Name: Método baseado em extração de apoplastos para melhorar a pureza da proteína recombinante produzida pela planta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Aprenda a extrair proteínas recombinantes do apoplasto de Nicotiana benthamiana usando infiltração a vácuo e centrifugação. Este método aumenta a pureza do GFP His para 84,3%, reduzindo custos de purificação.

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Este trabalho é apoiado pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084) e pelo Fundo de Apoio ao Projeto de Implantação Chave do Plano de Ação Trienal do Instituto de Microbiologia da Academia Chinesa de Ciências.

1. Preparação de plantas de N. benthamiana
<ol><li>Coloque os blocos de mudas em uma bandeja, adicione 1 L de água e deixe de molho por aproximadamente 2 h até saturar totalmente.</li>
	<li>Polvilhe uniformemente sementes de N. benthamiana do tipo selvagem nos blocos de mudas, cubra com uma tampa e germine por 1 semana. Cultive N. benthamiana em estufa com fotoperíodo de 18 h, 24 °C, 45% de umidade relativa e fertilize a cada 2 semanas.</li>
	<li>Depois que as sementes germinarem, use uma pinça para remover suavemente uma muda, tomando cuidado para não causar danos às raízes. Cave um pequeno buraco no centro de uma nova bandeja, coloque a muda nele e cubra as raízes levemente com terra. Cubra com uma tampa e continue a crescer.</li>
	<li>Cresça até que as mudas tenham três folhas, com a tampa. Remova a tampa quando a4ª folha verdadeira emergir.</li>
	<li>Deixe as plantas continuarem crescendo por mais duas semanas antes da infiltração agrícola.</li>
</ol>2. Construção do GFP-His recombinante
<ol><li>Realizar a otimização do códon de N. benthamiana e síntese de GFP e PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) com base nas sequências gênicas.</li>
	<li>Realizar a dupla digestão do vetor pCAMBIA1300 utilizando as enzimas Xba I e Sac I (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Realizar amplificação de PR1a usando primers a montante (TTGGAGAGAACACGGGACTCTAGAATGGGATT TGTTCTCTTTTC) e primers a jusante (TCCTCG CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA GTGGG), amplificação de GFP usando primers a montante (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG CAAGGGCGAGGA) e primers a jusante (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG GTGAGATCTTCCGGACTTGT).</li>
	<li>Usando recombinação homóloga, clone PR1a e GFP no vetor de expressão de plantas pCAMBIA1300. Após a transferência para E. coli, selecione clones únicos e envie-os para a empresa para sequenciamento. A comparação dos resultados do sequenciamento e do plasmídeo correto é o plasmídeo recombinante pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, conhecido como p35s-PR1a-GFP-His.</li>
</ol>3. Produção de GFP-His em N. benthamiana
<ol><li>Adicione 1 μL de plasmídeo GFP em 50 μL de células receptoras de Agrobacterium GV3101, misture delicadamente e adicione ao copo do eletrodo, remova após a eletrocussão no eletrochoque.</li>
	<li>Espalhe Agrobacterium tumefaciens transformado em uma placa de meio sólido LB contendo 50 μg/mL de canamicina (Kan) e 50 μg/mL de rifampicina (Rif). Incubar invertido a 28 °C durante 48 h. O vetor pCAMBIA1300 é resistente a kan e Agrobacterium é resistente a rif; apenas o Agrobacterium correto pode crescer em placas com kan e rif. Os clones monoclonais foram os transformantes positivos, denominados A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).</li>
