Name: Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Explore um modelo murino transgênico tricolor para estudar lesões na placa de crescimento óssea. Este método permite mapear respostas celulares em tempo real e testar novas terapias para regeneração cartilaginosa.

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Este trabalho foi apoiado por uma doação dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele (NIAMS) 1R21AR079153 e uma bolsa do Programa de Aprimoramento de Pesquisa (REP) da Universidade de Connecticut. Os autores gostariam de agradecer a assistência de Renata Rydzik, da instalação do MicroCT Imaging Core da Universidade de Connecticut.

Estudo preciso de lesão da placa de crescimento usando camundongos fluorescentes de trilinhagem

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<li>Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+responses+and+repair+mechanisms+of+the+injured+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Injury responses and repair mechanisms of the injured growth plate.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3 (1), 117-125 (2011).</li>
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<li>Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+effect+of+bone+marrow-derived+stem+cell+implantation+after+epiphyseal+plate+injury+is+abrogated+by+chondrogenic+predifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation.</a> Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).</li>
<li>Mccarty, R. C., Xian, C. J., Gronthos, S., Zannettino, A. C., Foster, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+autologous+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+an+ovine+model+of+growth+plate+cartilage+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Orthop+J%22%5BJournal%5D)">Application of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells to an ovine model of growth plate cartilage injury.</a> Open Orthop J. 4, 204-210 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+mandibular+condylar+cartilage+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine mandibular condylar cartilage cell populations.</a> Cells Tissues Organs. 195 (3), 232-243 (2012).</li>
<li>Clearfield, D. S., Xin, X., Yadav, S., Rowe, D. W., Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+differentiation+of+fluorescent+multireporter+cells+on+zonally-organized+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteochondral differentiation of fluorescent multireporter cells on zonally-organized biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 25 (5-6), 468-486 (2019).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
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<li>Maye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+col10a1-mcherry+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of col10a1-mcherry reporter mice.</a> Genesis. 49 (5), 410-418 (2011).</li>
<li>Chokalingam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+effects+of+compression+and+time+in+culture+on+aggregate+modulus+and+on+gene+expression+and+protein+content+of+collagen+type+ii+in+murine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro effects of compression and time in culture on aggregate modulus and on gene expression and protein content of collagen type ii in murine chondrocytes.</a> Tissue Eng Part A. 15 (10), 2807-2816 (2009).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O uso inovador de camundongos repórteres de colágeno tricolor permite a criação de defeitos da placa de crescimento com tamanho e localização predeterminados, aumentando significativamente a precisão dos modelos experimentais murinos para lesões da placa de crescimento. Dado o pequeno tamanho dos camundongos de 2 semanas, é fundamental usar uma pequena broca de 0,5 mm para criar a lesão para evitar enfraquecer o membro e causar uma fratura de espessura total. O cirurgião também deve aplicar pressão suficiente ao criar o defeito para evitar perfurar muito profundamente o osso pelo mesmo motivo. O uso da periossonda é fundamental para confirmar uma profundidade de lesão consistente.
Como em qualquer cirurgia, é importante confirmar uma profundidade adequada de anestesia, confirmada por um beliscão ocasional do dedo do pé e a esterilidade é mantida durante todo o tempo. Outro ponto cirúrgico importante é que a dissecção romba com um escultor foi descrita porque evita danos aos tecidos moles e ajuda a garantir que os camundongos sejam capazes de deambular imediatamente após a recuperação da anestesia para alcançar a mãe camundongo para nutrição e conforto. Em nossa experiência, as feridas fechadas com suturas permaneceram fechadas com sucesso e os clipes de ferida não são necessários. A cirurgia em camundongos com 2 semanas de idade é recomendada para melhor imitar a criança pequena que sofre fraturas da placa de crescimento. Uma desvantagem desse protocolo é que, dada a natureza imprevisível do parto, o uso desse modelo de camundongo requer a disponibilidade do cirurgião em curto prazo.
