Name: Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Aprenda a técnica de perfusão hepática com colagenase em ratos para isolamento de hepatócitos primários viáveis. Este método otimizado permite cultivar organoides 3D funcionais por longo prazo, superando as limitações das culturas bidimensionais convencionais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Heslop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+evaluation+of+primary+human+hepatocyte+culture+using+global+proteomic+analysis+reveals+a+selective+dedifferentiation+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile.</a> Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).</li>
<li>Ietto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+liver+organoids%3A+Generation+and+importance+of+diverse+specialized+cellular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components.</a> Cells. 12 (10), 1429(2023).</li>
<li>Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+in+collagen+sandwich%3A+evidence+for+transcriptional+and+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation.</a> J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).</li>
<li>Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Hepatocytes+in+sandwich+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Primary Hepatocytes in sandwich culture.</a> Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+hepatocyte+isolation+and+cultures%3A+Technical+aspects%2C+challenges+and+advancements%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements.</a> Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).</li>
<li>Thompson, W. L., Takebe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+model+systems+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Human liver model systems in a dish.</a> Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+organoids+are+a+powerful+tool+for+the+study+of+liver+disease+and+personalized+treatment+design+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).</li>
<li>Raju, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pluripotent+stem+cell+differentiation+to+hepatocyte+ceases+further+maturation+at+an+equivalent+stage+of+e15+in+mouse+embryonic+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development.</a> Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).</li>
<li>Peng, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokine+TNFalpha+promotes+the+long-term+expansion+of+primary+hepatocytes+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3d+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+undergo+phenotypic+transformation+to+biliary+epithelium+in+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures.</a> Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).</li>
<li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGF%CE%B2-mediated+hepatocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLancaster%2C+MA+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Huch, M., Koo, B. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+rat+hepatocytes+with+multiparameter+perfusion+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control.</a> J Vis Exp. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), e3917(2012).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> J Vis Exp. (132), e56993(2018).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PREPARE%3A+Guidelines+for+planning+animal+research+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing.</a> Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).</li>
<li>Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+murine+primary+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+and+coculture+of+primary+rat+and+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).</li>
<li>Knobeloch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes%3A+isolation%2C+culture%2C+and+quality+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).</li>
<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01- ALK5 Inibidor IV</td><td>Twin Helix</td><td>&nbsp; T3031</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real&nbsp;</td><td>&nbsp; Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Twin Helix</td><td>T2310</td><td></td></tr><tr><td>Click EdU Alexa 488 kit de imagem</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C10499</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno, Tipo I, solução de cauda de rato</td><td>Merck</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona&nbsp;</td><td>Merck</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck</td><td>&nbsp; E9644</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>GELTREX LDEV FREE RGF BME</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sódica 25000 UI/5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 100-39H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solução de insulina-transferrina-selênio 100x&nbsp;</td>Solução <td>de L-Glutamina 41400045</td><td></td>da <td>Thermofisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Digestão do Fígado&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; 17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Perfusão Hepática</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>suplemento N2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Merck</td><td>&nbsp; N-0636</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Merck</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Aurogene</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer 1X</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0964,9050</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296039A</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Ismatec&trade; &nbsp;</td>Bomba <td></td><td>Digital Reglo MS-4/12</td></tr><tr><td>TNFa</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 300-01A</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Merck</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Tubing&nbsp;</td><td>Ismatec&trade; &nbsp;</td><td>&nbsp; ID.2,79mm</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E Medium, sem glutamina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Twin Helix</td><td>T1725</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3d de ponta

