Name: Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda métodos de produção de esferoides multicelulares para análise de metabolismo celular e distribuição de oxigênio usando microscopia FLIM. Esta técnica permite investigar biomarcadores metabólicos em células vivas.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Fundo Especial de Pesquisa (BOF) da Universidade de Ghent (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fundação de Investigação da Flandres (FWO, I001922N) e União Europeia, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN n.º 101073507.

Formação de esferoides multicelulares para análise metabólica e de hipóxia baseada em FLIM

Nada a divulgar.

Os esferoides multicelulares estão se tornando um método de escolha nos estudos de microambientes de nicho de tumores e células-tronco, descoberta de medicamentos e desenvolvimento dos 'blocos de construção de tecidos' para biofabricação. A arquitetura interna heterogênea dos esferoides, gradientes de nutrientes e oxigenação podem imitar os de tecidos e tumores in vivo em um ambiente relativamente simplificado e acessível. Com a necessidade de mais transparência metodológica26,28 e padronização71, espera-se que esses protocolos ajudem os pesquisadores a escolher o melhor método de formação de esferoides para os experimentos de microscopia de imagem de fluorescência ao vivo. Os métodos apresentados aproveitam os sensores de nanopartículas de coloração celular e a autofluorescência celular intrínseca, que podem ser facilmente combinados com a coloração da morte celular.
As etapas mais críticas estão no protocolo de formação de esferóides; Assim, para o método à base de agarose de alto rendimento, é essencial equilibrar suficientemente os moldes de agarose para o meio de cultura. O tempo de equilíbrio insuficiente levará à diluição de nutrientes no PBS remanescente e trará fatores adicionais para a heterogeneidade esferóide 21,26,72,73. O molde de agarose recém-feito também deve ser verificado visualmente quanto à presença de bolhas de ar, microfissuras e outros defeitos.
Embora eficiente para imagens, a suspensão de nanopartículas pode exibir autoagregação e causar a formação de esferóides de formato irregular em métodos de formação de baixa aderência. Isso geralmente pode ser mitigado pela adição de soro ao meio de cultura ou pela pré-coloração da cultura de células em monocamada antes da formação do esferoide. Freqüentemente, durante a compactação de esferoides, a adição de uma pequena quantidade de nanopartículas (por exemplo, 10% da concentração inicial de coloração) também pode ajudar a corar a zona de proliferação dos esferoides. Por fim, é importante usar ponteiras de pipeta estéreis "livres de poeira" com todos os métodos de formação.
O impacto potencial da iluminação na viabilidade celular deve sempre ser considerado durante os experimentos de imagem. Assim, é importante conhecer os fatores de risco que afetam negativamente cada experimento de imagem ao vivo. Em geral, o fotodano envolve vários mecanismos: (1) alto aumento local de temperatura, (2) estresse mecânico e (3) estresse fotoquímico (reação oxidativa e de radicais livres)74. Dependendo da modalidade de imagem (por exemplo, imagem confocal de um fóton vs. multifóton, modos de iluminação contínua vs. pulso, a sensibilidade dos detectores e a potência da fonte de luz em diferentes comprimentos de onda, se o ajuste de excitação for possível), tipo de célula e tecido (por exemplo, acúmulo dependente do tipo de tecido de pigmentos absorventes de luz com eficiência ou outras moléculas de autofluorescência, organização 3D vs. 2D, crescimento e composição dos meios de imagem), a origem da sonda fluorescente (por exemplo, propriedades fotossensibilizantes) diferentes combinações de fatores de risco podem provocar fototoxicidade durante a imagem. Além disso, mesmo que nenhum aumento na morte celular seja observado após a iluminação, os efeitos anteriores da pré-morte dependentes da energia da luz nas mitocôndrias e no metabolismo podem interferir potencialmente na análise e interpretação do experimento55.
Para excluir o impacto fototóxico nos resultados experimentais, o pesquisador deve realizar monitoramento geral da viabilidade celular e mudanças na morfologia celular em comparação com o controle intacto ou usando sondas de morte celular para estimar o aumento da taxa de morte celular após a iluminação. Se os experimentos metabólicos forem realizados, a otimização dos parâmetros de imagem deve ser feita de acordo nos experimentos piloto para estimar e minimizar o impacto da imagem nos parâmetros metabólicos medidos. No caso de sondas sensíveis ao oxigênio, a sobredosagem de luz pode ser facilmente rastreada por um aumento repentino da vida útil e da intensidade da fosforescência do corante sensível aoO2 (mudanças correspondentes na relação de intensidade de referência ao corante sensível aoO2) devido ao chamado efeito de "consumo fotoinduzido deO2"53,75. Isso pode ser feito facilmente pela análise da curva cinética de experimentos de lapso de tempo com diferentes parâmetros de potência de luz usando, por exemplo, o seguinte protocolo publicado25. Em 'defesa' da iluminação de pulso (por exemplo, utilizada na microscopia TCSPC-F(P)LIM), os estudos recentes demonstraram seu impacto mínimo na produção de ROS e fotobranqueamento da sonda em comparação com as medições de iluminação em estado estacionário76,77, apontando para uma vantagem adicional do TCSPC-FLIM em comparação com a abordagem convencional de imagem baseada em intensidade.
A principal limitação dos métodos de formação de esferoides apresentados reside em aplicações de monitoramento direto e de longo prazo. Os moldes de agarose requerem uma objetiva de longa distância de trabalho (ou microscópio vertical adicional ou microscópio estéreo de fluorescência) devido à espessa camada de agarose e o material da 5D Spheriplate pode interferir nas medições em canais fluorescentes vermelhos (sonda O2 ). O tamanho do esferóide produzido por métodos de alto rendimento é limitado pelo diâmetro do micropoço e requer troca frequente de meio para evitar o esgotamento e a acidificação do meio. Com todas essas limitações, recomendamos as placas de Petri 3D (MicroTissue) para experimentos que exigem alto rendimento (por exemplo, para aplicações de bioimpressão 3D) e métodos de baixa fixação para estudos básicos de "médio rendimento", também exigindo números de células menores.
O monitoramento da oxigenação raciométrica e os experimentos convencionais de microscopia baseada em corante de fluorescência de células vivas são acessíveis em microscópios invertidos amplamente disponíveis se equipados com uma câmera sensível ao infravermelho próximo (NIR), excitação baseada em diodo emissor de luz (LED) e objetiva apropriada25. Para um seccionamento óptico e FLIM mais apropriados, recomenda-se o uso de sistemas de microscópio confocal comercial disponíveis no mercado (como descrito aqui). Embora também descrevamos um método para detectar a autofluorescência NAD(P)H, exigindo um microscópio FLIM de dois fótons mais caro, existem muitas abordagens diferentes, compatíveis e úteis para sistemas FLIM confocais, equipados idealmente com laser de luz branca e detectores híbridos ou SPAD. Isso inclui avaliação do metabolismo celular, proteínas biossensores FRET-FLIM, mecânica celular e tecidual de imagem, autofluorescência de tipos específicos de células e tecidos e interações receptor-medicamento visualizadas via FLIM-FRET31.
O software de aquisição e análise FLIM fornecido pelo fornecedor pode afetar o sucesso do experimento, pois nem sempre é possível exportar o IRF ou as imagens em um formato compatível com a análise de código aberto downstream. O pós-processamento é uma parte importante do fluxo de trabalho de análise FLIM e ainda não é universalmente padronizado ou aceito. O ajuste de curva requer um número maior de fótons e mais poder computacional em comparação com a abordagem fasorial. O FLIMfit45 (ajuste global e pixel a pixel) e o Flimview78 estão entre os softwares abertos usados para análise de ajuste de curvas, enquanto o PAM79, o FLUTE64 e o AlliGator80 são usados para análise fasorial. FLIMJ46 é um plugin ImageJ útil que funciona com ambas as abordagens. Juntas, essas opções ajudam a melhorar a rotina de pós-processamento e torná-la mais rápida, versátil e fácil de usar.

