Name: Estabelecimento de um Modelo de Implantação Embrionária In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo in vitro de implantação embrionária usando embriões de camundongo e células endometriais. Este método revela como altas concentrações de estrogênio reduzem as taxas de implantação, enquanto a progesterona mitiga esses efeitos, oferecendo novas estratégias para melhorar os resultados de fertilização in vitro.

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Nossos estudos foram apoiados pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82171603), pela Fundação da Comissão Municipal de Saúde de Xangai (202140341), pela Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (23JC1403803) e pelo Programa de Promoção da Inovação do NHC e Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).

O manuseio de camundongos e estudos experimentais foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê Animal do Instituto de Tecnologias Biomédicas e Farmacêuticas de Xangai. Garanta os procedimentos de segurança: Sempre use equipamento de proteção individual (EPI) adequado ao manusear produtos químicos ou materiais biológicos.
1. Aquisição de embriões de camundongos
NOTA: Esta seção descreve o processo de obtenção de embriões de camundongos. Camundongos fêmeas adultas (6-8 semanas de idade, híbridos C57BL/6 e DBA/2) foram mantidos em condições ambientais padrão de 12 h de luz e 12 h de escuridão a 20-25 °C e 40-60% de umidade com comida e água fornecidas ad libitum.
<ol><li>Injetar camundongos fêmeas por via intraperitoneal com 10 UI de gonadotrofina sérica de égua prenhe (PMSG) e, em seguida, injetar 10 UI de gonadotrofina coriônica humana (HCG) em um intervalo de 42-48 horas.</li>
	<li>Acasalar cada camundongo fêmea com um macho de idade comparável e verificar se há um tampão vaginal na manhã seguinte. NOTA: O tampão vaginal é um nódulo de supositório amarelo claro formado após a solidificação do sêmen na abertura vaginal.</li>
	<li>Eutanasiar os camundongos fêmeas com tampões vaginais por inalação de CO2 .</li>
	<li>Abra o abdômen e localize a genitália feminina; estique o oviduto, o ovário e as bolsas de gordura com uma pinça; corte o oviduto e o ovário com uma tesoura; e, em seguida, cortar o oviduto e o útero (Figura 1).</li>
	<li>Transferir o oviduto obtido para uma placa de Petri de 35 mm pré-preenchida com meio M2. NOTA: O meio M2 deve ser pré-aquecido em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) por 30 min.</li>
	<li>Perfure a ampola aumentada do oviduto com uma agulha de 25 G para liberar ou beliscar o complexo cumulus-zigoto (Figura 2).</li>
	<li>Use uma pinça para transferir o complexo cumulus-zigoto para uma solução M2 contendo 0,5 mg / mL de hialuronidase e incube por vários minutos até que as células do cumulus se dissociem (Figura 3).</li>
	<li>Colete os zigotos usando uma pipeta de transferência de ovos e lave-os em meio M2 contendo 4 mg / mL de BSA para remover a hialuronidase residual, células do cumulus e impurezas.</li>
</ol>2. Cultura in vitro de embriões de ratinhos
NOTA: Esta seção detalha o processo de cultura in vitro de embriões de camundongos de zigotos a blastocistos. As microgotas de cultura KSOM devem ser preparadas com 24 horas de antecedência para garantir o equilíbrio da temperatura e do gás.
<ol><li>Preparar 12 microgotículas de meio KSOM, cada uma com um volume de 20 μl, no fundo de uma placa de Petri de 35 mm. Cubra as microgotículas com 3-5 mL de óleo mineral (Figura 4) e coloque as placas de Petri em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 para equilíbrio.</li>
	<li>Transferir os embriões de ratinho do meio M2 para o meio KSOM utilizando uma pipeta de transferência para uma lavagem completa. NOTA: Esta etapa requer um estereomicroscópio com um estágio de aquecimento de 37 °C. Minimize a duração do manuseio do embrião fora da incubadora.</li>
	<li>Colocar os embriões lavados nas microgotículas KSOM preparadas e incubá-los a 37 °C com 5% de CO2 durante 4 dias. NOTA: Para garantir uma nutrição adequada, cultive 5-10 embriões por microgota de 20 μL.</li>
	<li>Selecione blastocistos vantajosos de acordo com seu tamanho (100-130 μm), massa celular interna (a massa celular interna é composta por muitas células compactadas), número de células trofoblásticas (a trofectoderme composta por muitas células coesas e compactadas) e o grau de expansão (blastocele ocupa 80-100% do embrião).</li>
</ol>3. Preparação de células endometriais
<ol><li>Dentro de um gabinete de biossegurança, aspire 1 mL de gelatina a 2% usando uma pipeta e distribua-a em uma placa de cultura de 12 poços. Gire suavemente a placa para garantir a cobertura completa do fundo com a gelatina. Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C por 30 min. Depois, aspire o excesso de gelatina e deixe o fundo do prato secar completamente.</li>
	<li>Após a conclusão do processo de revestimento, cultive células de adenocarcinoma endometrial humano (Ishikawa) com DMEM/F12 (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes), 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina, 100 μg/mL de estreptomicina e 100 UI/mL de penicilina, semeie-as nas placas de 12 poços revestidas com gelatina (2 × 105células/poço) e incube por 24 h.</li>
</ol>4. Fixação do embrião
<ol><li>Coloque delicadamente 5-15 blastocistos frescos em cada poço da placa de 12 poços contendo células de Ishikawa preparadas na etapa anterior para co-cultura (Figura 5).</li>
	<li>Após 48 h de incubação, observe os embriões ao microscópio para avaliar seu status de fixação. Para observar a fixação do embrião, mova rapidamente a placa três vezes. Embriões soltos exibirão movimento flutuante ou rolante sobre a superfície das células de Ishikawa.</li>
	<li>Calcular a taxa de implantação embrionária usando a equação (1); Use a taxa de adesão do embrião para representar o efeito de implantação. Taxa de implantação de embriões = (Embriões anexados/Número total de embriões implantados) × 100% (1)</li>
</ol>