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

Ao final dos procedimentos de montagem (etapa 6.13), obtivemos um rendimento celular de até 1 x 108 células por isolamento do fígado de cerca de 300 g de um rato. A viabilidade celular entre 78% e 97% foi estabelecida pela contagem de azul de tripano.
Como já descrito em estudos anteriores 1,18,19, os hepatócitos primários em cultura perdem sua morfologia, funções específicas do fígado e morrem em poucos dias.
É bem conhecido na literatura23,24 que os hepatócitos adultos primários perdem rapidamente a morfologia cuboidal-hexagonal, tornam-se uma forma "semelhante a fibroblastos" em poucos dias e morrem. A Figura 1 mostra as várias fases: 4 h após o plaqueamento em uma placa revestida de colágeno, os hepatócitos aderem à superfície, espalham-se em uma monocamada típica mostrando uma morfologia cuboidal, as bordas das células são definidas, as junções entre as células são lineares e a superfície das células parece lisa (Figura 1A). No dia 1, os hepatócitos primários adquirem sua forma hexagonal típica e as gotículas lipídicas tornam-se visíveis (Figura 1B). Nos dias 2-3, as gotículas lipídicas aumentam (Figura 1C-1D), enquanto nos dias 4-5, as células acumulam fibras de estresse de actina (Figura 1E-F). Também avaliamos a porcentagem de células viáveis em cultura 2D primária do dia 1 ao dia 5 e comparamos com a viabilidade antes do plaqueamento no dia 0 (Figura 2). É possível observar uma redução drástica da viabilidade já nos primeiros dias de cultivo, chegando a 49,5% (DP 12,7) no Dia 1, que diminui para 45,2% (DP 18,2) no Dia 2 e 33,5% (DP 0,77) no Dia 3. A porcentagem de células viáveis no dia 4 já é de 16,9% (DP 5,4), enquanto no dia 5 chega a 9,1% (DP 0,38). Portanto, é evidente que a perda de morfologia acompanha uma rápida morte celular progressiva de hepatócitos adultos em cultura 2D.
Os hepatócitos isolados, antes do plaqueamento (dia 0), mostraram uma alta expressão de mRNA de genes marcadores hepáticos (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) avaliados por RT-qPCR (Figura 3). Todos os genes analisados mostram uma diminuição da expressão dependente do tempo de cultura já no dia 1 em cultura. Os níveis de expressão de mRNA destacam a perda funcional e de viabilidade dos hepatócitos primários durante o tempo.
Os hepatócitos isolados foram plaqueados em gotículas de matriz 3D e estruturas celulares organoides 3D foram acompanhadas ao longo do tempo. No dia 1 da cultura, hepatócitos únicos são suspensos nas gotículas da matriz (Figura 4A). A concentração celular é mantida intencionalmente baixa para fornecer aos hepatócitos amplo espaço para crescer. Além disso, isso nos permite acompanhar visualmente o crescimento do organoide. Os hepatócitos primários apresentaram divisão celular nos primeiros dias de cultivo (Figura 4C). Além disso, enquanto no Dia 0, os Hep-Orgs foram medidos em 30 μm, no Dia 2 os Hep-Orgs quase dobraram suas dimensões, sublinhando o crescimento de tamanho que foi mantido até o Dia 15 (33,08 μm no Dia 1; 64,86 μm no Dia 2; 45,06 μm no Dia 5; 55,19 μm no Dia 7; 51,93 μm no Dia 10; 62,90 μm no Fay 15). Em relação à forma de Hep-Orgs, enquanto no Dia 1 eram de forma redonda, atingiram a "forma de cacho de uvas" (típica dos organoides hepáticos) nos dias seguintes.
Os hepatócitos plaqueados em uma matriz 3D permanecem vivos em cultura por semanas, mostrando uma viabilidade de 23% ±10% após 15 dias usando o ensaio de azul de tripano (Figura 4B, primeira linha). Para validar a proliferação de Hep-Orgs de ratos, um teste EdU foi realizado no dia 15 (Figura 4D). No entanto, a coloração de Hoechst mostrou um alto número de células únicas em vez de Hep-Orgs, uma atividade proliferativa de hepatócitos (células verdes) estava presente, mesmo que a incorporação de EdU fosse baixa (9% ± 7%) (Figura 4B, segunda linha).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig01.jpg"> Figura 1: Cultura 2D de hepatócitos primários em placas revestidas de colágeno ao longo do tempo. As imagens foram tiradas com ampliação de 20x com (A) microscopia de contraste de fase 4h após o revestimento, (B) Dia 1, (C) Dia 2, (D) Dia 3, (E) Dia 4, (F) Dia 5. Uma barra de escala correspondente a 50 μm é relatada em cada imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig02.jpg"> Figura 2: Células primárias viáveis em cultura 2D em placas revestidas de colágeno. O gráfico mostra a porcentagem de células viáveis do Dia 1 ao Dia 5, em comparação com as células viáveis plaqueadas no Dia 0, consideradas 100%. Os resultados são relatados como réplicas únicas, média e DP de 3 experimentos diferentes (* valor de p ≤ 0,05; ** valor de p ≤ 0,005). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig03.jpg"> Figura 3: Expressão de mRNA de marcadores hepáticos medidos por RT-qPCR em hepatócitos primários. Os resultados foram normalizados em β-Actina e/ou GAPDH (genes de manutenção) e são expressos em relação aos hepatócitos primários coletados antes do plaqueamento no dia 0, considerado como 1. Os resultados são relatados como DP ± médio de, pelo menos, 3 experimentos diferentes (**+ valor de p ≤ 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig04.jpg"> Figura 4: Cultura de hepatócitos 3D em gotículas de matriz ao longo do tempo. (A) Hepatócitos isolados plaqueados em gotículas de matriz para Hep-Orgs de longo prazo: na imagem, as gotículas da matriz são visíveis na superfície do poço (círculo vermelho = uma gota). (B) Porcentagem de células viáveis por azul de tripano e células proliferativas por EdU no dia 15 antes da passagem. A quantificação de células positivas para EdU foi realizada pelo software ImageJ2. Os resultados são relatados em porcentagem como Média±DP de, pelo menos, 3 experimentos diferentes. (C) Imagens de contraste de fase da cultura 3D Hep-Orgs de ratos em diferentes dias de crescimento na cultura 3D: dia 1, 2, 5, 7, 10, 15. Ampliação da imagem 20X. Uma barra de escala correspondente a 50 μm é relatada em cada imagem. (D) Ensaio de incorporação EdU de Hep-Orgs de rato no dia 15. Ampliação da imagem 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Buffers e composição de mídia. A tabela relata o nome e os componentes (com sua concentração final) de todos os tampões e os meios celulares usados no protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Lista de primers de ratos. A tabela relata a lista de primers usados para experimentos de RT-qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08%20Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

