Eletropenetrografia AC-DC para o Estudo dos Comportamentos de Sondagem e Ingestão de Mosquitos Culex tarsalis em Mãos Humanas

Nosso grupo está usando o EPG para estudar como os arbovírus e outros fatores afetam os comportamentos de sondagem e ingestão que ocorrem durante a alimentação sanguínea, já que muitos patógenos manipulam o comportamento do vetor para aumentar a transmissão. Basicamente, estamos estudando o que acontece durante uma picada de mosquito e como esses comportamentos influenciam a transmissão de patógenos e a patologia da doença. Historicamente, o EPG foi predominantemente usado para estudar insetos que se alimentam de plantas.

O recente desenvolvimento de procedimentos de AC-DC EPG para artrópodes que se alimentam de sangue nos permite estudar os comportamentos de sondagem e ingestão que ocorrem durante a alimentação sanguínea em detalhes sem precedentes, sem a necessidade de procedimentos invasivos, possivelmente permitindo o desenvolvimento de novas estratégias de manejo. O maior desafio do uso de EPG em artrópodes que se alimentam de sangue é correlacionar as formas de onda com atividades biológicas como salivação e transmissão de patógenos. Temos fortes hipóteses baseadas nas origens elétricas das formas de onda e na literatura, mas ainda precisamos de evidências empíricas.

Para começar, passe a ponta de uma pipeta de pasto de vidro através de uma chama, girando levemente a pipeta. Inspecione o diâmetro e repita o processo para levar a pipeta ao tamanho desejado. Para fazer um aspirador de insetos, cubra a extremidade grande da pipeta de pastagem modificada com mosquiteiro e insira no tubo de silicone conectado a um aspirador de laboratório que prende a junção com fita isolante.

Para os eletrodos de gravação, enrole um bloco de espuma com filme plástico novo para segurar os tocos de insetos preparados e os mosquitos com fio. Raspe o centímetro superior do fio de cobre com uma lâmina de barbear até brilhar por todos os lados. Em seguida, corte o fio de ouro de 0,025 milímetro de diâmetro em pedaços de quatro a cinco centímetros de comprimento.

Segure o fio em uma pinça de fechamento automático mascarada com fita adesiva para evitar amassar o fio, enrole suavemente o fio de ouro três vezes ao redor do fio de cobre do toco de inseto, começando ao longo da ponta limpa do fio de cobre. Use uma sonda de dissecação para aplicar cola de prata para manter o fio de ouro no lugar. Depois de garantir que não haja pontas soltas, coloque o toco de inseto na espuma até que a cola seque.

Em seguida, acaricie suavemente o fio de ouro preso ao toco de inseto para moldá-lo em um arco longo e suave e apare o fio para aproximadamente 2,5 a 3 centímetros de comprimento. Trabalhando sob um microscópio de dissecação, segure o toco de inseto pelo prego de latão com a mão não dominante enquanto o fio de ouro toca o estágio do microscópio de dissecção e segure a extremidade do fio de ouro com uma pinça de ponta fina usando a mão dominante, use a pinça de ponta fina para cruzar a ponta do fio de ouro sobre o fio de cobre do toco de inseto perto da área colada. Em seguida, puxe suavemente o toco de inseto até que o fio de ouro forme um pequeno laço de ouro ao redor da pinça de ponta fina.

Solte o fio de ouro e remova cuidadosamente a pinça. Enquanto segura o toco de inseto na mão não dominante, segure o laço de ouro com uma pinça de ponta fina. Puxe o toco de inseto enquanto gira levemente a pinça para longe do toco até que o laço se dobre em um ângulo de 90 graus em relação ao pescoço do fio.

Certifique-se de que o laço dourado esteja totalmente fechado antes de devolver o toco de inseto ao bloco de espuma. Para começar, prepare o aspirador de insetos e os eletrodos de gravação para a fiação dos mosquitos. Posicione os mosquitos anestesiados de costas na almofada de anestesia com o abdômen voltado para o pesquisador.

Depois de colocar uma fita de laboratório, aplique uma gota de 0,5 centímetro de cola de prata recém-misturada na fita. Em seguida, aspire o abdômen de um mosquito anestesiado para o aspirador. Usando a sucção apenas o tempo suficiente para assentar o abdômen no lugar e segurar o mosquito sob o escopo de dissecação acima da cola de prata usando o aspirador.

Depois de mergulhar um alfinete de minuchin na cola de prata, aplique uma camada fina no pronoto do mosquito. Mergulhe rapidamente o laço de ouro na ponta do eletrodo de gravação na cola de prata. Coloque-o no ponto de cola prateada no pronoto do mosquito e balance o laço para frente e para trás para garantir que fique nivelado.

Em seguida, recoloque o toco de inseto na espuma em um ângulo que permita que o mosquito com fio fique confortavelmente em pé quando acordar. Assim que o número desejado de mosquitos estiver conectado, coloque o bloco de espuma em uma caixa de armazenamento e mantenha-o. Para começar, conecte os eletrodos de gravação aos mosquitos no dia do experimento de eletropenetografia ou EPG.

Quando o host estiver em posição, gire o amplificador de cabeça para o lado. Depois de remover um mosquito com fio, insira o pino de latão do toco de inseto na porta do amplificador de cabeçote. Inicie a gravação usando o software de gerenciamento de hardware.

Posicione o amplificador de cabeça acima da mão para que o mosquito possa ficar de pé e sondar confortavelmente. Ligue o amplificador de cabeçote enquanto estiver aterrado. Ajuste a posição da mão do host conforme necessário para ajudar no sucesso da sondagem.

Use o software de gerenciamento de hardware para fazer observações com carimbo de data/hora sobre as respostas do hospedeiro, comportamentos de mosquitos, alterações de ganho e outros eventos relevantes durante a gravação. Ajuste a posição dos sinais na tela e o ganho do software usando o software de gerenciamento de hardware para manter os dois sinais claramente visíveis. Para ajustar o ganho de hardware, gire o intervalo do canal um e os interruptores multiplicadores.

Se esse ajuste não for suficiente, gire o botão de ganho do canal um para a direita ou esquerda para aumentar ou diminuir o ganho, respectivamente, para evitar picos de pico ou pouco claros. Para sintonizar o deslocamento, gire a chave de deslocamento do canal um na caixa de controle para neg. Em seguida, gire o dial de deslocamento do canal um até que os picos nos sinais pré e pós ocorram na mesma direção na tela do computador.

Se o mosquito estiver no meio de uma sonda, deixe-a terminar. Se não sondar em 10 minutos, desligue o amplificador da cabeça. Peça ao hospedeiro que remova cuidadosamente a mão e, em seguida, remova o mosquito com o toco de inseto anexado.

Por fim, recoloque o mosquito na caixa de armazenamento. As gravações de EPG AC-DC de mosquitos Culex tarsalis alimentando-se de mãos humanas geraram formas de onda interpretáveis adequadas para classificação em famílias, tipos e subtipos.