Avaliação da adesão embrionária em um modelo de co-cultura in vitro com células de Ishikawa

<ol><li>Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+study+of+human+embryo+implantation%3A+choice+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines.</a> Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).</li>
<li>Li, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+method+to+quantify+embryo+attachment+to+endometrial+epithelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).</li>
<li>Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+trophoblast+to+uterine+epithelium+as+related+to+the+state+of+trophoblast+differentiation%3A+in+vitro+studies+using+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines.</a> Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).</li>
<li>Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+in+vitro+model+of+human+embryo+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">A high-throughput in vitro model of human embryo attachment.</a> Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).</li>
<li>Karvas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+trophoblast+organoids+model+human+placental+development+and+susceptibility+to+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens.</a> Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+implantation+in+the+laboratory%3A+an+update+on+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques.</a> Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).</li>
<li>Berneau, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+osteopontin+in+an+in+vitro+model+of+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation.</a> Cells. 8 (5), 432(2019).</li>
<li>Jiang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HOXA10+sumoylation+inhibits+embryo+implantation+in+women+with+recurrent+implantation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure.</a> Cell Death Discov. 3, 17057(2017).</li>
<li>Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteopontin-integrin+%CE%B1v%CE%B23+interaction+at+implantation%3A+functional+analysis+using+three+different+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models.</a> Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).</li>
<li>Duan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+exposure+to+supraphysiological+estradiol+during+ovarian+stimulation+increased+the+risk+of+adverse+perinatal+outcomes+after+frozen-thawed+embryo+transfer%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study.</a> J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%CE%B21+and+%CE%B23+are+biomarkers+of+uterine+condition+for+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer.</a> J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgelin+2+is+required+for+embryo+implantation+by+promoting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization.</a> FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).</li>
<li>Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+increases+apical+fibronectin+in+blastocysts+to+increase+blastocyst+attachment+to+endometrial+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro.</a> Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).</li>
<li>Kang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-145+suppresses+embryo-epithelial+juxtacrine+communication+at+implantation+by+modulating+maternal+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R.</a> J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).</li>
<li>Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ulipristal+acetate+on+human+embryo+attachment+and+endometrial+cell+gene+expression+in+an+in+vitro+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system.</a> Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+human+endometrium+for+studying+trophoblast-endometrium+interaction+during+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).</li>
<li>Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+human+endometrium%3A+evolution+and+application+for+women%27s+health%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health.</a> Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).</li>
<li>Ahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microengineered+vascularised+endometrium-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip.</a> Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).</li>
<li>Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mechanical+forces+change+the+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle+in+preparation+for+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation.</a> Cells. 10 (8), 2008(2021).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesses financeiros ou outros a declarar.

