Name: Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a gerar suspensões de células únicas de embriões de camundongos em gastrulação para sequenciamento de RNA. Este protocolo permite analisar decisões de destino celular em mutantes de linhagem.

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Agradecemos ao Núcleo de Genômica do Fox Chase Cancer Center e aos membros do laboratório Dr. Johnathan Whetstine Zach Gray, Madison Honer e Benjamin Ferman pelo suporte técnico para os experimentos de sequenciamento. Reconhecemos os membros do laboratório do Dr. Estaras e Alex Morris, um estudante de pós-graduação rotativo que contribuiu para a análise inicial dos estudos de célula única. Este trabalho é financiado pelas bolsas do NIH R01HD106969 e R56HL163146 para Conchi Estaras. Além disso, Elizabeth Abraham foi apoiada pela bolsa de treinamento T32 5T32HL091804-12.

Isolamento e genotipagem de embrião de camundongo gastrulado para sequenciamento de célula única

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
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<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Um pipeline robusto é apresentado neste artigo para a obtenção de suspensões unicelulares e de núcleos de alta qualidade a partir de embriões de camundongos gastrulados, especificamente projetados para facilitar estudos sobre mecanismos de especificação de destino celular no desenvolvimento inicial. Este método aborda uma lacuna crucial no campo da gastrulação, otimizando a análise de embriões que requerem genótipos, como genes sexuais ou somáticos. Ao utilizar modelos de camundongos com mutação genética e empregar sequenciamento de célula única de alta resolução em embriões inteiros de camundongos, esse pipeline pode melhorar ainda mais a compreensão dos perfis de expressão gênica da gástrula inicial do camundongo. Este método demonstra a viabilidade de usar um modelo de camundongo de mutação genética por um sistema de Cre recombinase para obter células e núcleos de alta qualidade em pontos iniciais de desenvolvimento para ômicas de célula única. Esse método evoluiu por meio de várias tentativas, durante as quais as amostras não atenderam aos padrões de qualidade exigidos para a preparação e sequenciamento da biblioteca. A metodologia explicada gera células/núcleos suficientes a partir de embriões menores que E8 por meio da otimização de três etapas críticas: (1) gestações sincronizadas para aumentar o número de embriões, (2) genotipagem no mesmo dia para evitar congelamento/descongelamento e (3) avaliação da viabilidade celular/núcleos para evitar o sequenciamento de células moribundas. Este protocolo fornece resultados bem-sucedidos com RNASeq de célula única, mas as suspensões de células ou núcleos obtidas neste protocolo podem ser processadas em outras plataformas de sequenciamento, onde a viabilidade celular é o fator limitante, como smart-seq, drop-seq e cel-seq16.
No embrião E7, o número de células pode variar dependendo da cepa e do genótipo mutante. Normalmente, um embrião E7 pode variar de centenas a alguns milhares de células, e obter embriões com o genótipo desejado é um desafio, com apenas 1 ou 2 embriões por mãe grávida atendendo aos critérios. Este protocolo permite a captura de cerca de 300 células viáveis por embrião E7 para análise de célula única. As tentativas de aumentar o tamanho do pool de embriões congelando embriões de mães prenhes em dias diferentes não tiveram sucesso, pois a viabilidade celular foi severamente comprometida após o descongelamento, mesmo com a adição de agentes criopreservadores. Para enfrentar esse desafio, a estratégia de melhoramento e sincronização de fêmeas prenhes foi otimizada. Para aumentar as chances de múltiplos isolamentos, recomenda-se o uso de camundongos fêmeas que deram à luz 1-2 vezes antes da reprodução para isolamento, pois são mais propensos a ter ninhadas maiores. Monitorar o ciclo estral da fêmea é crucial; O acasalamento é mais provável de ocorrer durante os estágios de proestro e estro. Se surgirem dificuldades de reprodução, trocar os parceiros de reprodução após quatro dias também ajudará se nenhum plugue for produzido.
