais detalhados para MEV de células aderentes, com pouca descrição de células suspensas. Aqui, fornecemos uma descrição mais detalhada do método de preparação de amostras para células suspensas. A etapa 5.5 é uma etapa necessária para auxiliar na imobilização de células suspensas em lâminas de células. As operações subsequentes devem ser realizadas suavemente para evitar o descolamento da célula. Além da solução de alúmen de cromo, a poli-L-lisina também pode imobilizar as células.

A morte celular é um processo fisiológico fundamental em todos os organismos vivos. Nos últimos anos, estudos substanciais mostraram que a morte celular está envolvida na imunidade e no equilíbrio dentro do organismo. Estudar a morte celular nos ajuda a entender melhor o início e o desenvolvimento de doenças. Várias formas de morte celular programada foram descritas, e alguns alvos-chave nesses processos foram identificados. Piroxase, apoptose e necroptose são as três vias de morte celular programada geneticamente definidas envolvidas no equilíbrio interno e na doença1.
A piroptose é caracterizada pela formação de poros de membrana e pela liberação de conteúdo celular. Caspases ou granzimas ativadas clivam gasderminas para separar seus domínios N-terminais, que então oligomerizam, ligam-se à membrana e formam poros 2,3,4. O poro da gasdermina fornece um canal de secreção atípico através das membranas celulares, resultando em respostas celulares a jusante, incluindo liberação de conteúdo e influxo de íons 2,3,4. Em última análise, as células eventualmente experimentam ruptura da membrana plasmática e lise piroptótica facilitada pela ninjurina-15. Na apoptose, Bax e Bak ativados formam oligômeros na membrana externa mitocondrial e liberam o citocromo C, que é regulado por um equilíbrio entre proteínas pró-apoptóticas e antiapoptóticas da família BCL-2, caspases iniciadoras (caspase-8, -9 e -10) e caspases efetoras (caspase-3, -6 e -7)1,6,7. As alterações morfológicas da apoptose incluem bolhas de membrana, encolhimento celular, fragmentação nuclear, condensação da cromatina e formação de corpos apoptóticos 6,8. A serina/treonina-proteína quinase 1 (RIPK3) que interage com o receptor e a quinase de linhagem mista semelhante ao domínio (MLKL) são dois componentes centrais a jusante do mecanismo necroptótico1. RIPK3 recruta e fosforila MLKL, p-MLKL oligomeriza, associa-se à membrana celular, inicia perfurações de membrana, causa influxo de íons, aumenta a osmolaridade intracelular e, eventualmente, a ruptura celular 6,9. Gasderminas e MLKL ligam-se à membrana plasmática e medeiam piroptose e necroptose, respectivamente, enquanto BAX/BAK medeia a apoptose ligando-se à membrana externa das mitocôndrias6.
Embora cada via tenha mecanismos e resultados específicos, eles levam a alterações semelhantes na membrana celular. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina (PS) está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, o PS será exposto, fora da membrana plasmática. A caspase-3/caspase-7 ativa as famílias TMEM16 e XKR, o que leva a uma membrana celular assimétrica e externaliza o PS durante a apoptose10. O influxo de Ca2+ mediado por Gasdermin D e MLKL leva à perda da simetria da bicamada fosfolipídica na membrana celular e à exposição do PS. A exposição ocorre antes da perda da integridade da membrana celular 11,12. Com base nas alterações semelhantes na membrana desses três tipos de morte celular programada, usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V / 7-Aminoactinomicina D (7-AAD) para detectar a morte celular. A anexina V, uma proteína de ligação a fosfolipídios dependente de cálcio, tem alta afinidade pelo PS, que pode servir como uma sonda sensível para detectar o PS exposto na superfície da membrana plasmática13. 7-AAD é uma mancha de ácido nucleico que não pode passar por toda a membrana celular. É semelhante ao iodeto de propídio (PI), um corante de ácido nucleico comumente usado. Eles têm características de fluorescência semelhantes, mas o 7-AAD tem um espectro de emissão mais estreito e menos interferência com outros canais de detecção. Devido a essas semelhanças, não é suficiente distinguir entre piroptose, apoptose e necroptose. Usamos citometria de fluxo para detectar a morte celular de células inteiras. Um segundo método é usado para capturar a membrana celular usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) para observar as possíveis formas de morte celular em células individuais.
Estabelecemos um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófagos de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. Este protocolo se concentra em observar a morte celular em vez de investigar mecanismos.