A simplicidade e rapidez do modelo in vitro proposto para implantação de embriões oferecem vantagens notáveis para a triagem de medicamentos em estágio inicial e outras aplicações de pesquisa. O protocolo simples, juntamente com a natureza de alto rendimento das linhagens celulares de Ishikawa, o torna um candidato ideal para telas em larga escala, particularmente nos estágios iniciais da descoberta de medicamentos. Liang13 descobriu que o knockdown de TAGLN2 diminuiu a capacidade de invasão das células trofoblásticas. Green14 demonstrou que o fator de crescimento semelhante à insulina melhorou a competência de adesão do blastocisto de camundongo com base no sistema de células embrionárias-Ishikawa de camundongo. O modelo não só permite a avaliação rápida de candidatos a fármacos, mas também facilita o estudo de outras moléculas, como citocinas e fatores de transcrição, que desempenham um papel na implantação embrionária15,16. Dadas as implicações significativas da implantação embrionária na biologia reprodutiva, este modelo é promissor para avançar nossa compreensão dos mecanismos subjacentes e para o desenvolvimento de novas terapêuticas.
Embora o atual modelo in vitro forneça uma ferramenta valiosa para estudar a implantação embrionária, é importante reconhecer suas limitações. Por ser um sistema de cultura 2D, ele não possui a complexidade do ambiente 3D in vivo 17, o que pode impactar significativamente as interações célula-célula e as vias de sinalização. Portanto, embora o modelo possa fornecer informações iniciais sobre os efeitos de várias moléculas na adesão do embrião, ele deve ser considerado uma ferramenta de triagem e não um substituto para estudos in vivo. Direções futuras podem envolver o desenvolvimento de sistemas de cultura 3D fisiologicamente mais relevantes que recapitulam melhor o complexo microambiente do endométrio18, permitindo previsões mais precisas de respostas a drogas e mecanismos moleculares. Além disso, seria benéfico explorar a integração desse modelo com outras tecnologias avançadas, como microfluídica e sistemas organ-on-a-chip19,20 para aumentar ainda mais sua relevância fisiológica e capacidades preditivas.
Durante o processo de terapia de reprodução assistida, a superovulação visa aumentar a produção de óvulos nos ovários, elevando assim as chances de gravidez. No entanto, esse procedimento pode resultar em um aumento acentuado nos níveis de estrogênio, ultrapassando o limiar fisiológico normal. O estrogênio, um hormônio vital na reprodução feminina, é responsável por promover a proliferação endometrial e criar um ambiente propício para a implantação do embrião. Além disso, regula o equilíbrio de outros hormônios reprodutivos, incluindo a progesterona. Utilizando um modelo in vitro, nossos achados revelam que, embora um aumento na concentração de estrogênio inicialmente aumente as taxas de implantação do embrião, níveis excessivamente altos além da faixa fisiológica impedem significativamente esse processo. Notavelmente, a suplementação de progesterona pode efetivamente neutralizar esse efeito inibitório. Essas observações sugerem que níveis anormalmente altos de estrogênio durante a superovulação podem ser um fator contribuinte para as taxas de implantação mais baixas clinicamente observadas associadas às transferências de embriões frescos em comparação com as transferências de embriões congelados. Além disso, a suplementação de progesterona pós-transplante é promissora para aumentar as taxas de sucesso da implantação embrionária.
Estabelecemos uma abordagem direta, econômica e confiável para a detecção de implantação de embriões. Embriões de camundongos, ao atingirem o estágio de blastocisto por meio de cultura in vitro , foram co-cultivados com células de Ishikawa. Essa configuração experimental permite o exame do papel e da função de várias moléculas, como citocinas, drogas e fatores de transcrição, nos estágios iniciais da implantação do embrião. Embora as linhagens celulares estabelecidas, como as células de Ishikawa, possam não fornecer os sistemas modelo mais fisiologicamente relevantes quando emparelhadas com embriões humanos ou de camundongos, sua adaptabilidade e capacidade de alto rendimento as tornam ideais para triagem de drogas em larga escala em estágio inicial. Embora os modelos de cultura in vitro 2D que estabelecemos exijam mais otimização, eles estabelecem uma base para a modelagem endometrial ideal.