Em relação ao posicionamento da broca para criar o defeito, o protocolo descreve a criação da lesão usando um conjunto de filtros vermelhos mCherry / Texas que ilumina a zona hipertrófica dentro da placa de crescimento devido ao brilho da fluorescência do colágeno X. Para garantir que a lesão seja criada dentro da placa de crescimento tibial, é benéfico mover levemente a abertura do tecido mole para a esquerda e para a direita para confirmar que a placa de crescimento tibial proximal está à vista, e não o fêmur. Alternar entre os canais do conjunto de filtros para iluminar a zona proliferativa de condrócitos ou as seções ósseas adjacentes é útil para confirmar o posicionamento preciso em relação à localização da zona proliferativa e das seções ósseas adjacentes.
Embora a zona proliferativa de condrócitos e o osso epifisário e metafisário possam ser distinguidos à microscopia de fluorescência nos camundongos vivos, o valor real dos repórteres de colágeno Tipo II e Tipo I é percebido durante a análise histológica da placa de crescimento. Dada a natureza aquosa dos processos crio-histológicos, os protocolos tradicionais de precipitação de corantes cromogênicos são inadequados devido ao potencial desalinhamento da cor com a imagem fluorescente causada por etapas de desidratação. Embora o protocolo aquoso produza padrões de coloração semelhantes aos das seções de parafina, a imagem pós-coloração rápida é essencial para evitar a difusão do corante do tecido. A utilização de 30% de glicerol em água destilada como meio de montagem pode desacelerar essa difusão, permitindo várias colorações cromogênicas na mesma seção, incluindo cartilagem com Safranin O/Fast Green.
O processo de ossificação endocondral é claramente visível com condrócitos vermelhos revestindo a ponte óssea em evolução (Figura 6). O uso adicional de técnicas de imuno-histoquímica, para as quais existem muitos anticorpos murinos disponíveis, pode melhorar ainda mais os estudos mecanísticos conduzidos nesses camundongos transgênicos. Ao todo, a combinação de faxitron, microCT e técnicas de imagem crio-histológica neste modelo de camundongo transgênico oferece uma compreensão abrangente das alterações macroscópicas e microscópicas que ocorrem em resposta a lesões na placa de crescimento, abrindo caminho para futuras intervenções terapêuticas para mitigar tais resultados adversos. Outras manipulações genéticas desses camundongos transgênicos podem ser feitas para permitir que estudos de rastreamento de linhagem entendam a origem das células que estão temporal e espacialmente envolvidas na cura. A experimentação em camundongos com modificações adicionais permitiria o estudo de doenças da cartilagem, como o osteocondroma - um crescimento excessivo de cartilagem e osso perto da placa de crescimento.
A consistência do nosso modelo é demonstrada pela formação reprodutível de pontes ósseas em todos os camundongos sem a necessidade de descartar nenhum camundongo do grupo devido à lesão da cartilagem articular. Esta é uma melhoria em relação aos modelos anteriores que se aproximavam da placa de crescimento a partir de uma janela cortical abaixo da placa de crescimento e inclinavam uma ferramenta afiada ou broca para cima em direção à placa de crescimento e, ocasionalmente, ultrapassavam a cartilagem articular. Uma lesão adicional da cartilagem articular não imita as lesões comuns da placa de crescimento em crianças. A lesão mais precisa desse modelo animal reduz o número de camundongos necessários por experimento e essa é outra melhoria. O uso de camundongos transgênicos permite que o pesquisador concentre a lesão em subseções da placa de crescimento, como a área hipertrófica/provisoriamente calcificada ou a epífise/zona de repouso/zona proliferativa, sem afetar a cartilagem articular. No entanto, uma limitação desse modelo é a variabilidade no volume da ponte óssea, que pode diferir em até 30% entre os animais lesionados. Consequentemente, a detecção de um efeito clinicamente significativo na formação de pontes ósseas ainda requer um grande número de animais para atingir relevância estatística.