<table><tbody><tr><td>Solução de enzima pancreática a 0,25% (excluindo EDTA)</td> <td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td><td>PYG0068</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno de 5 mL</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 5 mL</td><td>Labgic Technology Co., Ltd. </td><td>Placa de 6 poços BS-50-M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>220100</td><td></td></tr><tr><td>Kit de análise de apoptose de anexina V-PE / 7-AAD</td><td>Absin (Shanghai) Tecnologia Biológica co.ltd</td><td>abs50007</td><td>Anexina V-PE, 7-AAD, 5 e vezes; Tampão de ligação, solução de controle positivo de apoptose</td></tr><tr><td>incubadora de CO2</td><td>Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.</td>Prato de cultura de células <td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>, 100 mm</td><td>Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>230301</td><td></td></tr><tr><td>Celômetro K2 Contador de células fluorescentes</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Celômetro K2</td><td></td></tr><tr><td>Celómetro SD100 Câmaras de contagem</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Máquina centrífuga</td><td>Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd</td><td>L530</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Alum </td><td>Guangdong Wengjiang Reagente Químico Co., Ltd.</td><td></td><td></td>PA04354</tr><tr><td>vidros de cobertura, 9 mm</td><td>Labgic Technology Co., Ltd. </td>Secador de ponto crítico <td>BS-09-RC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Quorum Technologies</td><td>K850</td><td></td></tr><tr><td>dimetil sulfóxido BOSTER</td><td>Biological Technology co.ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>fixador de microscópio eletrônico</td><td>Servicebio Technology co.ltd </td><td>G1102</td><td>2,5% dialdeído glutárico, 100 mM sais de fósforo</td></tr> balança <tr><td>eletrônica</td><td>SHIMADZU</td><td>ATX124</td><td></td></tr><tr><td>etanol absoluto</td><td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd</td><td>citômetro de fluxo 2021033102</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Becton,Dickinson and Company</td><td>FACSCanto <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/66831/66831eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td></td></tr><tr><td>software de análise de citometria de fluxo</td><td>Becton,Dickinson and Company</td><td>BD FACSDivaTM Software</td><td></td></tr><tr><td>gelatina</td><td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>PA00256 </td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo frio de alta resolução</td><td>TITACHI</td><td>Regulus 8100</td><td></td></tr><tr><td>linha celular monocítica humana THP-1</td><td>Procell Life Science&amp; Tecnologia Co., Ltd.</td><td>CL0233</td><td></td></tr><tr><td>microscópio invertido </td><td>Leica Microsystems Co., Ltd</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de Vórtice IR</td><td>VELP Scientifica Srl</td><td>ZX4</td><td></td></tr><tr><td>lipopolissacarídeo </td><td>Pequim Solarbio Ciência &amp; Technology Co.,Ltd. </td><td>L8880</td><td>LPS é derivado de Escherichia coli 055: B5</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Beijing Solarbio Science &amp; Technology Co.,Ltd. </td><td>A8270</td><td></td></tr><tr><td>forbol-12-miristato-13-acetato </td><td>Pequim Solarbio Ciência &amp; Technology Co.,Ltd. </td><td>P6741</td><td></td></tr> solução <tr><td>salina tamponada com fosfato</td><td>Servicebio Technology co.ltd </td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf AG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ponteiras de pipeta, 10 μ L</td><td>Servicebio Technology co.ltd </td><td>Ponteiras de pipeta T-10PL</td><td></td></tr><tr><td>, 1 mL </td><td>Servicebio Technology co.ltd </td><td>Ponteiras de pipeta T-1250L</td><td></td></tr><tr><td>, 200 μ L</td><td>Servicebio Technology co.ltd </td><td>T-200L</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 meios de cultura completos</td><td>Procell Life Science&amp; Tecnologia Co., Ltd.</td><td>CM0233</td><td>RPMI-1640 + 10% FBS + 0,05mM β-mercaptoetanol + 1% P/S</td></tr><tr><td>RPMI-1640 meios de cultura </td><td>Xangai BasalMedia  Tecnologias Co., LTD.</td><td></td><td></td>K211104</tr><tr><td>revestidor de pulverização catódica</td> BECKMAN COULTER 8546733 <td></td><td></td> Cressington Scientific Instruments Ltd 108 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> banho-maria termostático GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>HH-1</td><td></td></tr></tbody></table>

morte induzida por lps e atp de macrófagos thp-1 diferenciados por pma e sua validação