A implantação embrionária, etapa inicial do sucesso da gravidez, é crucial para entender sua base biológica e enfrentar os desafios da infertilidade. No entanto, as restrições éticas representam limitações significativas na coleta de amostras clínicas de embriões humanos, dificultando a pesquisa sobre as intrincadas interações entre embriões humanos e o endométrio durante o início da gravidez1. Uma compreensão profunda desses mecanismos complexos é vital para o avanço da pesquisa biológica fundamental, descoberta de medicamentos e saúde reprodutiva.
Modelos in vitro anteriores empregaram modelos de adesão em que células epiteliais endometriais humanas monocamadas (RL95-2)2 foram co-cultivadas com substitutos embrionários, como células de coriocarcinoma BeWo, JAr ou Jeg-33 . No entanto, a seleção do tamanho dos esferoides, variando de 70 a 100 μm, foi crucial, pois agregados celulares maiores ou menores poderiam comprometer a precisão do experimento. Notavelmente, apenas 25% dos esferoides em cada preparação atenderam ao padrão parao tamanho 4 adequado, e houve diferenças significativas em comparação com as condições fisiológicas dos blastocistos.
Além disso, os sistemas de cultura tridimensionais (3D) para o endométrio e o blastocisto oferecem um ambiente fisiologicamente mais relevante5, mas exigem alto conhecimento técnico, crescimento celular lento, altos custos de recursos e manutenção, dificuldade de padronização e baixa reprodutibilidade6.
Neste protocolo, apresentamos um modelo in vitro de implantação embrionária rápido e econômico que pode ser desenvolvido e utilizado na maioria dos laboratórios. O objetivo geral deste método é fornecer uma plataforma confiável e reprodutível para estudar as interações entre embriões e o endométrio em um ambiente controlado. Ao simular eventos-chave de implantação embrionária in vitro, este modelo visa preencher a lacuna entre modelos animais e ambientes clínicos, permitindo pesquisas mais precisas e direcionadas.
Em comparação com os substitutos embrionários, o uso de blastocistos de camundongo oferece uma representação fisiologicamente mais relevante do processo de implantação embrionária in vivo7. Além disso, a linhagem celular de Ishikawa, derivada do adenocarcinoma endometrial humano, possui características mistas de epitélio glandular e epitélio do lúmenuterino 1, permitindo expressar enzimas, proteínas estruturais e receptores esteroides funcionais semelhantes aos encontrados no endométrio normal, fornecendo assim um substrato fisiologicamente relevante para a implantação embrionária. A simplicidade e rapidez do sistema de co-cultura permitem triagem de alto rendimento e testes de drogas 8,9,10. Ao fornecer uma plataforma robusta e reprodutível, este método oferece uma oportunidade de avançar nossa compreensão da implantação embrionária e seu impacto na saúde humana.

