Name: Ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a usar o ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos entre retículo endoplasmático e mitocôndrias em células HEK293T vivas. Este método simplifica a quantificação da comunicação interorganelas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Um ensaio simples para medir contatos ER-mitocôndrias para telas de alto rendimento

<ol><li>Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites-emerging+intracellular+signaling+hubs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).</li>
<li>Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites%3B+a+multifaceted+factory+for+Ca2%2B+signaling+and+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).</li>
<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).</li>
<li>Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+connection%3A+How+membrane+contact+sites+have+changed+our+view+of+organelle+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology.</a> Cell. 187 (2), 257-270 (2024).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There%27s+something+wrong+with+my+MAM%3B+the+ER-mitochondria+axis+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases.</a> Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).</li>
<li>Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+associated+membranes+%28MAMs%29%3A+emerging+drug+targets+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes.</a> Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).</li>
<li>Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entangled+ER-mitochondrial+axis+as+a+potential+therapeutic+strategy+in+neurodegeneration%3A+A+tangled+duo+unchained%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained.</a> Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).</li>
<li>Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+and+their+critical+role+in+aging+and+age-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).</li>
<li>Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites+in+the+control+of+glucose+homeostasis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update.</a> Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).</li>
<li>Bouguerra, M. D., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+interactions%3A+Both+strength+and+weakness+within+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).</li>
<li>Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+junctions+with+cellular+organelles%3A+Ca2%2B+signalling+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective.</a> Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A computational model of motor neuron degeneration.</a> Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).</li>
<li>Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites+reporters%3A+strengths+and+weaknesses+of+the+available+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).</li>
<li>Valm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+systems-level+spectral+imaging+and+analysis+to+reveal+the+organelle+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome.</a> Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).</li>
<li>Csordás, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Kakimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+multiple+inter-organelle+contact+sites+using+the+organelle-+targeted+split-GFP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system.</a> Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).</li>
<li>Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+diffusion+and+trapping+of+STIM1+and+Orai1+at+ER-plasma+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+regulates+ER-mitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts.</a> Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Cho, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+peroxidase+proximity+labeling+coupled+with+biochemical+fractionation+identifies+promoters+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts.</a> J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia-linked+REEP1+modulates+endoplasmic+reticulum%2Fmitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts.</a> Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).</li>
<li>Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+actomyosin%3A+Partners+in+regulating+epithelial+cell-cell+junction+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function.</a> Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de Microcentrífuga SafeSeal de 1,7 mL</td> Placa de 6 poços <td>Sorenson</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>TC Tratado</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta de 10 mL OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; Ponteiras de pipeta L OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mu; L Pontas chanfradas OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1210</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polipropileno Tubo Cônico</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Racks de Microtubos de 96 Poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8770-11</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços TC Treated&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm TC Prato Tratado</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>1250 &mu; Centrífuga L Tips OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1112-1720</td><td></td></tr><tr><td>5910&nbsp; Ri - Centrífuga Refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5943000131</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido, anidro, &ge; 99,9%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EHop 016</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>6248</td><td>Dissolver em DMSO; armazenar a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>EnduRen Substrato de Célula Viva</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>Armazene alíquotas a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Eppendorf 2-20 &mu; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 100-1000 &mu; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 1-10 &micro; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 12 canais</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 200 &mu; Pipeta L</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>3123000055</tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, regiões qualificadas, aprovadas pelo USDA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2&nbsp; Incubadora, 184 L, Aço Inoxidável Polido</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>381</td><td></td></tr><tr><td>Contador de contagem manual</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS6594</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T Células</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro - Neubauer Bright Line, Câmara de Contagem Dupla</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen TE Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8019005</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Multi Tube Rack para tubos cônicos de 50 ml, cônicos de 15 ml e microcentrífugas</td><td>Boekel Scientific</td><td>120008</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Cloridrato de polietilenomina linear de grau de transfecção (MW 40.000)</td> <td>Polysciences</td><td>24765-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>USA Scientific</td><td>4440-0101</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobrometo de poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de rhosina</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>5003</td><td>Dissolver em DMSO; armazenar a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX leitor de microplacas multimodo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2215365</td><td>nível 8</td></tr><tr><td>Sistema de aspiração a vácuo VWR</td><td>VWR</td><td>75870-734</td><td></td></tr><tr><td>ZCL 278</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>4794</td><td>Dissolva em DMSO; armazene a -70 &deg; O</td></tr></tbody></table>

ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

Usamos o protocolo descrito acima para medir o nível de contatos ER-mitocôndrias após a adição de três compostos conhecidos por inibir GTPases específicas. CDC42, RHO e RAC são GTPases que promovem a polimerização da actina28 quando ativadas e são inibidas por ZCL278, Rhosin e Ehop-016, respectivamente24. HEK293T células transfectadas com split-Rluc foram tratadas com DMSO (controle), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) ou Ehop-016 (25 μM) e incubadas por 1 h, 2 h e 5 h. Usando um leitor de placas, medimos a atividade de luc split-Rem pontos de tempo definidos (Figura 2).
As células tratadas com rhosina (inibidor de RHO GTPase) não mostraram alterações significativas na atividade da luciferase em comparação com as células de controle tratadas com DMSO em 1 h, 2 h e 5 h do tratamento (p &gt; 0,9999, p = 0,6956, p &gt; 0,9999) (Figura 2). Esses resultados demonstram que a Rhosina não afeta os contatos ER-mitocôndrias, sugerindo que não há envolvimento da atividade da GTPase RHO na regulação dos contatos entre as duas organelas.
Em contraste, o inibidor da RAC GTPase Ehop-016 mostrou atividade de luciferase significativamente menor do que o DMSO em 1 h, 2 h e 5 h de tratamento (p = 0,0106, p = 0,0009, p = 0,0024) (Figura 2). Esses dados indicam que a atividade da RAC GTPase é necessária para manter a interação normal ER-mitocôndrias na célula.
Finalmente, o inibidor de CDC42 ZCL278 mostrou as mudanças mais drásticas na atividade da luciferase (Figura 2). As células tratadas com ZCL278 mostraram uma diminuição significativa na atividade da luciferase em comparação com o DMSO controle e tiveram os menores valores de p em todos os três pontos de tempo, mantendo um p &lt; 0,0001 por toda parte. Nossos dados demonstram uma forte inibição do acoplamento ER-mitocôndria quando a atividade da GTPase CDC42 é bloqueada por ZCL278, consistente com nosso relatório anterior usando o ensaio original split-Rluc realizado em células co-transfectadas com dois vetores que codificam cada metade da split-luciferase separadamente24.
Dados os resultados impressionantes com o ZCL278, especialmente quando comparado aos outros inibidores da GTPase, a atividade do ZCL278 foi testada em várias concentrações [0,5 μM, 5 μM, 50 μM] contra um controle DMSO. As atividades da luciferase medidas em 1 h, 2 h e 5 h após o tratamento mostraram uma resposta dose-dependente; 0,5 μM de ZCL278 resultou no efeito mais fraco na atividade da luciferase, enquanto 5 μM mostrou mais forte e 50 μM mostrou a maior redução na atividade enzimática reconstituída (Figura 3). Juntos, nossos resultados mostram que o ZCL278 regula negativamente a atividade do split-Rluc de maneira dose-dependente e, com o passar do tempo, concentrações mais altas de ZCL278 (inibidor de CDC42) ainda mostram uma mudança significativa em relação ao DMSO controle em comparação com concentrações mais baixas.
Como forma de validar nosso ensaio split-Rluc, ensaios independentes bem estabelecidos, como ensaio de ligadura de proximidade (PLA), microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e monitoramento da captação de cálcio mitocondrial, podem ser realizados (Figura 4 e dados não mostrados)24. O isoproterenol, um agonista do receptor β2 adrenérgico, que é um dos compostos identificados em nossa triagem para promotores de contato ER-mitocôndrias ( Figura 4A ), foi usado para confirmar que a atividade da luciferase do split-Rluc após o tratamento com isoproterenol foi aumentada devido ao aumento dos contatos ER-mitocôndrias, conforme demonstrado por mudanças na intensidade do sinal de PLA, bem como na captação de cálcio mitocondrial ( Figura 4B-E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig01.jpg"> Figura 1: O ensaio de remontagem de Luc split-R. (A) Representação esquemática do ensaio Luc Split-R. Onde não há contatos de membrana entre as mitocôndrias e o retículo endoplasmático, o Mito-RlucN e o RlucC-ER não interagem e, portanto, não há atividade de Rluc8. No entanto, a interação entre o Mito-RlucN e o RlucC-ER, onde o ER e as membranas mitocondriais entram em contato, resulta em atividade enzimática completa, que é detectada pela conversão do substrato em luminescência. (B) Mapa esquemático da construção de DNA split-Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (C) Diagrama do fluxo de trabalho para ensaio de luc split-Rem células HEK293T. Abreviaturas: Mito = mitocôndrias; ER = retículo endoplasmático; IRES, local de entrada ribossômico interno; rb_glob pA, sinal de poli adenilação da beta-globina de coelho; T2A, uma sequência do peptídeo 2A de autoclivagem do vírus Thosea asigna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig02.jpg"> Figura 2: As atividades de luc split-Rcorrespondentes aos níveis de contatos ER-Mito nas células tratadas com inibidores da GTPase. (AC) Atividades de luciferase reconstituídas em (A) 1 h, (B) 2 h ou (C) 5 h após DMSO (controle), Rhosin [50 μM], Ehop-016 [25 μM] ou ZCL278 [50 μM] tratamento (n = 12 para cada grupo). Todos os dados foram analisados por meio de ANOVA one-way com comparações múltiplas. Os valores de p são relatados como p &gt; 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). As barras de erro indicam o erro médio ± padrão de medição. Abreviaturas: Mito = mitocôndrias; ER = retículo endoplasmático; RLU = unidade de luz relativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig03.jpg"> Figura 3: As atividades split-Rluc medindo os níveis de contatos ER-Mito nas células tratadas com ZCL278. (AC) Atividades de luciferase reconstituída em (A) 1 h, (B) 2 h ou (C) 5 h após DMSO (controle) ou ZCL278 na concentração [0,5 μM], [5 μM] ou [50 μM] (n = 12 para cada grupo). Todos os dados foram analisados por meio de ANOVA one-way com comparações múltiplas. Os valores de p são relatados como p &gt; 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). As barras de erro indicam o erro médio ± padrão de medição. Abreviaturas: Mito = mitocôndrias; ER = retículo endoplasmático; RLU = unidade de luz relativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig04.jpg"> Figura 4: Validação do ensaio de luc split-R. (A) Um exemplo de quantificação da atividade de Split-Rluc após o tratamento de células HEK293T com 11 drogas, incluindo isoproterenol, identificadas em uma triagem composta para promotores de contato ER-mitocôndrias. (B) Um exemplo de ensaio de ligação de proximidade em células HeLa que foram tratadas com DMSO ou isoproterenol (1 μM). O sinal PLA (vermelho) indica um contato próximo entre ER e Mito. Sec61-GFP (verde): para rotular ER; DAPI (azul): núcleo. (C) Quantificação do sinal de PLA em A (n = 4 experimentos com 77-97 células cada; Teste de Mann-Whitney). (D) Captação de cálcio mitocondrial em resposta à histamina (100 μM). A mudança de intensidade fluorescente Mito-R-GECO1 (a média foi obtida em várias células HeLa) plotada a cada 2,5 s em células tratadas com DMSO ou isoproterenol. A seta indica adição de histamina. (E) Esquerda: Pico máximo de captação de cálcio mitocondrial em A. Teste t bicaudal não pareado (n = 10, DMOS; 14, Isoproterenol). Direita: Taxa de captação de cálcio mitocondrial (como em A; 7,5 a 12,5 s). Teste de Mann-Whitney (n = 12, DMSO; 11, Isoproterenol). Essa figura é modificada de Lim et al.24. Abreviaturas: RLU = unidade de luz relativa; PLA = ensaio de ligadura de proximidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Resumo das técnicas atuais para contatos ER-mitocôndrias. Lista de vantagens e limitações para cada método. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R2_updated_Table1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo Suplementar 1: Arquivo zip contendo sequência de DNA (formatos PDF e GBK) de pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R3_plasmidDNAsequence.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S1: Mapa de pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_Supplemental%20Figure%201_PlasmidMap_PrimerSequence_.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

