Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares
9 de agosto de 2024
Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.
Neste trabalho, apresentamos e comparamos métodos de formação de esferoides que podem ser usados para análise do metabolismo celular e distribuição de oxigênio usando microscopia de células vivas. Nos últimos anos, a microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida tem sido amplamente utilizada para investigar biomarcadores metabólicos como NADPH e FAD em células vivas, e várias nanopartículas fluorescentes foram desenvolvidas para multiplexar tais medições com imagens de oxigenação celular e tecidual. Esferoides multicelulares, organoides e órgãos em um chip podem replicar um microambiente complexo semelhante ao in vivo, minimizando a necessidade de pesquisas com animais.
Para a produção de esferóides, mostramos diferentes métodos de formação, que podem variar de baixo a alto rendimento. Eles também destacam sua acessibilidade óptica, compatibilidade com microscópio de imagem de fluorescência e a possibilidade de incluir componentes da matriz extracelular. Portanto, embora os modelos 3D in vitro forneçam melhor contexto em comparação com as culturas 2D, sua alta variabilidade, baixa reprodutibilidade e relatórios experimentais incompletos continuam sendo um problema.
Parâmetros como o tamanho do esferóide, a composição de nutrientes, a viscosidade extracelular e até mesmo os métodos de formação de esferóides podem levar ao aumento da heterogeneidade celular. Com este protocolo, pretendemos harmonizar e padronizar os métodos de produção de esferoides, destacando os principais aspectos importantes para a análise contínua e multiparamétrica de esferoides usando microscopia FLIM.
Visão Geral
Este artigo apresenta diversos métodos para formar esferoides multicelulares com o objetivo de analisar o metabolismo celular e a distribuição de oxigênio utilizando microscopia de células vivas. O estudo destaca o uso da microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM) para investigar biomarcadores metabólicos em células vivas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imagem de Células Vivas
Antecedentes
- Esferoides multicelulares e organoides replicam microambientes semelhantes aos in vivo.
- A microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência é utilizada para estudar biomarcadores metabólicos.
- Alta variabilidade e baixa reprodutibilidade são desafios nos modelos in vitro tridimensionais.
- Diferentes métodos de formação de esferoides podem ser empregados para diversas aplicações.
Objetivo do Estudo
- Comparar métodos de formação de esferoides para microscopia de células vivas.
- Analisar o metabolismo celular, hipóxia e morte celular em modelos tridimensionais.
- Aprimorar a compreensão da distribuição de oxigênio em sistemas multicelulares.
Métodos Utilizados
- Microscopia de imagem de tempo de vida da fluorescência (FLIM)
- Análise da autofluorescência celular
- Uso de corantes de coloração e nanopartículas fluorescentes
- Diferentes técnicas de formação de esferoides
Resultados Principais
- Apresentou métodos para analisar o metabolismo celular em esferoides tridimensionais.
- Demonstrou a compatibilidade de esferoides com FLIM para estudos metabólicos.
- Destacou a importância dos componentes da matriz extracelular na formação de esferoides.
- Abordou os desafios relacionados à reprodutibilidade e variabilidade das culturas tridimensionais.
Conclusões
- Métodos diferentes de formação de esferoides podem aprimorar a análise de células vivas.
- A FLIM fornece informações valiosas sobre processos metabólicos em modelos tridimensionais.
- O desenvolvimento contínuo desses métodos pode reduzir a dependência de modelos animais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A produção padronizada e a análise multivariada de FLIM em esferoides multicelulares abordam desafios críticos na modelagem de microambientes tumorais para a descoberta de fármacos. A harmonização dos protocolos de formação de esferoides e de imagens em células vivas aumenta a confiabilidade preditiva de leituras metabólicas e relacionadas à hipóxia, apoiando decisões robustas em estágios iniciais. Essa abordagem fortalece a continuidade translacional e reduz os riscos biológicos em portfólios de pesquisa e desenvolvimento em oncologia e células-tronco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação de vias metabólicas e gradientes de oxigênio em modelos tridimensionais fisiologicamente relevantes.
- Apóia a validação funcional de alvos ao quantificar biomarcadores de NADPH e FAD em esferoides vivos.
- Facilita a desmistificação biológica por meio de medições multiplexadas de metabolismo e hipóxia.
- Melhora a confiança preditiva para o engajamento de alvos e modulação de vias em sistemas complexos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara modelos tridimensionais de esferoides reproduzíveis compatíveis com plataformas de FLIM de campo amplo, confocal e de dois fótons.
- Padroniza as condições do ensaio para reduzir a variabilidade e aumentar a confiabilidade dos resultados quantitativos.
- Permite triagem escalonável e de alto rendimento dos efeitos de compostos sobre o metabolismo e a viabilidade celular.
- Oferece suporte à avaliação robusta da integração de biossensores e nanossensores para leituras multiplexadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha perfis metabólicos e de hipóxia in vitro com microambientes tumorais relevantes para a doença.
- Proporciona continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, minimizando a dependência de modelos animais.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados quantitativos e multiparamétricos.
- Facilita o desenvolvimento de biomarcadores translacionais utilizando dados de FLIM de células vivas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho harmonizado integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos líderes e validação pré-clínica, aproveitando a produção padronizada de esferoides e análises de FLIM.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias em contextos tridimensionais semelhantes ao in vivo.
- Triagem: Fornece leituras reprodutíveis e quantitativas de metabolismo e hipóxia para triagem de compostos.
- Análises: Oferece medições multiplexadas de tempo de vida de fluorescência para comparação robusta de condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos pré-clínicos ao recapitular características do microambiente tumoral.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para diversos programas de P&D em oncologia e células-tronco.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em sistemas de modelos 3D.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de imagem de células vivas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência do capital ao fornecer dados robustos e quantitativos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos com relevância biológica validada.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura celular tridimensional, microscopia de células vivas e análise de FLIM.
- Exige acesso a instrumentação de FLIM de campo amplo, confocal ou de dois fótons e software de análise compatível.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de produção de esferoides e de aquisição de imagens.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos celulares, matrizes extracelulares ou integração de sensores.
- A variabilidade no tamanho e na composição dos esferoides pode afetar a reprodutibilidade e a interpretação dos dados.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
