Name: Transformação mitocondrial em Baker (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a transformação mitocondrial em leveduras para estudar síntese proteica e bioenergética usando Saccharomyces cerevisiae. Este método revela mecanismos moleculares essenciais para a pesquisa em biologia celular.

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Esta publicação foi financiada pelo Programa de Apoio a Projetos de Investigação e Inovação Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 a XP-M]. UPD é um membro do CONAHCYT (CVU:883299). Queremos agradecer à Dra. Ariann Mendoza-Martínez pela ajuda técnica com as imagens do microscópio óptico. Licenças de biorender: DU26OMVLUU (Figura 2); BK26TH9GXH (Figura 3); GD26TH80R5 (Figura 4); PU26THARYD (Figura 7); ML26THAIFG (Figura 9).

NOTA: Recomendamos fazer seis transformações para cada construção, pois a eficiência da transformação mitocondrial geralmente é baixa. A composição dos diferentes meios de crescimento é mostrada na Tabela 2.
1. Preparação de partículas de tungstênio
<ol><li>Pesar 30 mg de partículas de tungstênio de 0,7 μm (WPs, microtransportadores) em um microtubo. Adicione 1,5 mL de etanol a 70% (EtOH) para esterilizar. Vortex os WPs e deixe-os descansar por 10 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugue a 13.200 x g por 15 min em temperatura ambiente. Lave os WPs adicionando 1,5 mL de água estéril às partículas, agitando-as e centrifugando a 13.200 × g por 15 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 500 μL de glicerol estéril a 50% (a concentração final é de 60 μg de WPs/μL). NOTA: Os WPs podem ser armazenados a -20 °C por pelo menos 6 meses. Desse estoque, pegue a quantidade necessária para seis transformações (100 μL).</li>
</ol>2. Revestimento de DNA WPs
<ol><li>Adicionar 5 μg do plasmídeo de 2 μ e 15 μg do plasmídeo bacteriano que contém a sequência mitocondrial a um microtubo sobre gelo. NOTA: O volume final não deve exceder 50 μL para evitar diluir ainda mais os reagentes necessários para o revestimento de DNA.</li>
	<li>Adicione 100 μL da suspensão WP e vórtice por 5 s (6 mg de WPs).</li>
	<li>Adicione 4 μL de espermidina 1 M. Breve vórtice.</li>
	<li>Adicione 100 μL de CaCl2,5 M 2 gelado, brevemente vórtice. Incubar no gelo por 10 min; Brevemente vórtice a mistura a cada 3 min. NOTA: A solução de CaCl2 é esterilizada por filtro e não deve ser autoclavada.</li>
	<li>Centrifugar os WP durante 30 s a 13,200 × g a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Lave as partículas ressuspendendo-as suavemente em 200 μL de EtOH a 100% a -20 °C.</li>
	<li>Centrifugar os WP durante 30 s a 13,200 × g a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Repita a lavagem.</li>
	<li>Ressuspenda os WPs em 60-70 μL de temperatura ambiente 100% EtOH usando uma ponta de pipeta; não vórtice. NOTA: Para garantir a qualidade dos plasmídeos, o revestimento de DNA deve ser realizado no mesmo dia da transformação biolística.</li>
</ol>3. Preparação de material biolístico
<ol><li>Antes do bombardeio, esterilize seis suportes de macroportadores (Figura 5) em uma autoclave e seque-os completamente. Como alternativa, mergulhe-os em EtOH e esterilize-os usando uma chama com a ajuda de uma pinça. Coloque-os em uma placa de vidro estéril.</li>
	<li>Durante a precipitação de DNA (10 min de incubação no gelo na etapa 2.4), insira seis macrotransportadores (ou discos voadores) em cada um dos seis suportes de macrotransportadores com a ajuda de pinças estéreis. NOTA: Não esterilize os macrocarriers.</li>
	<li>Misture os WPs revestidos de DNA com a pipeta. Adicione 10 μL de WPs a cada superfície macrotransportadora e distribua por toda a superfície com a ponta da pipeta. Se necessário, adicione alguns microlitros extras de 100% de EtOH à superfície do macrotransportador para fazer uma distribuição uniforme dos WPs. Deixe a suspensão secar à temperatura ambiente por ~20 min.</li>
</ol>4. Preparação de células de levedura e placas de bombardeio
<ol><li>Inocular a cepa do receptor rho0 em 2 mL de meio YPR (Tabela 2). Crescer durante uma noite a 30 °C numa roda rotativa.</li>
	<li>Diluir 300 μL da cultura em 30 ml de meio YPR fresco. Cultivar a 30 °C e 200 rpm num agitador rotativo durante duas noites até que a cultura esteja saturada.</li>
	<li>Centrifugue as células de levedura a 600 × g por 5 min em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células de levedura em 600 μL de meio YPD (Tabela 2).</li>
	<li>Usando uma alça de vidro estéril, espalhe 100 μL da suspensão de células de levedura em uma placa média de bombardeio sólido. NOTA: O meio de bombardeio não deve ter o marcador de seleção do plasmídeo de 2 μ que será usado para transformação.</li>
	<li>Repita a etapa 4.4 para as outras cinco placas.</li>
	<li>Incube por 1-3 h em temperatura ambiente antes do bombardeio para garantir que o meio líquido seja completamente absorvido na superfície da placa.</li>
</ol>5. Geração de uma cepa sintética por transformação biolística
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ler o manual do usuário do equipamento biolístico. Descreveremos o protocolo do equipamento referenciado (Tabela de Materiais e Figura 5).