Os benefícios para um modelo de camundongo, conforme descrito aqui, em comparação com os modelos de lesão da placa de crescimento de ratos ou coelhos publicados anteriormente 7,9,10,14, incluem um número menor de animais usados, redução de custos, um tamanho de replicação eficiente devido à formação de barras ósseas reprodutíveis, um período de estudo mais curto e colocação de lesão mais precisa devido à imagem ao vivo dos camundongos transgênicos triplos. Embora não seja discutido em detalhes, este modelo de camundongo pode ser usado para testar implantes de engenharia de tecidos ou biomateriais que fornecem fatores de crescimento. Uma limitação notável desse método murino é que o tamanho de um implante usado para administrar drogas ou células terapêuticas é limitado ao volume do defeito de aproximadamente uma esfera de 0,5 mm de diâmetro. Somente modelos animais maiores podem acomodar o volume de material de teste que seria usado em pacientes humanos. O defeito da broca criado neste protocolo não tem a mesma geometria de uma fratura fina e, portanto, difere das lesões humanas reais. No entanto, os benefícios deste modelo de camundongo são muitos, e a abordagem lateral evita danos à cartilagem articular que ocorreriam ao se aproximar cegamente acima ou abaixo da placa de crescimento alinhada com o eixo longo da tíbia. Essa metodologia representa um salto substancial na pesquisa de lesões em placas de crescimento, fornecendo um método detalhado e reprodutível para investigar patologias e avaliar novas estratégias terapêuticas.

As placas de crescimento ósseo desempenham um papel fundamental no crescimento longitudinal dos ossos longos durante a infância e a adolescência1. Situada nas extremidades dos ossos longos, a placa de crescimento compreende múltiplas zonas, sendo os condrócitos os principais componentes celulares responsáveis pela produção e manutenção dessa área de crescimento dinâmico. A ossificação endocondral da placa de crescimento ocorre para alongar e expandir os ossos por meio de uma progressão sequencial da proliferação de condrócitos, hipertrofia, apoptose, invasão por vasos sanguíneos, recrutamento de células osteoprogenitoras e, finalmente, formação óssea2. Como a placa de crescimento é relativamente mais macia que o osso, é altamente suscetível a fraturas quando os ossos são sobrecarregados durante esportes ou outras atividades. A classificação de Salter-Harris descreve cinco tipos distintos de lesões da placa de crescimento3. A fratura do tipo II através da zona hipertrófica da placa de crescimento e do tecido ósseo inferior adjacente é a mais prevalente4. Uma ponte óssea geralmente se forma em resposta a lesões da zona hipertrófica ou do osso adjacente e leva à fusão prematura das seções de ossos longos adjacentes5. As pontes ósseas impedem a expansão normal da placa de crescimento. Atualmente, não há tratamentos preventivos disponíveis para a formação da ponte óssea, e alguns não são tratados, dependendo da idade do paciente e do tamanho e localização da ponte óssea6. Quando a malformação do membro é grave, as opções cirúrgicas incluem a remoção seguida de implantação de materiais interposicionais como gordura ou borracha de silicone ou osteotomia corretiva e procedimentos de alongamento ósseo; no entanto, uma ponte óssea ainda pode se reformar6. Mais pesquisas são necessárias para prevenir a formação de pontes ósseas e melhorar os resultados de crianças com lesões na placa de crescimento ósseo.
Vários modelos animais foram estabelecidos para explorar os mecanismos subjacentes e desenvolver novas estratégias para prevenir o comprometimento da ponte óssea das placas de crescimento após a lesão 7,8,9,10,11,12. Esses modelos animais frequentemente se concentram na placa de crescimento tibial proximal e na placa de crescimento do fêmur distal como o local primário da lesão, uma vez que é normalmente onde ocorrem as lesões humanas. Os defeitos ósseos do animal são criados por uma abordagem lateral semelhante a uma via de fratura real ou uma abordagem de cima ou de baixo da placa de crescimento que leva a um orifício central na placa de crescimento. Em um modelo de rato relatado anteriormente, um defeito da placa de crescimento é criado inserindo uma broca dentária através de uma janela cortical na diáfise média da tíbia e perfurando para cima através da medula em direção à articulação do joelho para ferir centralmente a placa de crescimento 7,13. Alternativamente, um modelo de camundongo recente usa uma abordagem lateral com uma agulha de pequeno calibre para criar uma trilha de agulha plana através da placa de crescimento8. Em um modelo de rato amplamente utilizado, o defeito é criado na placa de crescimento do fêmur distal por meio da perfuração da cartilagem articular entre os côndilos9,14. Em animais maiores, como coelhos e ovelhas, os defeitos da placa de crescimento foram induzidos lateralmente diretamente na tíbia proximal e no fêmur distal por perfuração ou corte na placa de crescimento ou aproximando-se por baixo e criando um defeito central deixando as bordas da placa de crescimento inalteradas 10,11,12,15.