É importante notar que esse método tem uma limitação: ele se baseia em plugues observados e, mesmo que um plugue seja observado, não garante a gravidez, mas apenas indica atividade sexual. Portanto, aumentar o número de plugues observados em um dia aumentará a probabilidade de ter mais de uma mãe prenhe em um dia e genótipos mais positivos. Este protocolo demonstrou a viabilidade do uso de estágios embrionários variando de E7 a E7.75 como prova de conceito durante a gastrulação. No entanto, esse pipeline pode ser aplicado de embriões E6.5 a E8. Para embriões E6.5, recomenda-se aumentar o número de gestações sincronizadas para obter pelo menos 7 embriões com o genótipo desejado para agrupar. Em vez disso, para os embriões E8, aumente a quantidade de tripsina usada para dissociar cada embrião para ~ 40 μL em vez de 20 μL. O objetivo é obter uma suspensão de células/núcleos em uma faixa de concentração de 700-1200 células por μl antes de prosseguir com a partição.
Ter uma boa viabilidade celular é essencial para o sucesso do sequenciamento de uma única célula. No design do chip microfluídico fornecido pelos fabricantes, as células individuais são particionadas em esferas de gel em emulsão (GEMs) dentro de um chip contendo contas de gel com código de barras conhecidas11. No entanto, uma limitação notável desse processo é que células únicas de alta e baixa qualidade podem ser particionadas. Mesmo com um número adequado de células vivas (ou seja, 1000 células/μL), se a viabilidade da suspensão for baixa (ou seja, 1000 células vivas e 1000 células mortas, resultando em 50% de viabilidade), o experimento de sequenciamento provavelmente falhará. Para obter os melhores resultados, recomenda-se buscar uma viabilidade em torno de 90%. Se a viabilidade celular cair entre cerca de 60% e 89%, medidas específicas podem ser tomadas para aumentar a viabilidade do experimento. No entanto, se a viabilidade celular for inferior a 60%, é fortemente desaconselhado continuar com o experimento. A razão para isso é que as células moribundas serão 'capturadas' no gel de particionamento, e a preparação subsequente da biblioteca e os controles de qualidade passarão sem problemas perceptíveis. No entanto, o experimento de sequenciamento real pode falhar completamente, já que a maioria das leituras de sequenciamento mapeará genes mitocondriais, ribossômicos ou de apoptose, indicando sinais de baixa viabilidade celular desde o início. Os dados apresentados neste artigo ilustram um pipeline para sequenciamento de célula única de embriões de camundongos gastrulados com células de alta qualidade. Esta metodologia pode ser aplicada para a compreensão de muitos modelos diferentes de camundongos com mutações genéticas durante o desenvolvimento.

A gastrulação é um processo fundamental necessário para o desenvolvimento normal. Esse processo rápido e dinâmico ocorre quando as células pluripotentes fazem a transição para precursores específicos da linhagem que definem como os órgãos se formam. Durante anos, a gastrulação foi definida por muito tempo como a formação de três populações amplamente homogêneas: mesoderma, ectoderma e endoderme. No entanto, tecnologias de alta resolução e um número emergente de modelos de células-tronco embrionárias 1,2 revelam heterogeneidade sem precedentes entre as camadas germinativas iniciais 3,4. Isso sugere que ainda há muito a ser descoberto sobre os mecanismos que regulam as distintas populações de células da gástrula. O desenvolvimento embrionário de camundongos tem sido um dos melhores modelos para estudar as decisões iniciais do destino celular durante a gastrulação 3,5. A gastrulação em camundongos é rápida, pois todo o processo de gastrulação ocorre em 48 h, do dia embrionário E6.5 a E85.