<ol><li>Limpe a câmara do sistema de entrega de partículas biolísticas com etanol 70% para evitar contaminação e deixe repousar por pelo menos 10 min. Pouco antes do bombardeio, limpe a superfície com uma toalha de papel limpa.</li>
	<li>Abra as válvulas do tanque de hélio para definir cerca de 2.000 psi.</li>
	<li>Ligue o equipamento e ligue a fonte de vácuo.</li>
	<li>Usando uma pinça, coloque o macrotransportador voltado para baixo no suporte do macrotransportador. NOTA: Não use a tela de parada que acompanha o equipamento.</li>
	<li>Aparafuse a tampa do macrotransportador na parte superior do macrotransportador. Todas as peças juntas constituem o sistema de lançamento do microporta-aviões (Figura 5).</li>
	<li>Coloque o sistema de lançamento do microtransportador dentro da câmara de vácuo no quinto nível a partir da parte inferior.</li>
	<li>Coloque uma das placas contendo o gramado de deformação rho0 no segundo nível a partir do fundo da câmara. Certifique-se de que a placa esteja voltada para cima e sem a tampa.</li>
	<li>Usando uma pinça estéril, coloque um disco de ruptura na tampa de retenção. Aparafuse a tampa de retenção no tubo de aceleração; Certifique-se de que a tampa de retenção esteja firme. NOTA: Não trate os discos rompidos com isopropanol conforme sugerido no manual, pois observamos que a eficiência da transformação diminui.</li>
	<li>Feche a porta da câmara de vácuo.</li>
	<li>Coloque a chave VAC/VENT/HOLD na posição VAC . Quando o vácuo de 25-28 inHg for atingido, mude a chave VAC/VENT/HOLD para a posição HOLD . NOTA: Esteja ciente de que o vácuo alcançável pode variar de acordo com o nível do mar. Obtivemos sucesso chegando a 25 inHg.</li>
	<li>Pressione o botão FIRE para disparar os WPs. Espere que a pressão aumente no tubo de aceleração até atingir 1,300 psi, quando o disco de ruptura quebrará, fazendo um som pop.</li>
	<li>Imediatamente após a quebra do disco de ruptura, o interruptor FIRE e o vácuo são liberados alterando o interruptor VAC/VENT/HOLD para a posição VENT .</li>
	<li>Com cuidado, com pinça estéril, remova quaisquer detritos do disco de ruptura presentes na superfície da placa e cubra a placa com a tampa.</li>
	<li>Repita o procedimento para as cinco placas restantes, colocando um novo disco de ruptura e macrotransportador em cada rodada.</li>
	<li>No final, feche a válvula principal do tanque de hélio.</li>
	<li>Feche a câmara e construa um vácuo colocando a chave VAC/VENT/HOLD na posição VAC . Libere o sistema de qualquer pressão de hélio pressionando e soltando o interruptor FIRE algumas vezes. Repita com a porta aberta.</li>
	<li>Desligue a bomba de vácuo e o equipamento de bombardeio.</li>
	<li>Limpe o sistema de entrega com 70% de EtOH. Lave os suportes do macrotransportador com uma solução SDS a 0,1%; enxágüe com água destilada estéril e 100% de EtOH.</li>
</ol>6. Seleção sintética de colônias de rho-
<ol><li>Incubar as placas de bombardeio durante 5-7 noites a 30 °C. NOTA: É importante verificar diariamente se as placas estão contaminadas. Se necessário, a região contaminada pode ser cortada com uma espátula estéril para evitar mais contaminação.</li>
	<li>Inocular a estirpe de teste do tipo de acasalamento oposto em 2 ml de meio YPD durante a noite (ver o exemplo específico na Figura 2D,E).</li>
	<li>Inocular 150 μL da cultura de cepas do testador em uma placa YPD. Usando uma alça de vidro estéril, espalhe o testador uniformemente na superfície da placa. Deixe o prato secar por pelo menos 5 min.</li>
	<li>Faça réplicas das placas de bombardeio usando almofadas de veludo e um carimbo replicador.<ol><li>Replicar numa placa de meio de dropout correspondente ao marcador de auxotrofia plasmídica de 2 μ transformado. O crescimento leva uma incubação durante a noite a 30 °C. Em seguida, conservar a 4 °C até nova utilização. Esta placa é a placa mestra.</li>