Modelos murinos para lesões em placas de crescimento são vantajosos para estudos mecanísticos que podem ser realizados com camundongos geneticamente modificados, como estudos de rastreamento de linhagem de células-tronco8. No entanto, um desafio significativo em modelos animais murinos ou de ratos é obter lesões consistentes e precisas em uma sub-região específica da placa de crescimento. A lesão de zonas específicas da placa de crescimento e do osso adjacente é necessária para mimetizar um dos caminhos de fratura clinicamente relevantes descritos pelas classificações de Salter-Harris. Os desafios até o momento em modelos de roedores são principalmente devidos à falta de um meio visual de identificar o substrato da placa de crescimento durante a criação cirúrgica da lesão. Este protocolo descreve uma técnica refinada para criar defeitos na placa de crescimento em substratos direcionados da placa de crescimento murina, utilizando camundongos transgênicos triplos que expressam repórteres fluorescentes de colágeno I, II e X 16,17,18. A fluorescência de cores diferentes desses colágenos em cada uma das zonas primárias da placa de crescimento permite a discriminação visual das várias seções da placa de crescimento sob um microscópio estéreo de fluorescência durante a criação cirúrgica da lesão da placa de crescimento. O uso desses camundongos transgênicos permite uma precisão de lesão sem precedentes em um camundongo jovem em um estágio de desenvolvimento comparável ao das crianças feridas.

<table><tbody><tr><td>2-metil-butano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas anti-sépticas de álcool</td><td>Acme United Corporation</td><td>H305-200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Software AxioVision</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de Betadine (10% de iodopovidona)</td> <td>Avrio Health LP</td><td>67618-150-01</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td></td></tr><tr><td>CFP conjunto de filtros</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td></td></tr><tr><td>Cryotape</td><td>Section Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Curvo fino tesoura&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça hemostática de mosquito curvo</td><td>HuFriedyGroup</td><td>H3</td><td></td></tr><tr><td>cy5 conjunto de filtros</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>Broca dentária (0,5 mm de diâmetro)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escultor discóide cleóide dental</td><td>ACE Surgical Supply Inc.</td><td>6200097A-EA</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas de vidro seco (Inotech Steri 350)</td><td>Inotech Bioscience, LLC</td><td>IS-250</td><td></td></tr><tr><td>Perfurador de orelha</td><td>Fine Science Tools</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>Almofada</td><td></td><td></td><td></td>de aquecimento elétrico</tr><tr><td>Controle eletrônico de pé</td><td>Nouvag AG</td><td>1866nou</td><td></td></tr><tr><td>Motores eletrônicos 31 ESS</td><td>Nouvag AG</td><td>2063nou</td><td></td></tr><tr><td>Barreira de superfície ambiental (tubo de 3 x 12 polegadas)</td><td>Patterson Companies, Inc.</td><td>BB-0312H</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR (suspensão injetável de liberação prolongada de buprenorfina) 1,3 mg/mL</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>86084-100-30</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de raios-x Faxitron</td><td>Kubtech</td><td>Scientific Parameter</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescência Estereomicroscópio</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>GFP conjunto de filtros</td><td>Chroma Corporação de Tecnologia.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio de vidro</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Graefe fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Peça de mão (contra ângulo 32: 1 botão de pressão)</td> <td>Nouvag AG</td><td>5201</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de controle do sistema de implantodontia/cirurgia oral (Straumann)</td><td>Nouvag AG</td><td>SEM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de esterilização de selagem instantânea com indicadores de processo internos/externos duplos (3 1/2 x 5 1/4&nbsp; polegada)</td>Bolsa de esterilização de selagem instantânea <td>Fisher Scientific</td><td>01-812-50</td><td></td></tr><tr><td>com indicadores de processo interno/externo duplos (5 4/1 x 10 polegadas)</td>Seringa de insulina <td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>(29 G)</td><td>Exel International</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano& nbsp;</td><td>Dechra Pharmaceuticals plc</td><td>17033-091-25</td><td></td></tr><tr>Sistema <td></td><td></td><td></td><td>anestésico de isoflurano</td></tr><tr><td>mCherry conjunto de filtros</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>39010</td><td></td></tr><tr><td>Micro-dissecando scissor</td><td>ferramentas