	<li>Use um palito esterilizado para coletar uma quantidade adequada de AtGPG e inoculá-lo em 4 mL de LB líquido com Kan e Rif. Cultura a 28 °C, 220-300 rpm durante 24 h.</li>
	<li>Subcultive bactérias 1:50 em LB fresco (50 μg/mL Kan, 10 mM de ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES), 20 μM de acetosiringona (AS)) e incube a 28 °C, 220-300 rpm por 10-12 h.</li>
	<li>Colha bactérias por centrifugação a 1500 x g por 10 min e ressuspenda o pellet com 1 mL de MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 100 μM AS).</li>
	<li>Meça e ajuste a densidade óptica (OD) de AtGPG para OD600 = 0,8 usando MMA. Incube as bactérias por mais 2-4 h em temperatura ambiente. Retire a solução bacteriana com uma seringa sem agulha, pressione-a levemente contra a parte de trás das folhas e pressione para penetrar a solução nas folhas. Injete apenas as 3-4 folhas do meio por planta.</li>
	<li>Continue a cultivar N. benthamiana na estufa por 3-4 dias antes de colher as folhas para extração de proteínas.</li>
</ol>4. Observando a localização subcelular da GFP
<ol><li>Após 48 h de agroinfiltração, selecione uma folha plana e use um furador de 6 mm para prender a lâmina para perfuração.</li>
	<li>Pingue a solução de sacarose a 30% em uma lâmina de vidro, coloque a amostra de folha com as costas voltadas para cima e cubra-a com uma lamínula.</li>
	<li>Defina o comprimento de onda de excitação para 488 nm e detecte a fluorescência verde em 490-550 nm após ampliação de 400x. Tire a primeira foto assim que o slide estiver preparado e outra 10 minutos depois.</li>
</ol>5. Extraindo GFP da planta
<ol><li>Extração AWF<ol><li>Colete as folhas frescas intactas de N. benthamiana expressando GFP recombinante 3 dias após a agroinfiltração. Trate a folha com cuidado e mantenha a integridade da folha para evitar o efluxo de proteína intracelular. Use as folhas coletadas para a próxima etapa imediatamente para evitar a degradação da proteína.</li>
		<li>Enxágue a lâmina da folha com ddH2O esterilizado pré-resfriado para remover detritos.</li>
		<li>Pese as folhas frescas e mergulhe 20 g de folhas (lado abaxial para baixo) em 100 mL de tampão fosfato 100 mM pré-resfriado (PB 100 mM Na2HPO4 e 100 mM NaH2PO4 foram configurados separadamente e misturados na proporção de 2,2:1 pH 7,0) em um béquer de boca larga de 200 mL. Cubra as folhas com fio de malha fina de nylon de malha 100 (consulte a Tabela de Materiais) e uma placa de plástico. NOTA: O pré-resfriamento evita a degradação da proteína. Os volumes de buffer podem ser ajustados com base na escala experimental. Certifique-se de que todas as folhas estejam imersas.</li>
		<li>Coloque o copo em uma bomba de vácuo. Aplique vácuo de 0,8 MPa por 1 min e, em seguida, restaure rapidamente a pressão atmosférica.</li>
		<li>Remova as folhas do tampão e seque suavemente com papel absorvente. Enrole as folhas, embrulhe com fio de malha e coloque 5 g de folhas em cada tubo de centrífuga de 50 mL. Para coletar AWF, posicione as folhas enroladas com a ponta para cima em tubos com fio de malha preso pelas tampas dos tubos.</li>
		<li>Centrifugue a 4 °C, 500 x g durante 5 min. Remova as folhas e colete o AWF no fundo do tubo usando uma pipeta. Cerca de 5 mL de AWF podem ser obtidos de cada tubo. NOTA: Para minimizar a interferência das proteínas intracelulares e extrair a quantidade máxima de proteínas AWF, a extração pode ser repetida 2x-3x, mas não mais do que 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de proteína solúvel total<ol><li>Moer 20 g de folhas em pó fino em nitrogênio líquido. Adicione tampão de extração (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 0,034% de β-mercaptoetanol (ver Tabela de Materiais)) na proporção de 1: 2.</li>