rat-liver-perfusion-primary-hepatocytes-isolation-an-old-procedure

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um novo método para obter macrófagos de cultura primária de células de fígado de rato é descrito. Este método utiliza a proliferação de macrófagos na cultura, seguido por agitação de frascos de cultura e purificação pelo apego seletivo para pratos de plástico. Esta técnica proporciona eficiente macrófagos do fígado, sem equipamentos complexos e habilidades.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

O estudo do fígado sinusoidal células endoteliais (SCEE) devem ser realizados com células primárias provenientes do animal como não existem linhas celulares. Este método baseia-se na digestão de fígado e centrifugação diferencial para SEC purificação para a cultura subseqüente e experimentação.

Endocitose em Fígado vivo seguidos de purificação de células do fígado por perfusão de fígado

Hepatócitos primários proporcionar uma ferramenta valiosa para avaliar as funções bioquímicas, moleculares, e metabólicas em um sistema fisiologicamente relevante experimental. Nós descrevemos um protocolo confiável para rato em perfusão de fígado in situ, que sempre gera hepatócitos viáveis ​​até to1.0 ×...

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Um procedimento de duas etapas de perfusão de colagenase modificado para isolamento de hepatócitos humanos é descrita. Este método também pode ser aplicado a outros fígados de mamíferos. Os hepatócitos isolados estão disponíveis em alto rendimento e viabilidade, tornando-os um modelo adequado para a investigação científica em áreas como a regeneração do fígado, farmacocinética e toxicologia.

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

O objetivo do presente protocolo é obter alta viabilidade e alto rendimento de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais do fígado. Isso é realizado pela perfusing o fígado com uma solução de colagenase tipo IV através da veia portal, seguida por centrifugação diferencial para obter hepatócitos e células endoteliais sinusoidais.

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos de fígados de camundongos adultos usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também é descrita a cultura de longo prazo dos hepatócitos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, bem como imunorotulagem dos componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta ao tratamento.

Isolamento e cultura sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários para estudar o papel do citoesqueleto na formação bile canalicular in vitro

Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.

Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Um sistema de cultura organoide 3D ex vitro de longo prazo foi estabelecido a partir de hepatócitos de camundongos. Esses organoides podem ser passagemdos e geneticamente manipulados por infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9.

Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine

Aqui, apresentamos um método robusto de perfusão in situ do fígado de camundongos para estudar a regulação aguda e direta do metabolismo hepático sem perturbar a arquitetura hepática, mas na ausência de fatores extra-hepáticos.

Produção Hepática de Glicose, Urateagênese e Lipólise Quantificada usando o Modelo de Fígado de Camundongo Perfundido

Aprenda a técnica de perfusão hepática com colagenase em ratos para isolamento de hepatócitos primários viáveis. Este método otimizado permite cultivar organoides 3D funcionais por longo prazo, superando as limitações das culturas bidimensionais convencionais.

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta (Vídeo) | JoVE Journal

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Explorar mais vídeos