Avanços recentes em tecnologias de célula única permitiram o mapeamento detalhado do desenvolvimento embrionário de camundongos do tipo selvagem, fornecendo uma visão abrangente das paisagens celulares e moleculares dos embriões durante a gastrulação 3,4,6,7,8. No entanto, a análise de embriões mutantes nesses estágios é menos comum e muitas vezes limitada a populações classificadas por FACS 9,10. A escassa literatura reflete os desafios técnicos associados à manipulação e preparação unicelular de embriões gastrulantes que requerem genotipagem. Capturar o processo dinâmico de gastrulação pode representar desafios devido à sua natureza rápida, especialmente para a compreensão de embriões mutantes. O tempo e a sincronização das gestações são essenciais, pois mesmo pequenas diferenças entre as gestações programadas podem ser mal interpretadas como um fenótipo de desenvolvimento resultante do gene mutante. Isso se torna particularmente importante quando o gene mutante influencia o processo de gastrulação13,14. Neste estudo, são estabelecidas diretrizes para a obtenção de gestações sincronizadas por meio da visualização de tampões vaginais (ou seja, a massa de líquido seminal coagulado formada na vagina da fêmea após o acasalamento). Além disso, uma estratégia é projetada para obter dados robustos de células únicas de embriões gastrulantes mutantes de E6.5 a E8. Esta estratégia é concebida para superar as restrições associadas ao baixo número de embriões com o genótipo desejado por gravidez e à diminuição da viabilidade causada pelo congelamento e descongelamento de embriões ou células.
Este artigo descreve uma metodologia otimizada desde o estabelecimento de gestações programadas por meio de tampões vaginais até o sequenciamento final de células/núcleos únicos. Este método explica como aumentar o número de gestações sincronizadas para obter um número maior de embriões com o genótipo desejado, isolamentos de células/núcleos para melhorar a viabilidade das células e um protocolo de genotipagem no mesmo dia. Este manuscrito também descreve o processo de isolamento embrionário em diferentes momentos de gastrulação. A metodologia ajuda a aumentar o número de células/núcleos embrionários viáveis finais para sequenciamento, garantindo dados de sequenciamento de alta qualidade. Portanto, este método abrirá as portas para estudos de células únicas de embriões gastrulantes que requerem genotipagem.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; Ponta de Barreira de Alcance L</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; Ponta de Barreira de Alcance L</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro; Ponta de Barreira de Alcance L</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; m Filtro reversível, pequena</td><td>célula-tronco</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 6 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR de 8 tiras</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Bioresearch Product</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Banho Seco</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Refrigerada Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle</td><td>Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Controlador de Cromo Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td></td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>Kits de Reagentes de Célula Única 3' Chromium Next GEM v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess 3</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>Countess Cell Couning Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagentes</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR saco vitelino</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol ( DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>GenClone</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 Sistema de Imagem</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>Gråefe Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Termociclador</td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 1000/2000 P2 Reagentes (100 Ciclos) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo Nikon SMZ 1000</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Óptico 8x Tira (401428)</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Tampa do Tubo Óptico 8x Tira (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Poseidon 31-511, Microcentrífuga HS24, com rotor de 24 x 1,5/2,0 mL, 1 Centrífuga/Unidade</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Kits de Ensaio de Quantificação Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Padrão Padrão Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Estação de Fita Dicas de Carregamento</td><td>Agilent</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td> <td>Qualidade Biológica</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Mancha Azul 0.4%</td> <td>Theromo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice IKA MS3 com adaptador de placa de amostra de 96 poços</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

sequenciamento de rna de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Na última década, as abordagens de célula única tornaram-se o padrão-ouro para estudar a dinâmica da expressão gênica, a heterogeneidade celular e os estados celulares nas amostras. Antes dos avanços de uma única célula, a viabilidade de capturar a paisagem celular dinâmica e as transições celulares rápidas durante o desenvolvimento inicial era limitada. Neste artigo, um pipeline robusto foi projetado para realizar análises de células únicas e núcleos em embriões de camundongos do dia embrionário E6.5 a E8, correspondendo ao início e conclusão da gastrulação. A gastrulação é um processo fundamental durante o desenvolvimento que estabelece as três camadas germinativas: mesoderma, ectoderme e endoderme, que são essenciais para a organogênese. Extensa literatura está disponível sobre ômicas unicelulares aplicadas a embriões perigastrulantes do tipo selvagem. No entanto, a análise de células únicas de embriões mutantes ainda é escassa e muitas vezes limitada a populações classificadas por FACS. Isso se deve em parte às restrições técnicas associadas à necessidade de genotipagem, gestações cronometradas, contagem de embriões com genótipos desejados por gravidez e número de células por embrião nesses estágios. Aqui, é apresentada uma metodologia projetada para superar essas limitações. Este método estabelece diretrizes de reprodução e gravidez programada para obter uma maior chance de gestações sincronizadas com os genótipos desejados. As etapas de otimização no processo de isolamento do embrião, juntamente com um protocolo de genotipagem no mesmo dia (3 h), permitem que a célula única baseada em microgotículas seja realizada no mesmo dia, garantindo a alta viabilidade das células e resultados robustos. Este método inclui ainda diretrizes para isolamentos ideais de núcleos de embriões. Assim, essas abordagens aumentam a viabilidade de abordagens unicelulares de embriões mutantes no estágio de gastrulação. Prevemos que este método facilitará a análise de como as mutações moldam a paisagem celular da gástrula.

