Name: Procedimentos para o cultivo in vitro de Treponema pallidum, a espiroqueta da sífilis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda o cultivo in vitro de Treponema pallidum em co-cultura com células Sf1Ep. Este método escalável permite produzir grandes quantidades da espiroqueta e gerar culturas clonais para pesquisa sobre sífilis.

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<meta charset="utf8"></head><body>Cultivo in vitro escalável de T. pallidum usando co-cultura de células de mamíferos

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E8008</td><td></td></tr><tr><td>10x Earle' s Sais Balanceados, sem Mg2+, Ca2+</td><td>Gibco</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga descartáveis estéreis cônicos de 15 e 50 mL&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>frascos criogênicos de 2 mL&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de células de 6 poços para cultivo de T. pallidum</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>As placas devem ter tampas de baixa evaporação.</td></tr><tr><td>70% de etanol</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 frascos de cultura de tecidos com tampas ventiladas</td><td>Corning</td><td>43061U</td><td></td></tr><tr><td>93,5% de nitrogênio, 5% de CO2 e 1,5% de oxigênio para meio e culturas de pré-equilíbrio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>95% de nitrogênio e 5% de CO2 para meio de pré-equilíbrio e culturas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de 96 poços de baixa evaporação transparentes, tratadas com cultura de tecidos de fundo plano</td><td>Corning Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal ajustável com capacidade de 200 ul&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Opcional, mas muito útil para clonagem</td></tr><tr><td>de água de grau de cultura de células</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 1066 sem L-Glutamina ou Vermelho de Fenol</td><td>US Biological</td><td>C5900-03A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 para incubadoras de tri-gas e cultura de tecidos&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de armazenamento de cultura de células de nitrogênio líquido criogênico</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro descartáveis, 0.2 &micro; m , > capacidade de 100 mL</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas descartáveis: 25 mL, 10 mL, 5 mL, aspiração</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (grau de cultura de células estéreis)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, inativado pelo calor&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Recomendamos vivamente este produto. Deve pré-selecionar a compatibilidade de cultura T. pallidum se estiver usando uma marca ou número de catálogo diferente.</td></tr><tr><td>Freezer com capacidade de manter -70 &deg; C ou -80 &deg; C</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para armazenamento de T. pallidum; o armazenamento de nitrogênio líquido pode ser usado em vez</td></tr><tr><td>disso Meio de congelamento (meio Sf1Ep + 10% [v/v] DMSO)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cilindros de gás com conexões apropriadas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Frasco anaeróbico ventilado GasPak 150 (Jarra de cerveja)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-816</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Câmaras de contagem Helber com decisões Thoma</td><td>Hawksley Medical and Laboratory Equipment</td><td></td><td>Para quantificar T. pallidum</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Para quantificação de células Sf1Ep</td></tr><tr><td>Incubadora interruptor de tanque</td><td>NuAire&nbsp;</td><td>NU-1550 TankGuard Interruptor Automático do Tanque da Incubadora de CO2</td><td>Opcional, mas muito útil na manutenção das condições apropriadas de O2.</td></tr><tr><td>Microscópio invertido com óptica de contraste de fase</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para visualização de culturas de células Sf1Ep</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio com condensador de campo escuro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O microscópio deve ter uma objetiva de 40x e oculares de 15x.</td></tr>Adaptador multicanal <tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>para aspirador&nbsp;</td><td>Integra</td><td>155520</td><td>Opcional, mas útil para clonagem</td></tr><tr><td>de células NaHCO3 (7,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio para incubadora tri-gás</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>Sf1Ep (NBL-11) células</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CCL-68</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td> <td>de sódioSigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>PBS estéril (sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio)&nbsp;</td>Reservatórios de reagentes estéreis <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>, 50 ou 100 mL tamanho</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T. pallidum amostra, congelado ou fresco&nbsp;</td><td></td><td></td><td>de uma infecção de coelho ou cultura in vitro</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos mantida a 37 &deg; C, 5% CO2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos Tri-gas mantida a 34 & C, 5% CO2, 1,5% O2</td><td>Thermofisher</td><td>Heracell&trade; Incubadora de CO2 Tri-Gas VIOS 160i</td><td>Opcional; potes anaeróbicos podem ser usados em vez disso (ver Ref. 17)</td></tr> <tr><td>Solução de tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de vácuo (por exemplo, aspirador doméstico), tubo de vácuo, medidor de vácuo e conectores</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Água, adequada para cultura de células, esterilizada por filtro, purificada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td>Recomendado para preparação de meios; diminui a variabilidade da cultura</td></tr></tbody></table>

procedimentos para o cultivo in vitro de treponema pallidum, a espiroqueta da sífilis

Procedures for In Vitro Cultivation of Treponema pallidum, the Syphilis Spirochete