		<li>Agitar o homogeneizado num misturador vertical durante 30 min a 4 °C. Homogeneizar a centrífuga a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo e repetir a centrifugação durante 15 min. Transferir o sobrenadante limpo para outro tubo.</li>
		<li>Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) para obter o extracto de proteína solúvel total.</li>
	</ol></li>
</ol>  
6. Purificação de GFP-His com cromatografia de afinidade de níquel (Ni)
NOTA: Execute todas as etapas a 4 °C.
<ol><li>Adicione a resina Ni sepharose excel (consulte a Tabela de Materiais) a um tubo na proporção de 1:1000 em relação ao volume do extrato de proteína da etapa 5.1.6. O volume da resina é igual a 1/1000do volume do extrato proteico.</li>
	<li>Lave a resina de Ni 3x com 10x o volume de resina de ddH2O e PB (pH 7,0) separadamente e remova o sobrenadante.</li>
	<li>Incube o extrato de proteína com resina de Ni por 2 h para permitir a ligação total. Centrifugue a 500 x g por 5 min para remover proteínas não ligadas no sobrenadante. Lave 3x com 20x o volume de resina de PB. Centrifugue a 500 x g por 5 min e remova o sobrenadante.</li>
	<li>Eluir GFP-His adicionando 10x volume de resina de 250 mM de imidazol (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 250 mM de imidazol) e colete o sobrenadante.</li>
</ol>7. Coloração de proteínas com azul de Coomassie
<ol><li>Adicione 10 μL de tampão de carga 5x SDS a 40 μL de amostras de proteína, ferva por 10 min e depois execute em 15% SDS-PAGE a 110 V por 60 min.</li>
	<li>Géis de proteína de coloração com solução de azul de Coomassie (0,1% R-250, 25% isopropanol, 10% de ácido acético glacial) por 2 h.</li>
	<li>Despeje a solução e lave com solução descolorante por 2 h. Observe o gel; As proteínas no gel serão coloridas em azul.</li>
</ol>8. Western blotting de proteínas
<ol><li>Adicione 10 μL de tampão de carga 5x SDS a 40 μL de amostras de proteína, ferva por 10 min e depois execute em 15% SDS-PAGE a 110 V por 60 min.</li>
	<li>Transfira proteínas para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm a 280 mA. Bloqueie a membrana com 5% de leite desnatado por 1 h.</li>
	<li>Diluir os anticorpos anti-His-tag a 1:5000 e incubar a membrana com os anticorpos durante 1 h. Use a solução salina tamponada com tris e tween 20 (TBST) para lavar a membrana 4x por 5 min.</li>
	<li>Diluir os anticorpos anti-ratinho a 1:10000 e incubar a membrana com os anticorpos durante 1 h. Use TBST para lavar a membrana 4x por 5 min.</li>
	<li>Misture o revelador (consulte a Tabela de Materiais) na proporção de 1:1. Adicione 400 μL à membrana e deixe reagir por 1 min. Tire fotografias após 1 min de exposição com um visualizador.</li>
</ol>9. Ensaio de concentração de proteína
<ol><li>Adicione 5 μL de proteína a 1 mL de reagente de corante Bradford 1x e reaja por 5 min.</li>
	<li>Determine o valor OD595 após zeragem e calcule a concentração de proteína a partir da curva padrão.</li>
</ol>10. Quantificação de proteínas 31
<ol><li>Realize Western blotting de amostras de proteínas junto com os padrões.</li>
	<li>Realize a quantificação de GFP por proporção com os padrões usando a análise em escala de cinza ImageJ 1.5.0.</li>
</ol>