<table><tbody><tr><td>17-β-estradiol</td><td>SIGMA</td><td>3301</td><td>Hormônio estrogênico mamífero mais potente</td></tr><tr><td>BD Falcon</td><td>BD</td><td>353001</td><td>Placas de Petri Bacteriológicas 35 x 10 mm estilo com tampa hermética, poliestireno virgem de grau cristalino, estéril</td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança</td><td>classe ESCO</td><td><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/66873/66873eq01.jpg" style="margin: auto; ">BSC</td><td>Operações assépticas, fabricação de placas de cultura, alíquotas de reagentes, etc</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td><td>Cultura de embriões</td></tr><tr><td>Placa de cultura</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>1133032</td><td>DMEM/F12 (1x), líquido 1:1, Contém L-glutamina e tampão HEPES 15</td></tr><tr><td>mM Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td>Soro Fetal Bovino, Qualificado, Origem da Austrália</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>SIGMA</td><td>G9391</td><td>Tipo B, pó, BioReagente, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>HCG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2520</td><td>Reagente de esterilização, injeção intraperitoneal, 50 UI/mL</td></tr><tr><td>Hialuronidase </td><td>SIGMA</td><td>V900833</td><td>Grau de reagente, pó </td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td><td>(1x), Pó, sem Vermelho de Fenol, 5 x 10 mL</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-glutamina-200 mM (100x), líquido</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 Médio (1x), Líquido, com Óleo Mineral de Vermelho de Fenol</td></tr><tr><td> </td>O óleo mineral <td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>é adequado para uso como camada de cobertura para controlar a evaporação e a contaminação cruzada em várias aplicações de biologia molecular</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina,</td><td>Gibco</td> líquido <td>15140122</td><td>10.000 unidades de penicilina (base) e 10.000 unidades de estreptomicina (base), utilizando penicilina G (sal de sódio) e sulfato de estreptomicina em solução salina a 0,85%</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2620</td><td>Reagente de esterilização, injeção intraperitoneal, 50 UI/mL</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>SIGMA</td><td>5341</td><td>Hormona esteróide secretada pelo corpo lúteo durante a segunda metade do ciclo menstrual</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>O piruvato de sódio é comumente adicionado aos meios de cultura de células como fonte de carbono, além da glicose</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>Recuperação de embriões e observação do desenvolvimento embrionário</td></tr></tbody></table>

estabelecimento de um modelo de implantação embrionária in vitro

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

A implantação do embrião é o primeiro passo para o estabelecimento de uma gravidez bem-sucedida. Um modelo in vitro para implantação de embriões é fundamental para pesquisa biológica básica, desenvolvimento de medicamentos e triagem. Este trabalho apresenta um modelo in vitro simples, rápido e altamente eficiente para implantação embrionária. Neste protocolo, primeiro apresentamos a aquisição de blastocisto de camundongo e a preparação de células de adenocarcinoma endometrial humano (Ishikawa) para implantação, seguida pelo método de co-cultura para embriões de camundongo e células de Ishikawa. Finalmente, realizamos um estudo para avaliar o impacto de concentrações variáveis de 17-β-estradiol (E2) e progesterona (P4) nas taxas de adesão embrionária com base neste modelo. Nossos achados revelaram que altas concentrações de E2 reduziram significativamente a adesão embrionária, enquanto a adição de progesterona poderia restaurar a taxa de adesão. Este modelo oferece uma plataforma simples e rápida para avaliar e rastrear moléculas envolvidas no processo de adesão, como citocinas, drogas e fatores de transcrição que controlam a implantação e a receptividade endometrial.