		<li>Replique na placa YPD que contém o gramado do testador da etapa 6.3. Incubar a 30 °C durante duas noites. Em seguida, replique esta placa no meio seletivo para detectar a presença do gene mitocondrial de interesse, por exemplo, meio respiratório ou meio sem arginina, e incube durante a noite a 30 ° C. Apenas as células que abrigavam o plasmídeo bacteriano sintético nas mitocôndrias crescerão no meio seletivo após o acasalamento com a cepa testadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifique na placa mestra (etapa 6.4.1) as colônias correspondentes que cresceram na etapa 6.4.2. NOTA: Como a placa de bombardeio (e, portanto, a placa mestra) está repleta de colônias transformantes, pode ser difícil identificar as colônias positivas observadas na placa de acoplamento do testador. Por esse motivo, é altamente recomendável desenhar algumas pequenas linhas de cada lado de todas as placas com um marcador permanente. Desenhe linhas semelhantes no anel do selo replicante. Essas linhas serão úteis para orientar e localizar colônias positivas na placa mestre (veja o exemplo na Figura 2D).</li>
	<li>Purifique as colônias positivas listrando-as da placa mestre para uma segunda placa de saída seletiva, como na etapa 6.4.1. Incubar durante duas noites a 30 °C. NOTA: É essencial que o streaking permita o crescimento de colônias únicas para garantir uma cepa pura.</li>
	<li>Repita o processo de seleção (etapas 6.2-6.5) para confirmar a presença do plasmídeo bacteriano nas mitocôndrias. NOTA: Normalmente, esse processo pode ser repetido mais duas vezes para selecionar cepas de rho- sintéticas estáveis.</li>
	<li>Uma vez que a cepa sintética mantém de forma estável o DNA do plasmídeo nas mitocôndrias, selecione 3-5 colônias positivas diferentes e inocule-as em 2 mL de YPD. Utilizar esta cultura para preparar um stock criovídico (misturando 600 μL de cultura e 600 μL de glicerol a 50% para conservar a -70 °C) e para inserir a sequência plasmidial no mtDNA de interesse por citoducção (passo 6.7). NOTA: Como não há pressão seletiva para manter o plasmídeo transformado nas mitocôndrias da cepa de rho sintética, o plasmídeo pode ser facilmente perdido. Portanto, recomendamos fazer a citodução o mais rápido possível.</li>
</ol>7. Integração da construção presente na cepa sintética de rho- no local alvo no genoma mitocondrial por citoducção
<ol><li>Inocular dois tubos com 3 mL de meio YPD, um com as células doadoras (células rho sintéticas) e outro com as células aceptoras (célula de levedura onde a construção final é esperada). Incubar durante a noite a 30 °C.</li>
	<li>Misture 750 μL da cepa do doador e 250 μL da cepa do receptor em um microtubo estéril (proporção de 3:1).</li>
	<li>Centrifugue a mistura por 1 min a 13.200 × g; descarte o sobrenadante. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL com a extremidade cortada, pegue uma gota do pellet celular e coloque-o em uma placa YPD. Incubar a 30 °C durante 2-4 h. NOTA: Para evitar contaminação cruzada, não coloque mais de duas suspensões de células em uma única placa (veja o example na Figura 4A).</li>
	<li>Pegue uma pequena quantidade da mistura de células, ressuspenda-a em 15 μL de água estéril em uma lâmina e coloque uma lamínula. Verifique sob um microscópio óptico a presença de shmoos com objetiva de 40x ou 100x; essa forma característica aparece quando dois tipos de acoplamento estão presentes (Figura 3B).</li>
	<li>Se shmoos estiverem presentes, ressuspenda uma pequena quantidade (~ 0,5 mm3) da massa celular em 2 mL de meio YPD. Incubar durante 2 h a 30 °C numa roda rotativa para permitir a recuperação dos zigotos binucleares.</li>
	<li>Vortex a mistura e diluir 10 μL da suspensão celular em 990 μL de água estéril (diluição 1:100). Use esferas de vidro ou uma alça de vidro estéril para espalhar 100 μL da diluição celular em um meio de gota onde apenas a cepa aceptora (e diplóides esporádicos) crescem. Incube por 2-3 noites a 30 °C.</li>