Extração e purificação eficientes de GFP-His de folhas de N. benthamiana

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<li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+transient+expression+system+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants.</a> Sci Rep. 8 (1), 4755(2018).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+Apoplast-localized+lipid+transfer+protein+TaLTP3+enhances+defense+responses+against+Puccinia+triticina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina.</a> Front Plant Sci. 12, 771806(2021).</li>
<li>Venkataraman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+expression+and+purification+strategies+for+plant+made+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines.</a> Front Plant Sci. 14, 1273958(2023).</li>
<li>Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., Mühling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+extraction+methods+for+apoplastic+proteins+from+maize+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves.</a> Plant Meth. 7, 48(2011).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

O uso de plantas para produzir proteínas terapêuticas expandiu-se rapidamente nos últimos anos 1,2,3,4,5,6. Os genes codificadores de proteínas são clonados em vetores de expressão e entregues aos tecidos vegetais por meio de agroinfiltração. Após a produção por células vegetais, as proteínas são purificadas para aplicações a jusante. Normalmente, as proteínas recombinantes são purificadas a partir de extratos de TSP. No entanto, proteínas vegetais abundantes e citocromos liberados das células vegetais durante a extração podem dificultar a purificação33. Por um lado, os citocromos das plantas podem entupir as colunas de separação, retardando o processamento17; por outro lado, proteínas altamente abundantes como RuBisCO são difíceis de remover, reduzindo a pureza18,19. Esses problemas se tornam mais problemáticos quando as proteínas-alvo são expressas em níveis baixos. A purificação de AWF contorna esses problemas, permitindo maior pureza (Figura 2J).
Embora a extração de AWF tenha sido amplamente utilizada em biologia vegetal 24,25,26,27, ela raramente é explorada em pipelines de agricultura molecular. Aqui, usamos um modelo GFP feito de plantas para demonstrar a purificação de proteínas baseada em AWF. A extração de GFP do AWF foi realizada pela adição de um peptídeo sinal para permitir a secreção de GFP no espaço apoplasto. Este método extrai proteínas com maior homogeneidade e reduz os custos de processamento de proteínas a jusante. Várias considerações merecem investigação futura para implementar a purificação AWF em biorreatores de plantas. Primeiro, a secreção eficiente requer a fusão de peptídeos sinal N-terminais específicos. Em segundo lugar, para preservar a qualidade do AWF, as folhas intactas devem ser processadas rapidamente após a colheita sem congelamento, o que libera o conteúdo intracelular. Terceiro, o PB extrai efetivamente as proteínas AWF34, mas o pH do tampão e a concentração de sal devem ser adaptados para proteínas recombinantes individuais (Figura 2C-D). Em quarto lugar, obtivemos proteína purificada de 200 g de N. benthamiana muitas vezes em condições de laboratório com pureza e rendimento estáveis. Para serem ampliados para uso na fábrica, são necessários vasos e bombas de vácuo maiores e um método de purificação mais eficaz, e condições como duração do vácuo, número de recuperações, etc., podem precisar ser otimizadas.
Este método é limitado pelo fato de que proteínas exógenas são secretadas no AWF e proteínas dentro da membrana plasmática são desertas ( Figura 2H-I ). Traz o benefício de obter proteínas purificadas mais altas com modificação correta, mas com maior custo de rendimento. O principal gargalo técnico para a purificação baseada em AWF é a melhoria do nível de proteína alvo dentro do AWF. O acoplamento com promotores fortes e sistemas de secreção otimizados melhorará as plataformas de expressão de plantas para alta pureza e maiores rendimentos. Para superar esse gargalo, um sistema de produção mais alto e um sistema de secreção mais eficaz são solicitados em trabalhos futuros.