No processo de técnicas de reprodução assistida, a hiperestimulação ovariana controlada (COH) é uma etapa crucial, levando a níveis significativamente elevados de estrogênio em pacientes em mais de 10 a 20 vezes em comparação com os ciclos naturais11. Diante desse contexto, perguntamos se altas concentrações séricas de estrogênio afetam a implantação do embrião durante a transferência de embriões frescos. Com base nesse modelo de implantação embrionária, estudamos os efeitos de várias concentrações de E2 e P4 nas taxas de implantação embrionária12. Após o tratamento de fome, as células de Ishikawa foram incubadas com E2 (0, 0,1, 1, 10 e 100 nM) ou uma combinação de E2 e P4 (0-0, 100-0, 100-10 e 100-100 nM) por 48 h. As células foram então transferidas para placas de 12 poços revestidas com gelatina e 5-15 blastocistos foram adicionados a cada poço. Cada grupo foi replicado 3x e as taxas de implantação foram determinadas após 48 h.
Os resultados demonstraram que concentrações quase fisiológicas de E2 (10 nM) aumentaram as taxas de implantação embrionária em comparação com 0 nM E2. No entanto, concentrações ultra-altas de E2 (100 nM) reduziram significativamente as taxas de implantação embrionária. A adição de P4 dose-dependente aliviou os efeitos negativos do E2 ultra-alto na implantação (Figura 6). Com base neste modelo in vitro , ilustramos os efeitos negativos de concentrações ultra-altas não fisiológicas de estrogênio na implantação embrionária e introduzimos ainda mais a aplicação desse modelo na pesquisa científica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig01.jpg"> Figura 1: Excisão do oviduto de camundongo. Estique o oviduto, o ovário e as almofadas de gordura com uma pinça e primeiro corte o oviduto e o ovário com uma tesoura e, em seguida, retire o oviduto do útero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig02.jpg"> Figura 2: Recuperação do zigoto. A ampola de aumento da trompa de Falópio é perfurada com fórceps para liberar o complexo cumulus-zigoto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig03.jpg"> Figura 3: Isolamento de zigotos nus com digestão de hialuronidase. Usando uma pinça, transfira cuidadosamente o complexo cumulus-zigoto para uma solução M2 contendo 0,5 mg / mL de hialuronidase e deixe por alguns minutos até que as células do cumulus se desprendam dos zigotos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig04.jpg"> Figura 4: Cultura in vitro de embrião de camundongo. Prepare 12 microgotículas de meio KSOM, cada uma com um volume de 20 μL. Cubra as microgotículas com 3-5 mL de óleo mineral. Transfira os embriões de camundongo do meio M2 para a metade superior das microgotículas KSOM para lavagem completa, coloque os embriões lavados na metade inferior e incube-os a 37 ° C com 5% de CO2 por 4 dias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig05.jpg"> Figura 5: Implantação embrionária. Coloque delicadamente 5-15 blastocistos frescos em cada poço da placa de 12 poços contendo células de Ishikawa para co-cultura. Após 48 h de incubação, mova rapidamente a placa 3x. Embriões soltos exibirão movimento flutuante ou rolante sobre a superfície das células de Ishikawa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig06.jpg"> Figura 6: Efeito do estrogênio de concentração ultra-alta na taxa de implantação do embrião. O asterisco indica uma diferença estatisticamente significativa, P &lt; 0,05. Abreviaturas: E2 = estradiol; P4 = progesterona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve metodologias para estabelecer um modelo simples e eficiente de implantação embrionária in vitro para avaliar as moléculas relevantes que afetam o processo de implantação embrionária.

Estabelecimento de um Modelo de Implantação Embrionária In Vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...

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Biologia

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Aprenda a estabelecer um modelo in vitro de implantação embrionária usando embriões de camundongo e células endometriais. Este método revela como altas concentrações de estrogênio reduzem as taxas de implantação, enquanto a progesterona mitiga esses efeitos, oferecendo novas estratégias para melhorar os resultados de fertilização in vitro.

Estabelecimento de um Modelo de Implantação Embrionária In Vitro

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