Os esferoides multicelulares representam um grupo de modelos de tecidos 3D obtidos pela autoagregação de células e exibindo uma forma esférica. Eles são amplamente utilizados para imitar a interação célula-célula e célula-matriz in vitro e para reproduzir um contexto 3D dentro de uma infinidade de construções derivadas de câncer e células-tronco. Várias técnicas são empregadas para reduzir a ligação celular e promover a agregação. Isso inclui o método de queda suspensa com base na tensão superficial1; métodos de repelência de fixação celular, como placas de fixação ultrabaixa, micromoldes e micropoços 2,3; abordagem baseada em ondas acústicas4; métodos de agregação induzida por fluxo (frascos giratórios, biorreator e dispositivos microfluídicos)5; formação assistida por partículas magnéticas6 e uso de matrizes e andaimes sintéticos e baseados em ECM promotores de agregação 7,8,9.
Na pesquisa, desenvolvimento e validação de novas terapias medicamentosas contra o câncer, os esferoides são um modelo atraente devido à sua capacidade de recapitular os gradientes limitados por difusão espacial de nutrientes, resíduos eO2, muitas vezes levando à formação de um núcleo necrótico, típico dos tumores sólidos10,11. Esses modelos in vitro mais confiáveis e sofisticados desafiam a necessidade de uso extensivo de modelos animais (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), de acordo com o princípio 3Rs da pesquisa animal (substituição, redução e refinamento). Além do câncer, os esferoides encontram sua aplicação na pesquisa com células-tronco. Por exemplo, as células-tronco pluripotentes têm a capacidade de formar corpos embrióides (EB), que podem ser usados para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) em tipos de células especializadas que são difíceis de obter diretamente de pacientes, como células precursoras neurais13 ou células da granulosa ovariana 13,14. Além disso, a formação de um EB é frequentemente o primeiro passo no desenvolvimento de modelos organoides mais complexos, por exemplo, neural15, retinal16, cardíaco17, fígado18, estômago19 e organoides intestinais20. Fatores como tamanho, reprodutibilidade, rendimento e aplicações a jusante devem ser considerados ao escolher um método de formação de esferóides apropriado para os experimentos.
O aumento da complexidade da cultura 3D pode levar a uma maior variabilidade em comparação com a cultura 2D. Fatores como composição de nutrientes21, evaporação do meio22, viscosidade23, controle de pH24, método de formação de esferoides e até mesmo o tempo de cultura25,26 podem resultar na obtenção de esferoides de morfologia, tamanhos, viabilidade e quimiorresistência diferentes27,28. Pesquisas recentes demonstraram que os gradientes de oxigênio dos esferoides nem sempre são estáticos e são afetados pelo método de formação, tamanho do esferóide e viscosidade extracelular, afetando a heterogeneidade do esferóide29. Para melhorar a reprodutibilidade e a acessibilidade dos dados em esferoides, a base de conhecimento MISpheroID foi desenvolvida26, identificando linhagem celular, meio de cultura, método de formação e tamanho dos esferoides como as informações mínimas para um resultado reprodutível. Portanto, foi feita uma comparação detalhada de vários métodos de alto rendimento (SphericalPlate 5D, micromoldes feitos em laboratório e moldes de microtecido) e de baixa fixação (ou seja, placas de 96 poços revestidas com Biofloat e Lipidure, sem andaimes e baseadas em andaimes) (Figura 1 e Tabela 1), incluindo o tamanho do poço (dada uma estimativa do tamanho máximo do esferóide), consumíveis usados, tempo de preparação e a possibilidade de monitorar os esferoides sem transportá-los para placas de microscopia. Este último permite estudos de longo prazo, enquanto os esferoides produzidos com métodos de alto rendimento geralmente resultam em experimentos de endpoint. Todos os métodos, exceto as grades da Placa 5Dspheri, não trazem autofluorescência indesejada, possibilitando seu uso direto em microscopia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> Figura 1: Métodos de formação de esferóides explicados. Métodos de alto rendimento, como o SphericalPlate 5D, que integrou micropoços patenteados na placa, enquanto os micromoldes produzidos em laboratório e os moldes MicroTissue usam carimbos para fazer vários micropoços em agarose (azul). Placas de baixa fixação, como Lipidure (Amsbio) e Biofloat (Sarstedt), usam um revestimento não aderente que inibe a adesão à superfície celular e promove a autoagregação celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Placa 5D SpheriPlate</td>
			<td>Micromoldes de produção própria</td>
			<td>Microtecido</td>
			<td>Métodos de fixação baixa</td>
		</tr><tr><td>Número de esferoides/poço</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Poço de diâmetro</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 milímetro</td>
		</tr><tr><td>Volume de cultura</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr><tr><td>Outros consumíveis</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL de agarose a 3%</td>
			<td>500 μL de agarose a 2%</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>Tempo de preparação</td>
			<td>10 minutos</td>
			<td>2 h + 3 dias de adaptação de mídia</td>
			<td>0,5 h + 15 min adaptação de mídia</td>
			<td>10–30 min + 1 h de secagem</td>
		</tr><tr><td>Monitorização</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Não**</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td>Autofluorescente</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Não</td>
			<td>Não</td>
			<td>Não</td>