Atualmente, várias proteínas terapêuticas recombinantes produzidas em plantas estão em estudo, incluindo anticorpos, vacinas, proteínas bioativas, enzimas e pequenos polipeptídeos 1,2,3,4,5,6. As plantas estão se tornando uma plataforma cada vez mais utilizada para a produção de proteínas terapêuticas devido à sua segurança, baixo custo e capacidade de escalar rapidamente a produção 7,8. A expressão e modificação de proteínas em sistemas vegetais, juntamente com a purificação de proteínas, são fatores críticos que determinam a produtividade dos biorreatores vegetais 9,10. Aumentar a produtividade das plantas e obter proteínas-alvo de alta pureza são os principais desafios enfrentados pelos sistemas de produção à base de plantas11,12.
A localização subcelular e a modificação de proteínas recombinantes dependem do peptídeo sinal específico codificado no terminal N, que direciona a proteína para seu destino final de organela durante a expressão gênica. As proteínas recombinantes são projetadas para se localizar no apoplasto, retículo endoplasmático (RE), cloroplasto, vacúolo ou citoplasma, com base em suas propriedades únicas13. Para antígenos e anticorpos, as proteínas secretadas são preferidas. Antes da secreção, as proteínas progridem através de ER e Golgi para dobramento correto e modificações pós-traducionais 14,15,16.
Após a produção em plantas, as proteínas recombinantes devem ser purificadas a partir de extratos vegetais. Normalmente, as proteínas são purificadas a partir de extratos vegetais solúveis totais, que contêm proteínas intracelulares abundantes, produtos mal dobrados e não modificados e citocromos17. Para remover as impurezas, os extratos vegetais passam por um extenso fracionamento, incluindo cromatografia de afinidade específica da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase / oxigenase (RuBisCO), precipitação de fitato, precipitação de polietilenoglicol e ajuste de temperatura e pH18,19. Essas etapas de remoção de impurezas são trabalhosas e podem comprometer a qualidade da proteína.
O compartimento da célula vegetal além da membrana plasmática é definido como o apoplasto, abrangendo a parede celular, os espaços intercelulares e o xilema20. A fase aquosa é comumente chamada de fluido de lavagem apoplasto (AWF). AWF contém moléculas secretadas pelas células para regular vários progressos biológicos, como transporte, metabolismo da parede celular e respostas ao estresse21,22. Em contraste com o TSP, os constituintes moleculares do AWF são menos complexos. A extração de proteínas recombinantes da AWF pode evitar a contaminação por proteínas intracelulares, produtos mal dobrados e remanescentes citoplasmáticos. Resumidamente, o lipídio de extração entra nas folhas através dos estômatos sob pressão negativa, e o AWF é coletado por centrifugação suave23. Embora o isolamento de AWF seja amplamente empregado para estudar o progresso biológico dentro do apoplast 24,25,26,27, ele não foi explorado em sistemas de produção baseados em plantas.
Melhorar a produtividade das plantas e obter proteínas-alvo de alta pureza são desafios centrais para os sistemas de produção de plantas28. Normalmente, as proteínas são purificadas a partir de extratos vegetais solúveis totais contendo grandes quantidades de proteínas intracelulares, produtos mal dobrados e não modificados e citocromos29, que requerem grandes custos para purificação subsequente30. O uso de métodos de extração de proteínas AWF para a extração de proteínas recombinantes exógenas secretadas em apoplasto pode efetivamente melhorar a homogeneidade das proteínas recombinantes e reduzir o custo da purificação de proteínas. Aqui, usamos um peptídeo sinal PR1a para permitir a secreção de proteínas exógenas no espaço apoplastoso e introduzimos um método detalhado para purificação de proteínas recombinantes do AWF de N. benthamiana.

<table><tbody><tr><td>100 fios de malha fina de nylon</td><td>Guangzhou Huayu Trading limited company</td><td>hy-230724-2</td><td>Para extração de proteína AWF</td></tr> tubos <tr><td>de centrífuga de 50 ml</td><td>Vazyme</td><td>TCF00150</td><td>Para centrífuga</td></tr><tr><td>ClonExpress II kit de clonagem de uma etapa</td><td>Vazyme</td><td>C112-02</td><td>Para clone</td></tr><tr><td>FastDigest Sac1</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td>Para clone</td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>NEB</td><td>FD0685</td><td>Para clone</td></tr><tr><td>ImageJ 1.5.0</td><td>/</td><td>/Para</td> <td>análise em escala de cinza</td></tr><tr><td>Filtro grande</td><td>Thermo Fisher</td><td>NEST</td><td>Para filtragem</td></tr><tr><td>Microscopia confocal de varredura a laser</td><td>Leica SP8</td><td></td><td>Para localização subcelular</td></tr><tr><td>Ni sepharose excel</td><td>Cytiva</td><td>10339806</td><td>Para purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Proteína pré-fabricada mais gel</td><td>YEASEN</td><td>36246ES10</td><td>Para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Filtro pequeno</td><td>Nalgene</td><td>1660045</td><td>Para filtragem</td></tr><tr><td>Kit de teste de substrato SuperSignal West Femto</td><td>Thermo Fisher</td><td>34076</td><td>Para western blotting</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SCR</td><td>30188928</td><td>Para configurar o tampão de extração</td></tr><tr><td>Tipo bomba de vácuo rotaryvang</td><td>Zhejiang taizhouqiujing bomba de vácuo empresa</td> <td>limitada2XZ-2</td><td>Para infiltração a vácuo</td></tr><tr><td>Misturador vertical</td><td>Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing empresa limitada</td><td>BE-1200</td><td>Para mistura</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>SIGMA</td><td>BCBK8223V</td><td>Para configurar o tampão de extração</td></tr></tbody></table>

método baseado em extração de apoplastos para melhorar a pureza da proteína recombinante produzida pela planta  