A metodologia projetada neste artigo destina-se especificamente a melhorar a preparação de amostras de embriões para ômicas de células únicas de E6.5 a E8. Esse pipeline robusto consiste em cinco etapas principais: gestações cronometradas sincronizadas, isolamentos de embriões, genotipagem no mesmo dia, dissociação celular e avaliação da viabilidade celular (Figura 1A). Embora os dados apresentados se concentrem em pontos de tempo de E7 a E7.5, eles podem ser aplicados a embriões até E8 (Figura 1B) com pequenas variações no procedimento (referidas notas ao longo do protocolo). As gestações sincronizadas foram alcançadas colocando duas fêmeas em uma gaiola com um camundongo macho. Os tampões vaginais foram verificados todas as manhãs antes das 10h e, se um tampão fosse observado, era considerado E0,5 até o meio-dia daquele dia (Figura 2A). Neste estudo, as condições ideais para plugues exigiam que um camundongo fêmea no estágio de estro ou proestro fosse emparelhado com um macho com histórico de colocação bem-sucedida de vários plugues durante a reprodução anterior (Figura 2B). Apenas tampões óbvios foram considerados para isolamentos de embriões (Figura 2C).
O tempo de desenvolvimento foi estimado seguindo o cronograma da Figura 2A. Para E7.5, a dissecção do embrião foi iniciada às 12h do7º dia seguinte ao dia da detecção de um tampão. A Figura 3 exemplifica um isolamento bem-sucedido de embriões em E7.5. Após a eutanásia da mãe prenhe, o corno uterino foi dissecado, o inchaço decidual foi cortado individualmente, revelando o embrião, e o saco vitelino foi isolado para genotipagem (Figura 3).
A genotipagem no mesmo dia foi realizada dentro de 3 h após o isolamento do embrião, seguindo as etapas da Figura 4A. Os embriões foram mantidos em gelo durante o processo de genotipagem para preservar sua integridade. Não congele os embriões, pois isso diminuirá o número de células viáveis por embrião. A Figura 4B, C mostra o saco vitelino visceral, o saco endodérmico parietal e o cone ectoplacentário com sangue materno associado. O saco vitelino visceral foi utilizado para genotipagem (Figura 4C). Após a digestão do saco vitelino, a mistura de PCR foi preparada e a reação de PCR foi executada. O produto de PCR resultante foi então separado em um gel de agarose. A Figura 4D mostra os tamanhos de fragmentos esperados para os alelos LoxP e do tipo selvagem (597 pb e 498 pb, respectivamente) e o alelo Cre (650 pb). Na Figura 4E, é apresentado um exemplo de genotipagem do saco vitelino de 6 embriões obtidos de casais reprodutores portadores dos alelos Cre e LoxP (flox). Os géis retratam os produtos de PCR dos alelos Cre e LoxP nos 6 embriões analisados. Os embriões número 2 e número 5 carregam 2 alelos flox e 1 alelo cre; portanto, eles são considerados embriões KO condicionais (Figura 4E, pontos vermelhos). Os embriões 1 e 3 têm 2 alelos flox, mas são negativos para Cre; Portanto, eles são considerados controles FLOX. O embrião 4 tem 2 alelos flox e uma banda fraca para o alelo Cre, resultando em um genótipo "pouco claro". Este embrião não foi processado posteriormente (alternativamente, o experimentalista pode considerar repetir a genotipagem ou conduzir uma validação secundária do KO condicional usando células que expressam Cre). É importante notar que o driver Cre usado neste experimento não é expresso no saco vitelino visceral15; portanto, os alelos LoxP não parecem deslocados no gel de embriões Cre-positivos em comparação com os Cre-negativos.