	<li>Replique as colônias resultantes no meio seletivo necessário, conforme explicado na introdução (estágio 4; consulte a Figura 4C para um exemplo específico).</li>
	<li>Após a identificação das colônias positivas, coloque-as novamente no mesmo meio seletivo para purificar a cepa haplóide que carrega o mtDNA de interesse.</li>
	<li>Selecione pelo menos duas colônias positivas e cultive-as em 2 mL de meio YPD a 30 ° C durante a noite. Faça um backup criogênico misturando 600 μL de glicerol a 50% com 600 μL da cultura YPD saturada. Conservar a -70 °C.</li>
	<li>Isole o DNA das cepas resultantes 31,32. Amplificar a região desejada por PCR e sequenciar para confirmar a presença da mutação mitocondrial. NOTA: Cada colônia positiva é uma réplica técnica que deve ser confirmada independentemente para garantir a sequência correta no genoma mitocondrial.</li>
</ol>

Transformação Biolística de Mitocôndrias de Levedura para Análise Mutagenética

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<li>Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrially+synthesized+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+and+Cox3p+depends+on+targeting+information+in+untranslated+portions+of+their+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs.</a> EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O presente trabalho descreveu como transformar mitocôndrias da levedura S. cerevisiae com sucesso. O processo, desde o bombardeio de microprojéteis de alta velocidade até a purificação da cepa de levedura pretendida, leva ~ 8-12 semanas, dependendo de quantas rodadas de purificação da cepa de rho- sintética são necessárias. Algumas das etapas críticas do método são as seguintes. Primeiro, quanto maiores as regiões flanqueadoras adicionadas ao redor do local da mutação na construção do gene mitocondrial, maior a probabilidade de integração bem-sucedida da mutação alvo. O tamanho mínimo das regiões flanqueadoras é de ~100 nt; No entanto, o uso de mais de 500 NT em cada lado da mutação é altamente recomendado. Em segundo lugar, ao selecionar as colônias rho sintéticas após a transformação, recomenda-se que não ocorram mais do que 3-4 rodadas de purificação; caso contrário, há um alto risco de que eventualmente a construção mitocondrial seja perdida, pois não há pressão seletiva para manter o plasmídeo nas mitocôndrias. Terceiro, para evitar prejudicar o usuário ou o equipamento, você deve ler atentamente o manual da máquina de bombardeio antes de iniciar o procedimento. Este equipamento é delicado e utiliza alta pressão e vácuo.
Uma limitação desse procedimento é que, até o momento, apenas leveduras e a alga verde C. reinhardtii são candidatas a transformar mitocôndrias com esse método. Seria relevante se pudéssemos introduzir mutações dirigidas ao local no genoma mitocondrial de outros organismos. Outra limitação é que é desafiador transformar muitas construções diferentes na mesma sessão. Recomenda-se fazer seis transformações para cada construção, cada uma das quais deve ser testada, selecionada e purificada. Isso resulta em mais de 50 placas de meio apenas para obter colônias de rho puras de uma única mutação mitocondrial.
Apesar dessas limitações, a capacidade de manipular o genoma mitocondrial da levedura contribuiu significativamente para a compreensão de muitas vias de biogênese de complexos respiratórios. Essa abordagem pode ser usada para introduzir genes repórteres para monitorar e quantificar a tradução mitocondrial 1,7,36,37, interromper genes mitocondriais 38, identificar chaperonas de montagem de complexos respiratórios39, entender melhor os mecanismos de tradução e montagem mitocondrial acoplada 7,11,12,36e procurar supressores ao seguir a expressão de um gene mitocondrial mutado40. Até agora, embora certas abordagens para manipular o genoma mitocondrial em mamíferos tenham sido relatadas anteriormente41, não existe nenhum método generalizado para transformar o DNA mitocondrial para esses organismos.