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

As plantas são um sistema de expressão eucariótico em desenvolvimento que está sendo explorado para produzir proteínas terapêuticas. A purificação de proteínas recombinantes de plantas é uma das etapas mais críticas do processo de produção. Normalmente, as proteínas foram purificadas a partir de proteínas solúveis totais (TSP), e a presença de diversas proteínas intracelulares e citocromos apresenta desafios para as etapas subsequentes de purificação de proteínas. Além disso, a maioria das proteínas terapêuticas, como antígenos e anticorpos, são secretadas para obter glicosilação adequada, e a presença de proteínas incompletamente modificadas leva a estruturas inconsistentes de antígenos ou anticorpos. Este trabalho apresenta um método mais eficaz para obter proteínas recombinantes altamente purificadas do espaço apoplástico vegetal. A proteína fluorescente verde recombinante (GFP) é projetada para ser secretada no apoplasto de Nicotiana benthamiana e é então extraída usando um método de infiltração-centrifugação. O GFP-His do apoplasto extraído é então purificado por cromatografia de afinidade de níquel. Em contraste com os métodos tradicionais do TSP, a purificação do apoplasto produz proteínas recombinantes altamente purificadas. Isso representa uma importante melhoria tecnológica para os sistemas de produção vegetal.

GFP-His é alvo de secreção no espaço apoplástico de N. benthamiana A GFP foi clonada no plasmídeo pCAMBIA1300 com um peptídeo sinal N-terminal PR1a para secreção e um His-tag C-terminal para purificação, gerando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). A proteína recombinante foi expressa transitoriamente em N. benthamiana e uma banda de 30 kDa foi detectada por western blot usando anticorpo anti-His 3 dias após a agroinfiltração (Figura 1B). A plasmólise é o tratamento das folhas usando uma solução hipertônica para separar a parede celular da membrana celular32. Para determinar se a GFP está localizada no apoplasto, usamos sacarose a 30% para fazer a plasmólise das folhas. A microscopia de fluorescência ilustrou a presença de GFP-His no apoplasto (Figura 1C). As proteínas AWF extraídas por infiltração-centrifugação a vácuo também continham GFP-His (Figura 1D). Esses resultados demonstram a secreção de GFP-His no AWF das folhas de N. benthamiana , das quais pode ser extraído para purificação a jusante.
Purificação de proteínas a partir de AWF A eficácia da extração de AWF influencia fortemente o rendimento final de GFP. Com base nos protocolos de extração AWF publicados 24,25,26,27, testamos várias soluções para otimizar a recuperação de GFP-His secretados. Aqui, oito soluções de extração foram examinadas: 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM NaCl (pH 7,1), 40 mM KCl (pH 7,0), 20 mM CaCl2 (pH 5,7), 100 mM PB (pH 7,0), 10 mM MES (pH 5,6) e ddH2O (pH 7,0). PB extraiu a maior quantidade de AWF e GFP-His, excedendo outras soluções em mais de 4x (Figura 2A,B). A comparação de PB em pH variável revelou melhor extração AWF e GFP-His em condições neutras a levemente alcalinas (pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,0; Figura 2C,D). Além disso, PB com concentrações de 50 mM, 100 mM e 150 mM foram comparados quanto à eficácia da extração. Os resultados indicaram que o PB de 100 mM mostrou eficácia máxima para recuperar AWF e GFP-His (Figura 2E, F).