split-luciferase-reassembly-assay-to-measure-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui, descrevemos os procedimentos para estudar mudanças na fagocitose induzida por expressão de genes com uma abordagem gene luciferase baseado repórter usando o Dual-GloTM Sistema de ensaio de luciferase da Promega.

Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter

Este vídeo demonstra o ensaio de complementação de luciferase dividida para detectar interações proteína-proteína. Neste ensaio, as proteínas de interesse são marcadas em pequenos e grandes fragmentos da enzima luciferase. Quando as proteínas interagem, os fragmentos grandes e pequenos se combinam para formar um complexo enzimático ativo, que na presença de um substrato específico, libera luminescência brilhante que pode ser medida.

Ensaio de complementação de luciferase dividida para identificar interações proteína-proteína específicas

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Este artigo descreve o uso de uma luciferase de pirilampo-GFP proteína de fusão para...

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Descrevem-se os métodos de imagiologia que usamos para investigar a distribuição e a mobilidade das proteínas fluorescentes transfectadas residentes no retículo endoplasmático (ER), por meio da imagem confocal de células vivas. Também analisamos ultraestruturalmente o efeito de sua expressão na arquitetura deste compartimento subcelular.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

As interações entre proteínas são fundamentais para todos os processos celulares. Usando bioluminescência Transferência de Energia de Ressonância, a interacção entre um par de proteínas podem ser monitoradas em células vivas e em tempo real. Além disso, os efeitos das mutações potencialmente patogénicos pode ser avaliada.

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

O protocolo aqui apresentado destina-se a demonstrar a ocorrência de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi com n- e/ou C-termini expostos citoplasma em células de mamíferos vivos usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida.

Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida

A necessidade de novas abordagens para o estudo dos sítios de contato com membranas (SCM) tem crescido devido ao crescente interesse no estudo dessas estruturas celulares e seus componentes. Aqui, apresentamos um protocolo que integra tecnologias de microscopia previamente disponíveis para identificar e quantificar complexos proteicos intra-organelas e interorganelas que residem em SCGs.

Visualização e quantificação de interações endógenas intra-organelas em sítios de contato ER-mitocôndrias por ensaios de ligadura de proximidade

Este protocolo descreve um ensaio baseado em BRAKET para medir as interações da quinase CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas. O protocolo descreve as etapas para preparar as células, ler as emissões de BRET e analisar dados. Um exemplo de resultado com identificação de controles apropriados e solução de problemas para otimização de ensaio também é apresentado.

Ensaio baseado em transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) para medir interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas

Aprenda a usar o ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos entre retículo endoplasmático e mitocôndrias em células HEK293T vivas. Este método simplifica a quantificação da comunicação interorganelas.

Ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas

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