<table><tbody><tr><td>Ponteiras de pipeta de 1 mL</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Microtubo</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; Ponteiras de pipeta L</td><td>Axygen</td><td>T-10-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubo inferior cônico</td><td>Axygen</td><td>SCT-25ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; Ponteiras de pipeta L</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>50 mL fundo cônico</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>AfiII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>OHAUS</td><td>ARA520</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>TOMY</td><td>ES-315</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Bacto</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de macroportador biolisítico</td>Bico de Bunsen <td>BIO-RAD</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89038-528</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0049</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ARG</td><td>Formedium</td><td>DCS0059</td><td></td></tr><tr><td>CSM -LEU</td><td>Formedium</td><td>DCS0099</td><td></td></tr><tr><td>CSM -URA</td><td>Formedium</td><td></td><td></td>DCS0169</tr><tr><td>Frasco de vidro de cultura</td><td>KIMAX KIMBLE</td><td>25615</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidro de cultura</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>BD</td><td>215520</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>JT Baker&nbsp;</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Millipore</td><td>620006</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro</td><td>Sigma</td><td>Z265926</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de vidro</td><td>Sigma</td><td>S4647</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>JT BAKER</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de hélio grau 5 (99,99 %)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HSTaq&nbsp; Kit</td><td>PCR BIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugue</td><td>Eppendorf</td><td>022620100</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>New Brunswick scientific</td><td>NB-G25</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000 / He TM Sistema de entrega de partículas biolísticas</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (100X10)</td><td>BD</td><td>252777</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Rafinose</td><td>Formedium</td><td>RAF03</td><td></td></tr><tr><td>Replica plater</td> Discos <td>de ruptura Z363391</td><td></td><td>Scienceware</td></tr><tr><td>1350 Psi</td><td>BIO-RAD</td><td>1652330</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de Cultura de Tecidos</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882015</td><td></td></tr><tr><td>Microcarriers de tungstênio M10</td><td>BIO-RAD</td><td>1652266</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo de capacidade de 100L / min</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Almofadas de veludo</td><td>Bel-Art</td><td>H37848-0002</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice&nbsp;</td><td>Scientifc Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de madeira em bastão</td><td>PROMA</td><td>1820060</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Levedura Base de nitrogênio sem aminoácidos</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr></tbody></table>

transformação mitocondrial em baker

Mitochondrial Transformation in Baker&#39;s Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly

A levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada para entender a biologia mitocondrial há décadas. Este modelo forneceu conhecimento sobre vias mitocondriais essenciais e conservadas entre eucariotos e fungos ou vias específicas de leveduras. Uma das muitas habilidades de S. cerevisiae é a capacidade de manipular o genoma mitocondrial, o que até agora só é possível em S. cerevisiae e na alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. A transformação biolística das mitocôndrias de levedura nos permite introduzir mutações dirigidas ao local, fazer rearranjos genéticos e introduzir repórteres. Essas abordagens são usadas principalmente para entender os mecanismos de dois processos altamente coordenados nas mitocôndrias: tradução por mitorribossomos e montagem de complexos respiratórios e ATP sintase. No entanto, a transformação mitocondrial pode potencialmente ser usada para estudar outras vias. No presente trabalho, mostramos como transformar mitocôndrias de leveduras por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade, selecionar e purificar o transformante pretendido e introduzir a mutação desejada no genoma mitocondrial.

Esta seção apresenta alguns resultados representativos dos diferentes estágios da transformação mitocondrial. A Figura 6 mostra um procedimento de bombardeio. As células rho sintéticas carregavam um plasmídeo bacteriano com o gene repórter ARG8m, que substituirá a sequência codificadora de um gene mitocondrial (Figura 6A). Após o bombardeio, a placa foi replicada em um meio sem uracila (-URA); esta é a placa mestra (Figura 6B). As colônias em crescimento possuem o vetor de expressão de levedura com o marcador de auxotrofia URA3 . De acordo com a seção 6 do protocolo, a placa de bombardeio também foi replicada em um meio YPD contendo um gramado da cepa do testador. Nesse caso, a cepa testadora abrigava um alelo defeituoso do gene ARG8m no genoma mitocondrial (ARG8m-1)1. Após 2 noites de incubação, o gramado do testador e as células transformadoras se acasalaram e as mitocôndrias se fundiram. Esta placa foi replicada em um meio sem arginina. Apenas os diplóides contendo o plasmídeo mitocondrial foram capazes de crescer neste meio seletivo porque o gene ARG8m presente na cepa sintética substituiu o ARG8m-1 defeituoso do genoma mitocondrial da cepa testadora. 