da ciência fina</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Agulha (20 G)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>suporte da agulha</td><td>HuFriedyGroup</td><td>NHCW</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra (10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes aplicadores não estéreis</td><td>Allegro Industries</td><td>205</td><td></td></tr><tr><td>Gaze não tecida (3 x 3 polegadas)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>22028560</td><td></td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td>Norland Optical</td><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica (lubrificante ocular Optixcare)</td> <td>CLC Medica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Sonda periodontal</td><td>HuFriedyGroup</td><td>PQW</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate tamponado com solução salina (PBS) pH 7.4 (1x)</td><td>Gibco, por Life Technologies</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de plástico</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>71890-01</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura/aparador profissional (Wahl Classic Peanut)</td><td>Wahl Clipper Corporation</td><td>8685</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>62800-46</td><td></td></tr><tr><td>Scanco Software médico</td><td>SCANCO Medical</td><td>Scanco &mu; CT 50</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Nitrito de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td></td></tr><tr><td>Tartarato de sódio dibásico di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td></td></tr><tr><td>Disco de espécime</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica de aço inoxidável #15&nbsp;</td><td>Produtos Cirúrgicos Aspen, Inc.</td><td></td><td></td>371615</tr><tr><td>Luvas cirúrgicas estéreis</td><td>Cardinal Health, Inc.</td><td>2D72PT65X</td><td></td></tr><tr><td>Campo de toalha estéril (18 x 26 polegadas)</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Seringa (1 mL)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de vicryl revestida trançada não tingida (5-0)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>J490G</td><td></td></tr><tr><td>Luz negra UV</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo murino transgênico tricolor para estudo de lesão em placa de crescimento

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

As placas de crescimento da cartilagem nos ossos das crianças permitem o alongamento dos membros, mas são fracas em relação ao osso, tornando-as propensas a fraturas quando os ossos estão sobrecarregados. Melhores tratamentos para placas de crescimento gravemente fraturadas são necessários porque a resposta à lesão é uma ponte óssea que funde prematuramente a placa de crescimento, levando a membros atrofiados e / ou tortos. Modelos murinos de lesão da placa de crescimento são vantajosos para estudos mecanicistas, mas são desafiadores porque é difícil visualizar e ferir com precisão as pequenas placas de crescimento em camundongos jovens. Descrevemos aqui um modelo aprimorado de lesão da placa de crescimento usando camundongos transgênicos com repórteres fluorescentes de tri-linhagem para colágeno tipos I, II e X.
Esses camundongos apresentam fluorescência nativa associada aos três substratos primários da placa de crescimento. Uma lesão da placa de crescimento semelhante a uma lesão de Salter-Harris Tipo II é criada de forma reprodutível com uma broca usando a seção hipertrófica da placa de crescimento como referência durante a imagem ao vivo sob orientação de microscopia estéreo de fluorescência. A análise histológica congelada da fluorescência nativa simplifica a avaliação da resposta celular à lesão. Essa metodologia representa um salto substancial na pesquisa de lesões em placas de crescimento, fornecendo um método detalhado e reprodutível para investigar patologias e avaliar novas estratégias terapêuticas.

Este protocolo utiliza camundongos repórteres fluorescentes de trilinhagem para induzir um defeito lateral da placa de crescimento na tíbia proximal com precisão, aproveitando a fluorescência vermelha inerente emitida pelo colágeno tipo X para orientação cirúrgica. A visão que o cirurgião tem ao olhar através da ocular do estereomicroscópio com o conjunto de filtros mCherry é mostrada na Figura 2D. A fluorescência nativa do Tipo X permite que o cirurgião coloque a broca na zona hipertrófica e crie uma lesão que imita um tipo comum de lesão da placa de crescimento que leva a uma ponte óssea (Figura 2F). A fluorescência sob o canal vermelho é a mais brilhante e, portanto, recomendada para uso durante a colocação da broca. Alternativamente, a criação de defeitos pode ser guiada pelo uso de outras cores da fluorescência nativa dos camundongos triplos transgênicos se o objetivo do experimento for estudar lesões em outras zonas da placa de crescimento além da zona hipertrófica e região calcificada adjacente.