		</tr><tr><td>Reutilizável</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Não**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Custar</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: Revestimento e Matrigel</td>
		</tr><tr><td>€€: Placa comercial de 96 poços</td>
		</tr><tr><td colspan="3">* Algumas linhagens celulares precisam de adição de ECM (ou seja, 2% a 5% de Matrigel) para formar esferóides compactos.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**O revestimento é reutilizável até se esgotar. No entanto, cada placa consumirá uma pequena quantidade de mídia e a poeira pode se acumular com o tempo. A esterilização do filtro é necessária regularmente.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Comparação de vários métodos de formação de esferóides29. "Monitorização": capacidade de monitorizar o esferóide sem necessidade de transferência para uma placa de microscopia. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: &gt;500€
A microscopia de fluorescência permite o monitoramento direto dos principais aspectos biológicos dos esferoides, incluindo morte celular, viabilidade, proliferação, metabolismo, viscosidade e até propriedades mecânicas30. A microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM) fornece uma dimensão quantitativa adicional para estudar as interações da sonda fluorescente dentro de seu (micro) ambiente31 , 32 , 33 , 34 , permitindo resolver os espectros de emissão sobrepostos de acordo com diferentes tempos de vida de emissão35 , 36 e sondar o metabolismo celular com base na autofluorescência celular intrínseca. Assim, compostos autofluorescentes celulares difundidos como nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NAD (P) H), mononucleotídeo de flavina (FMN), dinucleotídeo de flavina adenina (FAD), protoporfirina IX e outros podem ser medidos com FLIM de um e dois fótons e servem como 'sensores' intrínsecos do catabolismo da glicose, fosforilação oxidativa (OxPhos) e fornecem uma visão geral do estado redox celular. O NAD (P) H existe nas formas citoplasmáticas livres ou nas mitocôndrias ligadas a proteínas 37,38. Da mesma forma, o estado oxidado do FAD é fluorescente com uma vida útil mais longa da forma livre. As microscopias NAD(P)H e FAD geralmente envolvem FLIM excitado por dois fótons, com o objetivo de prevenir fotodanos à amostra39. Freqüentemente, o FLIM de 'imagem metabólica óptica' pode ser combinado com o uso de sondas à base de corantes, biossensores geneticamente codificados, microscopia de imagem de fosforescência ao longo da vida (PLIM) e medições baseadas em intensidade raciométrica, a fim de fornecer uma imagem mais completa do metabolismo esferóide ou organoide, oxigenação, proliferação e viabilidade celular29 , 30 , 31. Além disso, o FLIM também pode ser combinado com o método de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) para medir a variação ao longo da vida do fluoróforo do doador quando em contato próximo com o aceitador para investigar a ligação de um medicamento com seu domínio alvo 33,40,41.
As imagens FLIM adquiridas são normalmente analisadas para calcular o tempo de vida pixel a pixel. Atualmente, existem pelo menos 3 estratégias comuns usadas para obter o tempo de vida da fluorescência: 'FLIM rápido' semiquantitativo 42 (às vezes chamado de 'sentido tau' 43 , 44 ), ajuste da curva de decaimento, usando ajuste exponencial de um, dois ou três e abordagem 'sem ajuste' com transformação fasorial e análise de gráfico fasorial. Dependendo do fornecedor, o software fornecido (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) ou de código aberto (por exemplo, FLIMfit45, FLIMJ46 ou outros47) pode ser usado para lidar com dados FLIM medidos. Normalmente, o software fornecido pelo fornecedor é útil para análise preliminar de dados, enquanto as soluções de código aberto podem fornecer estudos mais precisos usando, por exemplo, gráficos fasoriais e visualização 3D.
Apesar da utilidade e atratividade do FLIM como método para estudar esferoides, muito poucos protocolos experimentais estão disponíveis, e há uma falta geral de conhecimento na escolha do método de formação mais apropriado para experimentos bem-sucedidos de microscopia multiparamétrica ao vivo envolvendo FLIM. Aqui, uma comparação detalhada dos protocolos de formação de esferóides comumente usados é apresentada com base em sua morfologia, viabilidade e oxigenação com o nanossensor de detecção de oxigênio (MMIR1) recentemente validado e caracterizado em vermelho distante e infravermelho próximo (NIR). A nanopartícula catiônica é impregnada com dois corantes repórteres, o aza-BODIPY insensível ao Øde referência (excitação 650 nm, emissão 675 nm) e a metaloporfirina sensível ao NIR O2, PtTPTBPF (excitação 620 nm, emissão 760 nm). O MMIR1 permite a análise em tempo real de gradientes de oxigênio em um microscópio de fluorescência convencional (usando análise raciométrica) ou microscópio de fosforescência (PLIM) sem introduzir toxicidade celular e permitindo sinais estáveis, monitoramento de longo prazo e multiplexação25,29. Dependendo da necessidade de coloração com corantes ou nanossensores, rendimento de esferóides ou tipo de célula, o protocolo de formação mais adequado pode ser escolhido. Uma vez que os estudos de viabilidade e oxigenação de esferoides são relevantes para estudos de câncer e esferoides derivados de células-tronco, os protocolos apresentados também incluem exemplos e resultados típicos esperados de NAD(P)H-FLIM e FAD-FLIM com esses modelos. Os pipelines de imagem e análise apresentados têm como alvo as plataformas de microscopia FLIM baseadas em contagem de fótons únicos correlacionadas ao tempo mais populares.