O número de colônias positivas geralmente varia de zero a 20 por placa. No presente exemplo, foram obtidas quatro colônias sintéticas positivas de rho, que foram purificadas listrando-as em meio sem uracila. Na primeira rodada de purificação, muitas colônias negativas foram obtidas junto com as positivas. No entanto, após duas ou três rodadas de purificação, é possível obter a cepa sintética positiva pura. Na Figura 6C, mostramos algumas colônias de rho sintéticas positivas após três rodadas de purificação e teste. A maioria das colônias da placa mestre -URA são positivas para a sonda testadora. Curiosamente, nem todas as células de uma colônia positiva contêm o plasmídeo mitocondrial, indicando que o plasmídeo transformado foi perdido em uma população da colônia. Esse resultado é esperado, pois não há pressão seletiva para manter o plasmídeo mitocondrial, tornando-o instável. No entanto, uma cepa de rho- sintética como as mostradas na Figura 6C pode ser levada para a próxima etapa, citoducção (seção 7 do protocolo), e usada para preparar o estoque a ser armazenado a -70 ° C. A Figura 6D também mostra a terceira rodada de purificação de uma cepa de rho- sintética. No entanto, neste caso, como os transformantes eram praticamente incapazes de manter o plasmídeo mitocondrial, eles foram descartados.
Descrevemos uma estratégia geral para selecionar colônias de rho sintéticas positivas, que é apresentada na Figura 7A. Neste caso, a construção mitocondrial presente nas células rho sintéticas tem várias centenas de nucleotídeos para se recombinar com o DNA mitocondrial da cepa testadora (por exemplo, a construção COX1ΔC15 na cepa rho sintética se recombina com o gene mutado cox1D369N no DNA mitocondrial do testador (Figura 2D); ou a construção cox1Δ::ARG8m na cepa rho sintética com o gene mutado ARG8m-1 no DNA mitocondrial do testador (Figura 6A). No entanto, se não houver disponibilidade de uma cepa de teste para selecionar as células rho sintéticas positivas de interesse, há uma abordagem indireta para selecioná-las 33. Nesse caso, o plasmídeo bacteriano também deve conter um fragmento de um gene mitocondrial, como COX2 ou COX3. A cepa do testador contém uma cópia não funcional do gene mitocondrial cox2 ou cox3 . No exemplo dado, a sequência do fragmento cox3 presente no plasmídeo bacteriano pode complementar a sequência cox3 presente nas mitocôndrias do testador e, após a recombinação, fornecer um gene COX3 funcional. Depois de cruzar as células rho sintéticas com a cepa testadora, os diplóides podem respirar apenas se as células rho sintéticas contiverem o plasmídeo bacteriano dentro das mitocôndrias (Figura 7B).
A Figura 8 exemplifica o processo de citodução. As cepas doadora e receptora possuem auxotrofia de leucina e adenina, respectivamente. Assim, após a citação, a mistura foi plaqueada em um meio sem leucina, impedindo o crescimento das células doadoras. Esta é a placa mestra. Neste ponto, apenas haploides com o fundo nuclear da cepa aceptora e diplóides esporádicos crescerão. Para descartar diplóides, a placa mestra foi replicada em meios sem adenina, onde apenas diplóides podem crescer. Neste exemplo, o DNA mitocondrial resultante após a citoducção é mutado e os haplóides pretendidos não podem crescer no meio respiratório de etanol / glicerol. Portanto, a placa mestre precisa ser replicada em placas YPD com um gramado de uma cepa de testador. A posição dos diplóides respiratórios positivos indica quais colônias purificar da placa mestra. Duas rodadas de purificação são necessárias para obter a cepa final pura. A integração mitocondrial é geralmente corroborada pela amplificação por PCR da região circundante de interesse e sequenciamento.
Finalmente, os genes podem ser inseridos no locus específico do genoma mitocondrial. Por exemplo, os genes repórteres podem ser inseridos na extremidade 3 'da sequência de codificação de um gene mitocondrial ou substituir a região codificadora do gene mitocondrial, entre outras opções (Figura 9A). No entanto, os genes também podem ser inseridos em locais ectópicos dentro de regiões não codificantes do genoma mitocondrial. O local comumente usado é 295 nt a montante do códon de início do gene COX2 . A alteração nessa região não codificante é inócua13. Para expressar com sucesso o gene no sítio ectópico, ele deve ser flanqueado por um promotor e terminador mitocondrial. As sequências flanqueadoras de COX2 são as mais ideais, uma vez que COX2 é o gene mitocondrial com as sequências não traduzidas 5 'e 3' mais curtas (73 nt do 5 'UTR e 119 nt do 3' UTR) ( Figura 9B ). Para esta construção, o plasmídeo bacteriano tem as seguintes características: o molde é um plasmídeo que contém a região codificadora COX2 , com 1120 nt a jusante do códon de parada e 670 nt a montante do códon de início AUG , denominado pXPM5025. O gene de interesse é projetado para ser flanqueado por 73 nt do COX2 5'-UTR e 119 nt do COX2 3'-UTR. Posteriormente, foi inserido, conforme indicado anteriormente, a 295 nt a montante do códon inicial COX2 AUG, que é uma região não codificante (Figura 9B). Observe que este plasmídeo e, conseqüentemente, no genoma mitocondrial resultante, os UTRs COX2 5 'e 3' são duplicados. Após o bombardeio deste plasmídeo, as células rho sintéticas são acasaladas para citoducção com uma cepa receptora que possui uma extensa deleção da região COX2 (alelo cox2-62 )1. Durante a citodção, o plasmídeo mitocondrial da cepa rho sintética se recombina com o DNA mitocondrial do aceptor. O genoma mitocondrial resultante tem a construção ectópica e um gene WT COX2 . Portanto, as colônias positivas poderão crescer em meio respiratório (Figura 9B).