A criação de um defeito semelhante ao tipo II de Salter-Harris na zona hipertrófica da placa de crescimento e do tecido ósseo inferior adjacente, usando uma broca dentária de 0,5 mm de diâmetro, foi validada por meio de microCT e imagem crio-histológica das tíbias proximais lesadas (tempo 0) em comparação com os controles laterais não lesionados em camundongos N = 3 (Figura 4). Os defeitos eram difíceis de ver nas imagens 3D de microCT, mas eram detectáveis nas seções transversais 2-D (Figura 3A, B, E, F). A Figura 3G exibe a distribuição de células ósseas produtoras de colágeno tipo I (fluorescência verde), condrócitos proliferativos produtores de colágeno tipo II (fluorescência ciano) e condrócitos hipertróficos produtores de colágeno tipo X. Na imagem do camundongo lesionado (Figura 4G), há uma ruptura da zona hipertrófica, a camada provisoriamente calcificada e alguns dos ossos formados mais recentes em relação ao controle com a zona proliferativa apenas ligeiramente perturbada. A coloração Safranin O/Fast Green (Figura 4H) ilustra melhor a localização do defeito dentro da placa de crescimento lesada, uma vez que todas as células são claramente visíveis.
A análise de raios-X fornece algumas informações sobre camundongos vivos quanto ao impacto desse tipo de lesão da placa de crescimento no comprimento da tíbia e na formação da ponte óssea ao longo do tempo (Figura 3). Imagens comparativas entre tíbias não lesionadas (Figura 3A) e lesionadas (Figura 3B), obtidas antes da cirurgia e 3 semanas após a cirurgia, revelam uma grande quantidade de crescimento do membro, afinamento das placas de crescimento e uma região opaca distinta que se desenvolveu na área da placa de crescimento lesionada em 3 semanas. Essa opacidade dentro da placa de crescimento não está presente na contraparte não lesionada nem nos camundongos antes da cirurgia. O faxitron é, portanto, uma forma de observar alterações patológicas induzidas pela lesão em camundongos vivos, como a formação de uma ponte óssea e alterações no comprimento do membro.
A imagem de microtomografia computadorizada de ossos dissecados oferece uma visualização detalhada da formação de pontes ósseas dentro das placas de crescimento lesionadas três semanas após a cirurgia (Figura 5). Como visto nas imagens de seis camundongos feridos diferentes mostrados na Figura 5, há um desenvolvimento consistente de ponte óssea em todos os camundongos. Utilizando o software Scanco Medical, o volume da ponte óssea foi calculado revisando cada seção da placa de crescimento tibial proximal, delineando a área da ponte óssea (Figura 5B) com a ferramenta select e, em seguida, integrando cada área de corte em todo o volume da placa de crescimento para obter o volume total24. O volume da ponte óssea calculado dessa forma foi de 0,0761 mm3 ± 0,0246 (média ± desvio padrão, N = 6). A maioria das pontes ósseas se forma perto do meio da placa de crescimento, apesar da abordagem lateral, que fere a borda externa, bem como o centro da placa de crescimento. Esse fenômeno pode ser atribuído ao fato de que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula óssea, e não do pericôndrio, são responsáveis pela formação da ponte óssea25.