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

A morte celular é um processo fundamental em todos os organismos vivos. O protocolo estabelece um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófago de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. O LPS combinado com ATP é um método clássico de indução inflamatória, frequentemente usado para estudar a piroptose, mas a apoptose e a necroptose também respondem à estimulação por LPS/ATP. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, a membrana celular permanece intacta e exposta à fosfatidilserina e, nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade. Aqui, a citometria de fluxo foi usada para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-Aminoactinomicina D (AAD) para detectar a morte celular de células inteiras. Os resultados mostram que células substanciais morreram após estimulação com LPS / ATP. Usando microscopia eletrônica de varredura, observamos as possíveis formas de morte celular em células individuais. Os resultados indicam que as células podem sofrer piroptose, apoptose ou necroptose após estimulação com LPS/ATP. Este protocolo tem como foco observar a morte de macrófagos após estimulação com LPS/ATP. Os resultados mostraram que a morte celular após a estimulação de LPS e ATP não se limita à piroptose e que a apoptose e a apoptose necrótica também podem ocorrer, ajudando os pesquisadores a entender melhor a morte celular após a estimulação de LPS e ATP e escolher um método experimental melhor.

As amostras de células foram tratadas conforme descrito no protocolo e a detecção por citometria de fluxo foi feita. As células normais não podem ser coradas com Anexina V e 7-AAD (Anexina V-/7-AAD-). Nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, o PS foi exposto e ligado à anexina V, mas a membrana celular ainda estava intacta e excluiu o 7-AAD do espaço extracelular (anexina V + / 7-AAD-). Nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade, as células são coradas simultaneamente pela Anexina V e 7-AAD, apresentando resultados duplamente positivos (Anexina V+/7-AAD+). As células necróticas foram coradas apenas com 7-AAD (Anexina V-/7-AAD+). A Figura 1 mostra que após a estimulação com LPS/ATP, as células da região Q2 aumentaram significativamente, indicando morte celular.
Usamos MEV para capturar a superfície da membrana plasmática, observando diretamente as características da membrana de uma única célula. A Figura 2A mostra as células de controle, a Figura 2B-D mostra as células após a estimulação com LPS / ATP. Observamos células com características de piroptose, incluindo sangramento de membrana e ruptura de membrana (Figura 2B), células com características apoptóticas, incluindo sangramento de membrana e encolhimento celular (Figura 2C), e células com características de necroptose, incluindo inchaço celular e ruptura de membrana (Figura 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66831/66831fig01.jpg"> Figura 1: Detecção de coloração dupla de Anexina V / 7-AAD usando citometria de fluxo. (A) Coloração negativa de Anexina V e negativa de 7-AAD (Q4), coloração dupla positiva de Anexina V e negativa de 7-AAD (Q3), coloração positiva de Anexina V e 7-AAD positiva (Q2) e coloração negativa de Anexina V e 7-AAD positiva (Q1). (B) Dados quantitativos para (A). Os dados são apresentados como média ± DP (n=3), teste t não pareado, **p &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66831/66831fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66831/66831fig02.jpg"> Figura 2: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. (A) Grupo controle, ampliação de 5.000x/20.000x. (B, C, D) O grupo LPS/ATP mostra sangramento de membrana, ruptura de membrana (↑), inchaço celular (↑) e encolhimento celular (↑) com aumento de 5.000x/20.000x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66831/66831fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.

Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

Estamos abordando mortes introduzidas por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. As mortes introduzidas por LPS e ATP não se limitam à prioptose, mas também podem ocorrer apoptose e necroptose. Isso ajudará a entender melhor a morte celular após a estimulação de LPS e ATP e a escolher métodos experimentais mais adequados.A tecnologia Cryo-EM estuda muitas outras estruturas em tecidos, células e microorganismos. O Cryo-EM fornece dados de estrutura neonativa para diversos complexos moleculares. Por exemplo, o uso de técnicas Cryo-Em para realizar a reconstrução 3D pode nos ajudar a entender melhor as características das peças apoptóticas e necroptóticas.Embora a pryoptose seja considerada dominante na morte celular introduzida por LPS e ATP, não se pode determinar a apropriação dessas formas de morte ou se todas elas existem. Validar a morte celular diversa e medi-la será nossa área de investigação no futuro.

lps-atp-induced-death-pma-differentiated-thp-1-macrophages-its

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de eferocitose para estudar a depuração de células apoptóticas usando microscopia confocal. A eferocitose é um processo de várias etapas em que as células apoptóticas são engolidas por fagócitos e degradadas dentro de vesículas chamadas eferrossomos. Este protocolo fornece um método para visualizar porções internalizadas e não internalizadas de células apoptóticas individuais e quantificar a eferocitose.

Ensaio de Eferocitose de Células Fixas: Um Método para Estudar a Captação Eferocítica de Células Apoptóticas por Macrófagos Usando Microscopia de Fluorescência

Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Este protocolo apresenta um método eficaz e fiável para transfectar humanos THP-1, macrófagos com siRNA ou de ADN de plasmídeo por electroporação com alta eficiência de transfecção elevada, mantendo a vitalidade celular e capacidade total de diferenciação de macrófagos e de polarização.

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Micropartículas verter à membrana celular (MPs) são vesículas biológicas activas que podem ser isolados e os seus efeitos patofisiológicos investigados em vários modelos. Descrevemos aqui um método para a geração de MPs derivadas de linfócitos T (LMPS) e para demonstrar o seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias respiratórias.

Geração de Lymphocytic micropartículas e Detecção de seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas

Aqui, nós descrevemos a purificação de Legionella pneumophila (L. pneumophila) vesículas de membrana externa (OMVs) a partir de culturas líquidas. Estas vesículas purificados são então usados ​​para o tratamento de macrófagos para analisar o seu potencial pro-inflamatória.

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

A sinalização do receptor Toll-like (TLR) desempenha um papel importante na fisiopatologia de muitas doenças inflamatórias humanas, e a regulação das respostas de TLR por nanopartículas bioativas é antecipada para ser benéfica em muitas condições inflamatórias. As células repórter baseadas em células THP-1 fornecem uma plataforma de triagem versátil e robusta para identificar novos inibidores da sinalização TLR.

Screening Nanopartículas Bioativas em Células Imunológicas Fagocíticas para Inibidores da Sinalização do Receptor de Toll-like

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Este protocolo fornece aos pesquisadores um método rápido e indireto de medição de atividade de fator de transcrição NF-кB/AP-1 dependente de TLR em uma linha de células de macrófagos de urina em resposta a uma variedade de superfícies poliméricas e camadas de proteína adsorbed que modelam o microambiente de implante biomaterial.

Um ensaio celular do repórter do macrófago para examinar a sinalização nf-kB/AP-1 mediada pelo receptor em macrófagos em camadas de proteína adsorbed em superfícies poliméricas

Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.

Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

Este protocolo descreve um método abrangente para avaliar a ativação da caspase (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 e caspase-11) em resposta a modelos in vitro e in vivo (em camundongos) de infecção, insultos estéreis e câncer para determinar o início de vias de morte celular, como piroptose, apoptose, necroptose e PANoptose.

Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

Usando um modelo explantado ex vivo , pequenos pedaços da porção rostral do tecido adiposo branco visceral de camundongos magros são cultivados por 7 a 10 dias, permitindo a indução e o estudo da inflamação do tecido adiposo conforme ocorre durante a alimentação rica em gordura.

Um modelo de camundongo ex vivo para inflamação do tecido adiposo com dieta rica em gordura

Aprenda a induzir morte celular em macrófagos THP-1 diferenciados com PMA usando LPS e ATP. Este método combina citometria de fluxo e microscopia eletrônica para analisar piroptose, apoptose e necroptose em respostas inflamatórias.

Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

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