<img alt="Diagrama do sistema de lançamento de microtransportadores, configuração de pressão de hélio, placa de amostra, tubo de aceleração." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66856/66856fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Representação esquemática do equipamento de bombardeio de microprojéteis de alta velocidade. Nosso laboratório usa o Sistema de Entrega de Partículas Biolistic-PDS-1000 / He (Tabela de Materiais). Abreviatura: WPs = partículas de tungstênio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66856/66856fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de transformação de levedura e resultados de placa de Petri mostrando a funcionalidade do gene ARG no mtDNA sintético." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66856/66856fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Exemplo de uma placa de transformação de microprojéteis de alta velocidade. (A,B) Após o bombardeio, as placas foram incubadas por 5-7 noites a 30 °C. Se um contaminante crescer (indicado por uma seta azul), ele pode ser cortado com uma espátula estéril. Depois de replicar as placas no meio marcador de seleção (-URA neste caso), a placa mestra também foi testada quanto à presença do plasmídeo mitocondrial por acoplamento a uma cepa de teste. Nesse caso, a cepa do testador tem o alelo não funcional ARG8m-1 1. Após o acasalamento por 2 noites e a replicação da placa em um meio sem arginina (-ARG), surgiram quatro colônias positivas (indicadas com setas vermelhas). (C) As colônias de rho sintéticas positivas foram purificadas por recolocação em meio -URA, e o teste de réplica foi realizado conforme descrito anteriormente. Essas placas representam a terceira rodada de purificação. (D) Algumas colônias de rho sintéticas positivas perderam a construção mitocondrial. Abreviaturas: mtDNA = DNA mitocondrial; -URA = falta de uracila; -ARG = falta de arginina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66856/66856fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama do processo de integração do plasmídeo bacteriano; transferência de genes para mtDNA; conceito de engenharia genética." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66856/66856fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figura 7: Diagrama mostrando como selecionar colônias de rho sintéticas positivas após o bombardeio. (A) O plasmídeo bacteriano contém uma versão mutada não funcional de um gene mitocondrial. Para detecção, as colônias sintéticas de rho são acasaladas a uma cepa de teste contendo uma mutação não funcional diferente do mesmo gene no DNA mitocondrial. Após o acasalamento, os mtDNAs mutantes se recombinam e um gene funcional pode ser recuperado por complementação. Aqui, o diplóide cresce em um meio seletivo onde nem a cepa sintética nem o testador podem crescer. (B) Neste caso, o plasmídeo contém uma sequência adicional de um gene mitocondrial (ou seja, um pedaço de COX3). Após a transformação, a cepa sintética de rho- é selecionada por sua capacidade de complementar uma mutação COX3 na cepa testadora, de modo que apenas os diplóides podem crescer em um meio seletivo (ou seja, meio respiratório). Este método é útil se uma cepa de teste para o gene de interesse não estiver disponível. A detecção de colônias de rho sintéticas positivas neste caso é indireta. Abreviatura: mtDNA = DNA mitocondrial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66856/66856fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Experimento em placa de Petri; processo de citodução; observação do crescimento de leveduras; avaliação da transferência genética." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66856/66856fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figura 8: Exemplo de citodução para integrar uma construção no locus alvo no DNA mitocondrial. Após o acasalamento e recuperação, as células mistas e os zigotos binucleares foram plaqueados em um meio sem leucina. Nesse caso, como a cepa doadora possui o alelo leu2,3-112, esse meio impede o crescimento do doador. Esta placa foi replicada no mesmo meio (placa mestra), em um meio onde apenas diplóides podem crescer (-ADE) e em um meio onde o aceptor com a mutação pretendida pode crescer (setas vermelhas). Nesse caso, nem o doador nem as células receptoras podem crescer em meios respiratórios. Apenas o diplóide resultante após o acasalamento com um gramado de uma cepa de teste pode crescer em um meio respiratório. Essas colônias diplóides respiratórias são um guia para selecionar e purificar as colônias positivas