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Também disponível na Sigma</td></tr><tr><td>10 mL pipetas serológicas</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Produtos semelhantes também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 12 poços, Greiner</td><td>bio-one</td><td>665-180</td><td>Estéril Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning e outras empresas.</td></tr><tr><td>Corrediça de câmara de 12 poços, removível</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Também disponível na Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific e outros</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Produtos semelhantes também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas</td></tr><tr><td>Micromoldes de placa de Petri 3D</td><td>Microtecido</td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 6 poços, Greiner estéril</td><td> bio-one</td><td>657160</td><td>Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>Placa revestida de 96 poços disponível comercialmente para formação de esferóides</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>Aplicar em diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Software CellSens Dimension</td><td>Olympus</td><td>versão 3</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno da placenta humana, tipo IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Para a preparação de placas de microscopia revestidas com 0,07 mg/mL de colágeno e 0,03 mg/mL de poli-D-lisina</td></tr><tr><td>Microscópio confocal FLIM Leica</td><td>Microsystems</td><td>N/A</td><td>Stellaris 8 Falcon microscópio invertido com laser de luz branca, detectores HyD X, câmara de controle climático/T (OkoLab), 25x/0,95 W objetiva</td></tr><tr><td>D(+)-Glicose</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>Prepare uma solução estoque M, 1:100 para preparação de meio de imagem (concentração final 10 mM)</td></tr><tr><td>Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), vermelho de fenol, glicose, piruvato e glutamina livre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>Para preparação de meio de imagem</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino&nbsp;( FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Também disponível na Sigma. Precisa ser inativado por calor antes do uso.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Diluição 1/100 para preparação de meio de imagem (concentração final 10 mM)Células de câncer de</td></tr> <tr><td>cólon humano HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>versão 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>versão 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Também disponível na Sigma. Aplicar na diluição 1:100.</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A, precisa de adição de 1 mM de piruvato de sódio e 10 mM HEPES</td><td>VWR</td><td>392-0420</td><td>Meio de crescimento padrão para células HCT116</td></tr><tr><td>selos PDMS impressos em 3D micropadronizados</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fornecido pelo Centro de Tecnologia de Microssistemas, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Universidade de Ghent</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de medição Neubauer</td><td>Fisher Scientific</td><td>15980396</td><td></td></tr><tr><td>Sondas de O2: MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>A Caracterização completa, validação e algumas aplicações podem ser encontradas em: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>Dissolver o comprimido de PBS em 500 mL de água destilada.</td></tr><tr><td>Estreptococos de caneta :P (10.000 U/mL) / estreptomicina (10.000 &mu; g/mL) solução 100x</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Também disponível na Sigma. Aplicar na diluição 1:100.</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>Para a preparação de 0,07 mg/mL de colágeno e 0,03 mg/mL de placas de microscopia revestidas com Poly-D-lysine</td></tr><tr><td>Iodeto de Propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>Coloração de morte celular, use 1 &micro; g/mL a 1h de incubação</td></tr><tr><td>Filtro de seringa PVDF 0,22 &micro; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Diluição 1/100 para preparação de meio de imagem (concentração final 1mM)</td></tr><tr><td>Placa esférica 5D 24 poços</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>petridish estéril</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas</td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos (25 cm&sup2; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Produtos semelhantes também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas</td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos (75 cm&sup2;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, VWR e outras empresas</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços com fundo em U</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Produtos similares também estão disponíveis na Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one e outras empresas</td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>Outros tipos de Agarose, como Agarose de baixo ponto de fusão (A-9414, Sigma), Agarose para uso rotineiro (A-9539, Sigma)</td></tr><tr><td>Microscópio invertido de fluorescência de campo amplo</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Microscópio de fluorescência invertida IX81, com controle motorizado do eixo Z, CoolLED pE4000 (16 canais, 365-770 nm), câmera ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS, placa de aquecimento de vidro Okolab, software CellSens Dimension v.3 e objetivas de ar 4x/0.13 UPlanFLN e 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Opcional, para imagens de alta resolução) 60x/1,0 LUMPLFLN água</td></tr></tbody></table>