Nesses camundongos transgênicos tricolores, a análise crio-histológica da placa de crescimento lesada é enriquecida pela fluorescência do colágeno nativo (Figura 6). Ele revela a complexa interação de células ósseas e condrócitos no local da lesão. As imagens de microCT mostradas na Figura 6J,K foram fornecidas ao técnico de histologia para orientar a incorporação e secção. As células ósseas produtoras de colágeno tipo I são vistas na Figura 6L,O,P (fluorescência verde), enquanto os condrócitos proliferativos produtores de colágeno tipo II são vistos na Figura 6L,O,Q (fluorescência ciano). Os condrócitos hipertróficos produtores de colágeno tipo X são vistos na Figura 6L, O, R (fluorescência vermelha). Essa abordagem de fluorescência multicolorida permite um exame detalhado da diferenciação de condrócitos pós-cirurgia dentro da área da ponte óssea contra um pano de fundo de tecido mineralizado. A coloração DAPI foi usada para confirmar a distribuição de todos os tipos de células dentro da área da placa de crescimento (Figura 6M). A coloração Safranin O/Fast Green demonstra a organização composta e estrutural da cartilagem e do osso dentro da placa de crescimento lesada (Figura 6N). A imagem dessas seções coradas sob um conjunto de filtros Cy5 ilumina notavelmente as células da zona de repouso na interface entre o osso epifisário e a cartilagem.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig03.jpg"> Figura 3: Imagens de raios-X de controle contralateral e tíbias de camundongos lesionados. (A) Imagens de raios-X da tíbia de controle contralateral são tiradas imediatamente antes da lesão, quando os camundongos têm 2 semanas de idade, e 3 semanas após a cirurgia, quando os camundongos têm 5 semanas de idade, demonstrando a extensão do crescimento que ocorre durante esse período. (B) Tíbia lesionada do mesmo mouse ao mesmo tempo aponta como em (A). Os pontos de referência usados para medições do comprimento da tíbia são o ápice da cabeça proximal da tíbia até o final da tíbia na articulação do tornozelo (setas vermelhas de duas pontas). A ponte óssea opaca é visível na placa de crescimento da tíbia proximal lesada em 5 semanas. Barras de escala = 5,00 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig04.jpg"> Figura 4: MicroCT e imagens histológicas do controle contralateral de tempo zero e tíbias proximais de camundongos lesados. (A, E) e (B, F) mostram vistas de microCT 3D e 2D transversais, com o defeito indicado por setas vermelhas em (E) e (F). (C, G) Imagens crio-histológicas mescladas compostas mesclando três camadas de fluorescência inata com uma camada de tecido mineralizado. As células verdes (Col3.6GFPtpz) são as células ósseas produtoras de colágeno tipo I, as células de cor azul ciano (Col2A1GFPcyan) são condrócitos proliferativos produtores de colágeno tipo II e os glóbulos vermelhos (Col10A1RFPchry) são condrócitos hipertróficos produtores de colágeno tipo X. (D, H) Coloração Safranin O/Fast Green da mesma região que (C) e (G). Barras de escala = 1,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig05.jpg"> Figura 5: Imagens MicroCT de pontes ósseas formadas por este protocolo. (A,C,E,G,I,K) Cortes transversais da placa de crescimento tibial proximal de seis camundongos diferentes 3 semanas após a criação do defeito da broca. Ponte óssea delineada por uma linha pontilhada vermelha em (A). (B,D,F,H,J,L) Reconstruções 3D com um plano longitudinal cortado. Ponte óssea delineada por uma linha pontilhada vermelha em (B). Barras de escala = 1,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig06.jpg"> Figura 6: MicroCT e imagens histológicas do controle contralateral e tíbia proximal de camundongo lesionado com formação de ponte óssea. (A, J) e (B, K) mostram vistas 3D e transversais de microCT 2D, com a ponte óssea indicada por setas amarelas em (J) e (K). (C, L) Imagens crio-histológicas mescladas compostas mesclando três camadas de fluorescência inata com uma camada de tecido mineralizado. As células verdes (Col3.6GFPtpz) são as células ósseas produtoras de colágeno tipo I, as células de cor azul ciano (Col2A1GFPcyan) são condrócitos proliferativos produtores de colágeno tipo II e os glóbulos vermelhos (Col10A1RFPchry) são condrócitos hipertróficos produtores de colágeno tipo X. A caixa branca indica a maior ampliação mostrada nos painéis F e O. (D, M) O tecido mineralizado e a coloração DAPI na área da placa de crescimento dos painéis C e L. (E, N) Coloração Safranin O/Fast Green da mesma região que (D) e (M) escaneada com fluorescência cy5. (F,O) Uma maior ampliação da área da placa de crescimento na imagem mesclada dos painéis C e L. (G-I, P-R) Canais individuais da fluorescência nativa mostrados com um pano de fundo de tecido mineralizado. Barras de escala = 1,0 mm (A-E) e (J-N), = 250 μm em (F-I) e (O-R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um modelo de camundongo aprimorado para lesões na placa de crescimento ósseo de adolescentes. Usando camundongos transgênicos com repórteres fluorescentes de tri-linhagem para colágeno tipos I, II e X, as matrizes primárias associadas a três substratos diferentes da placa de crescimento, a colocação da lesão é guiada pela fluorescência nativa ao microscópio.

Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

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