A contagem de células e a boa viabilidade são necessárias para um experimento bem-sucedido com uma única célula. Suspensões com baixa viabilidade celular, uma alta porcentagem de células mortas, aglomeração ou detritos significativos são inadequadas para processamento posterior. As condições ideais são para 700-1200 células vivas por microlitro e &gt;90% de viabilidade. A Figura 5A apresenta um painel ilustrando a viabilidade celular boa e abaixo do ideal. Os mesmos critérios também podem ser aplicados para o isolamento de núcleos, conforme mostrado na Figura 5B. No entanto, é crucial notar que a avaliação do azul de tripano difere das células e núcleos: as células viáveis não incorporam o azul de tripano, enquanto os núcleos viáveis sim. Se a suspensão de células/núcleos for ideal (viabilidade de &gt;90%), prossiga com a partição de célula única usando um chip microfluídico seguindo os procedimentos do fabricante11. As opções de solução de problemas são fornecidas para suspensões em que a viabilidade de células/núcleos está entre 60% e 89%, conforme ilustrado na Figura 5C. Se a viabilidade, independentemente do número total de células, cair abaixo de 60%, considere interromper o experimento.
Todo o duto, desde o abate da barragem grávida até a construção da biblioteca, leva um total de 8 horas no mesmo dia (ou seja, as etapas 2 a 6 do protocolo devem ser executadas no mesmo dia). Seguindo os procedimentos descritos pelos procedimentos dos fabricantes de células únicas11, foram preparadas construções de bibliotecas para sequenciamento de RNA de célula única usando células obtidas de embriões E7, com viabilidade celular variando de condições subótimas a ótimas, visando uma recuperação alvo estimada de 2000 células (Figura 6). A Figura 6A mostra uma distribuição representativa do tamanho do fragmento das bibliotecas scRNAseq para condições subótimas e ótimas, indicando que a viabilidade celular não afeta significativamente todo o processo de particionamento de célula única. A distribuição do tamanho do fragmento variou entre 400-500 pb. Isso indica que condições abaixo do ideal não afetam o processo de preparação da biblioteca. A Figura 6B mostra os resultados de experimentos bem-sucedidos e abaixo do ideal de RNAseq de célula única. Após o sequenciamento, foram realizadas verificações de controle de qualidade nas amostras e observaram que, nos casos em que a viabilidade celular estava abaixo do ideal, apenas 10% das células foram sequenciadas com sucesso. Em contraste, as amostras ótimas exibiram uma porcentagem maior, com 91% do total de células sendo sequenciadas. Isso é comprovado ainda mais por gráficos de código de barras, indicando que as condições abaixo do ideal têm maior ruído de fundo em comparação com as condições ideais. A análise de agrupamento foi realizada para ambos os experimentos e revelou 9 agrupamentos nas condições ótimas e 4 no subótimo. A anotação dos clusters usando marcadores conhecidos3 revelou tipos de células esperados nos embriões E7, incluindo epiblasto e estria primitiva (Figura 6B). As anotações de agrupamento no experimento subótimo não foram possíveis devido à falta de enriquecimento em marcadores conhecidos para cada agrupamento. Isso destaca a importância de células de alta qualidade necessárias para a representação adequada dos dados durante esses estágios de desenvolvimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> Figura 1: Otimização de embriões inteiros de camundongos gastrulados para sequenciamento de RNA de célula única. (A) Esquema de fluxo de trabalho para obtenção de células e/ou núcleos de alta qualidade a partir de embriões gastrulantes. (B) Imagens representativas de campo brilhante e esquema adaptado3 de embriões de camundongos durante a gastrulação de E7 a E8. Barra de escala: 125 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> Figura 2: Estratégia para gestações sincronizadas eficientes para isolamentos de embriões durante a gastrulação. (A) Diagrama esquemático indicando o pipeline para gestações programadas e um cronograma descrevendo os tempos desde a detecção do tampão até o isolamento do embrião para análise de fases específicas de gastrulação. (B) Imagens representativas das fases do ciclo estral para camundongos fêmeas. As fases mais receptivas à reprodução são indicadas. (C) Diagrama esquemático ilustrando como verificar se há tampões vaginais e exemplos de aberturas vaginais sem tampão, tampão parcial ou um bom tampão a ser considerado para isolamentos de embriões. As aberturas vaginais são ampliadas abaixo de cada imagem. O tampão (sêmen coagulado na abertura da vagina) é destacado com uma seta vermelha apontando para ele. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> Figura 3: Dissecção e genotipagem de embriões E7.5 para sequenciamento de RNA de célula única. Diagramas esquemáticos e imagens do processo de isolamento de embriões E7.5 e dissecação do saco vitelino visceral. A seta amarela indica o útero da mãe grávida e o círculo tracejado amarelo descreve a localização do embrião. As linhas tracejadas representam as áreas que foram cortadas durante a dissecação. "M" denota o fim do mesometrial, enquanto "AM" denota o fim anti-mesometrial. As barras de escala nas imagens do estereoscópio são de 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> Figura 4: Genotipagem no mesmo dia de sacos vitelinos. (A) Esquema de fluxo de trabalho para genotipagem no mesmo dia de sacos vitelinos. (B) Imagem representativa do saco endodérmico parietal e do cone ectoplacentário com sangue materno associado. (C) Saco vitelino visceral em embriões E7.5 destacados pela linha tracejada. Barra de escala: 200 μm. (D) Géis representativos do tipo selvagem (+/+), heterozigoto (Flox/+) e homozigoto flox (Flox/Flox) e genotipagem Cre (Mesp1cre15) com tamanhos de fragmentos de DNA observados. (E) São fornecidos resultados de genotipagem no mesmo dia para alelos Cre e flox de sacos vitelinos de 6 embriões (1-6). Os dois embriões com genotipagem flox/flox e Cre negativo (-) são controles flox (pontos azuis), enquanto aqueles com genotipagem flox/flox e Cre positivo (+) são KOs condicionais (pontos vermelhos). O embrião 4 não é ideal devido à fraca banda Cre (flox / flox e Cre-unclear) e, consequentemente, é excluído do processamento posterior. Embriões com o mesmo genótipo são agrupados e processados para sequenciamento de RNA de célula única. Observe que a presença do alelo Cre no saco vitelino não afeta o tamanho das faixas de flox, pois o Cre usado (Mesp1cre) não é expresso no saco vitelino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> Figura 5: Avaliação da qualidade celular e viabilidade dos núcleos. (A) Imagens representativas das condições de viabilidade celular ótimas e subótimas de embriões E7.5. (B) Imagens representativas das condições de viabilidade de núcleos ótimos e subótimos de embriões E8 (C) Esquema de solução de problemas indicando soluções potenciais para ajudar a aumentar a viabilidade das células antes de iniciar a partição de uma única célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> Figura 6: Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongo E7. (A) Traço representativo da distribuição do tamanho do fragmento para bibliotecas de sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongo E7 para condições subótimas e ótimas de viabilidade celular, com o pico principal próximo a 400-500 pb. Observe que os traços são semelhantes entre essas condições, indicando que a viabilidade da célula não afeta os controles de qualidade da biblioteca. (B) Análise dos resultados do sequenciamento de RNA de célula única para embriões de camundongos E7 sob condições subótimas e ótimas, mostrando a recuperação do alvo observado, classificação do código de barras e agrupamento de tipos de células por meio de distribuição uniforme de aproximação e projeção múltipla (UMAP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Tampão de lise</td>
		</tr><tr><td>Nome do reagente</td>
			<td>Concentração de Ações</td>
			<td>Concentração Final</td>
			<td>Volume Total 1 mL</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>0,1 m</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr><tr><td>Interpolação-20</td>
			<td>20%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Não diedt P40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Digitonina</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>TDT</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>Inibidor de RNase</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr><tr><td>Água livre de nuclease</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>924 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampão de lavagem</td>
		</tr><tr><td>Nome do reagente</td>
			<td>Concentração de Ações</td>
			<td>Concentração Final</td>
			<td>Volume Total 1 mL</td>
		</tr><tr><td>BSA na PBS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>900 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Tampão de lise de isolamento de núcleos e composição do tampão de lavagem.

Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.

Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

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