da placa mestra. Abreviaturas: -LEU = falta de leucina; -ADE = falta de adenina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66856/66856fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de transferência de genes mitocondriais com doador rho sintético para processo aceitador de mtDNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66856/66856fig09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> Figura 9: Diagrama mostrando como integrar a construção mitocondrial mutada (presente na cepa rho- sintética) na cepa aceitadora. (A) Neste exemplo, a cepa aceptora carrega o gene repórter ARG8 m que substitui os códons do gene de interesse. O rho-DNA sintético contém uma versão mutada deste gene. O plasmídeo e o DNA mitocondrial se recombinam através das regiões flanqueadoras 5 'e 3', e o repórter ARG8m é substituído pela sequência mutada do gene de interesse. (B) Genes estranhos podem ser inseridos ectopicamente em regiões específicas do genoma mitocondrial 7,13,36. Neste exemplo, um gene pode ser introduzido em uma posição 295 nt a montante do gene COX2. Esta é uma região não codificante do mtDNA. Um gene estranho de interesse é flanqueado por 73 nt e 119 nt do COX2 5 'UTR e 3' UTR, respectivamente. Esta construção é inserida em um plasmídeo contendo o gene COX2 mais 670 nt e 1120 nt das regiões 5' e 3' UTR. A cepa sintética (doador) carrega essa construção nas mitocôndrias. Nesse caso, a cepa aceptora (XPM13)7 tem uma deleção significativa do gene cox2 (alelo cox2-62)1. Após a citação, o DNA mitocondrial do doador e do aceitador se recombina. O gene COX2 é restaurado e o gene de interesse é inserido no local ectópico (295 nt a montante do gene COX2). Abreviaturas: mtDNA = DNA mitocondrial; nt = nucleotídeos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66856/66856fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cepa de levedura</td>
			<td colspan="3">Genótipo</td>
			<td>REF</td>
		</tr><tr><td>NAB69</td>
			<td colspan="3">Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>NB71</td>
			<td colspan="3">Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>XPM10b</td>
			<td colspan="3">Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>XPM209</td>
			<td colspan="3">Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)</td>
			<td>26</td>
		</tr><tr><td>XPM199</td>
			<td colspan="3">Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)</td>
			<td>26</td>
		</tr><tr><td>XPM13</td>
			<td colspan="3">Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>L45</td>
			<td colspan="3">Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)</td>
			<td>28</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Exemplos de cepas de levedura usadas em transformação biolística e citodução.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Meios de crescimento</td>
			<td colspan="3">Componentes</td>
		</tr><tr><td>YPD</td>
			<td colspan="3">2% de glicose, 2% de bactopeptona, 1% de extrato de levedura</td>
		</tr><tr><td>YPR</td>
			<td colspan="3">2% de rafinose, 2% de bactopeptona, 1% de extrato de levedura</td>
		</tr><tr><td>YPEG*</td>
			<td colspan="3">3% de glicerol, 3% de etanol*1, 2% de bactopeptona, 1% de extrato de levedura</td>
		</tr><tr><td>Mídia suspensa</td>
			<td colspan="3">2% de glicose, 6,8% de base de nitrogênio de levedura com (NH4)2SO4, mistura de aminoácidos drop-out*2</td>
		</tr><tr><td>Mídia de bombardeio</td>
			<td colspan="3">5% de glicose, 6,8% de base de nitrogênio de levedura com (NH4)2SO4, 1 M sorbitol, mistura de aminoácidos drop-out*2,3.</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*1 Adicione etanol após a autoclavagem quando o meio estiver quente.</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*2 A quantidade de mistura de aminoácidos pode variar de acordo com os estoques disponíveis ou a quantidade indicada pelo fabricante.</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*3 Para os meios de bombardeio, adicione os aminoácidos e as bases nitrogenadas conforme necessário, dependendo da cepa de levedura. Certifique-se de que a composição seja específica para a auxotrofia no plasmídeo de 2μL usado para a seleção.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Meios de crescimento de levedura usados neste protocolo.

Este trabalho explica como transformar mitocôndrias de levedura usando um método biolístico. Também mostramos como selecionar e purificar os transformantes e como introduzir a mutação desejada na posição alvo dentro do genoma mitocondrial.

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