Com base nesses experimentos de otimização, 100 mM PB, pH 7,0, foi selecionado para extração AWF em larga escala de N. benthamiana. Usando este tampão, 495 μg de proteínas AWF totais por grama de material foliar fresco foram recuperados do apoplasto ( Figura 2G ). O AWF extraído continha 10 μg de GFP-His (Figura 2H), o que correspondia a aproximadamente 18% do total de GFP-His no TSP (Figura 2I). Após a cromatografia de afinidade com Ni, a pureza GFP-His atingiu 84,3% da extração de AWF, substancialmente maior do que a pureza de 44,9% alcançada por meio da extração de proteína solúvel total ( Figura 2J ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66852/66852fig01.jpg"> Figura 1: GFP-His é alvo de secreção no apoplasto de N. benthamiana. (A) Esquema da construção PR1a-GFP-His no vetor de expressão da planta pCAMBIA1300. (B) Western blot detectando a produção de GFP-His em N. benthamiana. Aqui, 10 μL de amostras de proteína foram carregadas e detectadas. As folhas de N. benthamiana injetadas simultaneamente com MMA foram utilizadas como controle negativo. O mesmo volume de amostras foi examinado e corado usando subunidades grandes da planta como controle de carga (C) Microscopia confocal mostrando a localização subcelular de GFP-His (verde). As folhas de N. benthamiana foram plasmolizadas com 30% de sacarose. Linhas tracejadas brancas indicam a membrana plasmática. As setas vermelhas denotam acúmulo de GFP-His no apoplasto. (D) Western blot demonstrando a presença de GFP-His no fluido apoplástico extraído. Aqui, 10 μL de amostras de proteína foram carregadas e detectadas. As folhas de N. benthamiana injetadas simultaneamente com MMA foram utilizadas como controle negativo. Abreviaturas: 35s = 2x promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35s; PR1a = peptídeo sinal da proteína 1a relacionada à patogênese do tabaco ; Sua = 6x Sua etiqueta; Nos = terminador da nopalina sintase. BS = antes da plasmólise; PS = pós-plasmólise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66852/66852fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66852/66852fig02.jpg"> Figura 2: Otimização do método de extração de proteínas de AWF. (AB) Extração de proteínas de AWF usando diferentes tampões. Oito soluções foram testadas para extração de proteínas de AWF: 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM NaCl (pH 7,0), 40 mM KCl (pH 7,0), 20 mM CaCl2 (pH 5,7), 100 mM PB (pH 7,0), 10 mM MES (pH 5,6) e ddH2O (pH 7,0). A eficiência de extração foi analisada por SDS-PAGE (A), e GFP-His foi detectada por western blotting usando anticorpo anti-His (B). (CD) Extração usando PB em diferentes valores de pH. PB com pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,0 foi utilizado para extração de AWF. A eficiência de extração foi detectada por SDS-PAGE (C), e GFP-His foi detectada por western blotting com anticorpo anti-His (D). (E-F) Extração usando PB em diferentes concentrações. PB a 50 mM, 100 mM e 150 mM foram usados para extração de AWF. A eficiência de extração foi analisada por SDS-PAGE (E), e GFP-His foi detectada por western blotting com anticorpo anti-His (F). (G-H) Análise quantitativa de proteínas extraídas. As proteínas foram extraídas usando 100 mM PB (pH 7,0). A proteína solúvel total (G) e GFP-His (H) foram quantificadas para análise estatística. (I) Análise estatística da proporção de GFP AWF em relação à GFP total. (J) Purificação de GFP-His a partir de proteínas solúveis totais de N. benthamiana ou AWF. As proteínas foram extraídas usando 100 mM PB (pH 7,0) e GFP-His foi purificado por cromatografia de afinidade Ni. A purificação foi analisada por SDS-PAGE. A faixa mais à direita é o padrão BSA de 1 μg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66852/66852fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A purificação de proteínas recombinantes de sistemas vegetais é geralmente desafiada por proteínas vegetais. Este trabalho fornece um método para extrair e purificar efetivamente uma proteína recombinante secretada do apoplasto de Nicotiana benthamiana.

Método baseado em extração de apoplastos para melhorar a pureza da proteína recombinante produzida pela planta  

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