produção e microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência de células vivas multiparâmetros (flim) de esferoides multicelulares

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Os esferoides tumorais multicelulares são um modelo popular de microagregado de tecido 3D para reproduzir o microambiente tumoral, testar e otimizar terapias medicamentosas e usar bio e nanossensores em um contexto 3D. Sua facilidade de produção, tamanho previsível, crescimento e gradientes de nutrientes e metabólitos observados são importantes para recapitular o microambiente celular semelhante a um nicho 3D. No entanto, a heterogeneidade esferóide e a variabilidade de seus métodos de produção podem influenciar o metabolismo celular geral, a viabilidade e a resposta aos medicamentos. Isso dificulta a escolha da metodologia mais adequada, considerando os requisitos de tamanho, variabilidade, necessidades de biofabricação e uso como modelos de tecidos 3D in vitro em biologia de células-tronco e cânceres. Em particular, a produção de esferoides pode influenciar sua compatibilidade com microscopias quantitativas ao vivo, como imagens metabólicas ópticas, microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM), monitoramento de hipóxia esferóide com nanossensores ou viabilidade. Aqui, uma série de protocolos convencionais de formação de esferóides são apresentados, destacando sua compatibilidade com as microscopias de campo amplo, confocais e de dois fótons ao vivo. A imagem de acompanhamento para análise pipeline com autofluorescência multiplexada FLIM e, usando vários tipos de câncer e esferóides de células-tronco, também é apresentada.

Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Imagens Lifetime fluorescência (FLIM) emergiu como uma técnica de imagem chave para o meio ambiente e interacção de proteínas específicas e corantes em células vivas. FLIM de rotores moleculares fluorescentes permite o mapeamento de viscosidade em células vivas.

Imagem Lifetime fluorescência de rotores moleculares em células vivas

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide. Este dispositivo permite imagens de fluorescência dinâmica ou longitudinal de esferoides de células cancerosas. O protocolo também oferece um simples procedimento de processamento de imagem para a análise da invasão de células cancerosas.

Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

O protocolo descreve a geração de spheróides de alto rendimento para bioimpressão usando a análise multi-paramétrica de sua oxigenação e morte celular em um microscópio padrão de fluorescência. Essa abordagem pode ser aplicada para controlar a viabilidade dos esferoides e realizar a padronização, o que é importante na modelagem do tecido 3D, microambiente tumoral e biofabricação (micro)tecido bem sucedida.

Biofabricção assistida por microscopia de oxigênio acessível de esferoides multicelulares

Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

A distribuição espacial e a dinâmica temporal das proteínas e lipídios da membrana plasmática são um tema quente na biologia. Aqui, esse problema é abordado por uma análise de flutuação de imagem espaço-temporal que fornece conceitualmente as mesmas quantidades físicas de rastreamento de partícula única, mas usa pequenos rótulos moleculares e configurações de microscopia padrão.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

Um novo protocolo de imagem foi desenvolvido usando um atuador mecânico acionado por motor personalizado para permitir a medição de respostas em tempo real à tensão mecânica em células vivas. Relevante para a mecanobiologia, o sistema pode aplicar deformações de até 20%, permitindo imagens quase em tempo real com microscopia de força confocal ou atômica.

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

Apresentamos um dispositivo microfluídico centrífuga movido a motor que pode cultivar esferóides celulares. Usando este dispositivo, esferóides de tipos de células únicas ou múltiplas podem ser facilmente coculturados condições de alta gravidade.

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

O método apresentado envolve alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D embutidos na borracha de silicone, permitindo microscopia confocal ao vivo. Demonstra-se a caracterização das cepas de hidrogel externos e internos, bem como o alinhamento de fibras. O dispositivo e o protocolo desenvolvidos podem avaliar a resposta das células a vários regimes de tensão.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

Aprenda métodos de produção de esferoides multicelulares para análise de metabolismo celular e distribuição de oxigênio usando microscopia FLIM. Esta técnica permite investigar biomarcadores metabólicos em células vivas.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares (Vídeo) | JoVE Journal

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

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