Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares
August 9th, 2024
Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.
Neste trabalho, apresentamos e comparamos métodos de formação de esferoides que podem ser usados para análise do metabolismo celular e distribuição de oxigênio usando microscopia de células vivas. Nos últimos anos, a microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida tem sido amplamente utilizada para investigar biomarcadores metabólicos como NADPH e FAD em células vivas, e várias nanopartículas fluorescentes foram desenvolvidas para multiplexar tais medições com imagens de oxigenação celular e tecidual. Esferoides multicelulares, organoides e órgãos em um chip podem replicar um microambiente complexo semelhante ao in vivo, minimizando a necessidade de pesquisas com animais.
Para a produção de esferóides, mostramos diferentes métodos de formação, que podem variar de baixo a alto rendimento. Eles também destacam sua acessibilidade óptica, compatibilidade com microscópio de imagem de fluorescência e a possibilidade de incluir componentes da matriz extracelular. Portanto, embora os modelos 3D in vitro forneçam melhor contexto em comparação com as culturas 2D, sua alta variabilidade, baixa reprodutibilidade e relatórios experimentais incompletos continuam sendo um problema.
Parâmetros como o tamanho do esferóide, a composição de nutrientes, a viscosidade extracelular e até mesmo os métodos de formação de esferóides podem levar ao aumento da heterogeneidade celular. Com este protocolo, pretendemos harmonizar e padronizar os métodos de produção de esferoides, destacando os principais aspectos importantes para a análise contínua e multiparamétrica de esferoides usando microscopia FLIM.
Visão Geral
Este artigo apresenta vários métodos para formar esferoides multicelulares para analisar o metabolismo celular e a distribuição de oxigênio usando microscopia de células vivas. O estudo destaca o uso da microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM) para investigar biomarcadores metabólicos em células vivas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imagem de Células Vivas
Fundo
- Esferoides multicelulares e organoides replicam microambientes semelhantes aos in-vivo.
- A microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência é usada para estudar biomarcadores metabólicos.
- Alta variabilidade e baixa reprodutibilidade são desafios em modelos 3D in vitro.
- Diferentes métodos de formação de esferoides podem ser empregados para várias aplicações.
Propósito do Estudo
- Comparar métodos de formação de esferoides para microscopia de células vivas.
- Analisar metabolismo celular, hipóxia e morte celular em modelos 3D.
- Melhorar a compreensão da distribuição de oxigênio em sistemas multicelulares.
Métodos Utilizados
- Microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM)
- Análise de autofluorescência celular
- Uso de corantes de coloração e nanopartículas fluorescentes
- Diferentes técnicas de formação de esferoides
Principais Resultados
- Demonstrou métodos para analisar o metabolismo celular em esferoides 3D.
- Mostrou compatibilidade de esferoides com FLIM para estudos metabólicos.
- Destacou a importância dos componentes da matriz extracelular na formação de esferoides.
- Abordou desafios na reprodutibilidade e variabilidade das culturas 3D.
Conclusões
- Diferentes métodos de formação de esferoides podem melhorar a análise de células vivas.
- FLIM fornece insights valiosos sobre processos metabólicos em modelos 3D.
- O desenvolvimento contínuo desses métodos pode reduzir a dependência de modelos animais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