Usando as condições descritas, T. pallidum normalmente retém&gt;90% de motilidade e se multiplica logaritmicamente com um tempo de duplicação de 33 h a 45 h por aproximadamente 7 dias antes de entrar na fase estacionária (Figura 3). Ao longo de 1 semana, as espiroquetas sofrem aproximadamente 4-5 duplicações (Figura 4). ). Além disso, diferentes cepas de T. pallidum podem crescer em taxas diferentes. As cepas do grupo SS14 de T. pallidum tendem a ter tempos de duplicação mais lentos do que as do grupo Nichols17.
A alimentação das culturas pode estender o tempo de cultura por vários dias, mas a camada de células Sf1Ep geralmente falha após uma semana de cultura. Além disso, os treponemas atingem um limite superior de organismos de cerca de 5 x 107/mL. As culturas transferidas em intervalos de 7 dias geralmente continuam a multiplicação logarítmica com pouca ou nenhuma fase de defasagem. Organismos na fase estacionária muitas vezes se tornam difíceis de passar.
A maioria dos T. pallidum está ligada às células Sf1Ep. No entanto, T . pallidum permanece suficiente no sobrenadante para que amostras de meio possam ser removidas periodicamente para verificar a viabilidade e multiplicação. Se for necessária uma quantificação cuidadosa, o volume do meio removido deve ser medido, o número de T. pallidum quantificado e o número total de organismos removidos adicionado às contagens finais na colheita.
Em estudos anteriores, a eficiência de clonagem (número de culturas positivas por organismo inoculado) foi de 12,5% para 2 T. pallidum inoculado por poço e 6,7% para 0,5 T. pallidum inoculado por poço27. Assim, é provável que qualquer poço positivo represente o crescimento de um único organismo em qualquer um desses inóculos. No entanto, a clonalidade das populações resultantes deve ser verificada examinando a homogeneidade da cultura em locais heterogêneos na cultura original. A maneira mais definitiva de demonstrar que a cultura é isogênica é por meio do sequenciamento do genoma completo27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig01.jpg"> Figura 1: Fluxograma do procedimento de cultivo de T. pallidumin vitro . Esta figura foi reimpressa com permissão de Edmondson e Norris (2021)19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama do sistema para equilibrar os reagentes de cultura de T. pallidum em um ambiente com baixo teor de oxigênio. Uma ventilação do frasco de cervejeiro é conectada por meio de uma junta em T a uma fonte de vácuo (como um aspirador doméstico) e a cilindros de gás contendo misturas de gases personalizadas (5% CO2, nitrogênio de equilíbrio e 1,5% O2, 5% CO2, nitrogênio de equilíbrio). Um medidor de vácuo em linha mede o vácuo aspirado no frasco. O vácuo é aspirado no frasco a aproximadamente -58 kPa. O frasco evacuado é então lentamente reabastecido com as misturas de gases. O frasco Brewer é reabastecido três vezes com 5% de CO2, equilibra o nitrogênio antes de uma evacuação final e reabastece com 95% de N2, 5% de CO2, 1,5% de O2. As culturas ou meios são então removidos do frasco e rapidamente transferidos para a incubadora de baixo oxigênio. Alternativamente, a tubulação entre o frasco Brewer e a primeira junta em T pode ser clamped firmemente, o tubo desconectado da junta em T e todo o frasco Brewer pode ser transferido para uma incubadora a 34 °C. Esta figura foi reimpressa com permissão de Edmondson e Norris (2021)19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig03.jpg"> Figura 3: Curvas de crescimento de T. pallidum cultivado com células Sf1Ep com meio TpCM-2. Culturas triplicadas paralelas foram semeadas com T. pallidum. As repetições foram colhidas em cada ponto de tempo; os resultados representam a média + EPM para essas culturas. (A) As mudanças em T. pallidum por cultura e (B) motilidade percentual são mostradas. Essa figura foi adaptada com permissão de Edmondson et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig04.jpg"> Figura 4: Exemplo de passagem de cultura in vitro de T. pallidum, cepa Nichols. Culturas triplicadas paralelas foram semeadas com T. pallidum e passadas semanalmente usando uma diluição de 1:20. O gráfico dente de serra mostra o número de T. pallidum por cultura e o número transferido para novas culturas em cada ponto de tempo. Os resultados representam a média ± SEM para três repetições biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Volume médio e taxas de semeadura para vasos de cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Meios para cultivo de T. pallidum . Todos os meios devem ser esterilizados por filtro após a preparação. O meio Sf1Ep pode ser armazenado a 4 °C por até dois meses. O TpCM-2 é normalmente feito um dia antes do uso. O meio de dissociação deve ser aliquotado e congelado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Procedimentos para o cultivo in vitro de Treponema pallidum, a espiroqueta da sífilis

For over a century, Treponema pallidum subsp. pallidum, the spiral-shaped bacterium that causes syphilis, could only be propagated by inoculation and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Eggers, C. H. Manipulação genética mediada por phage da espiroqueta da doença de Lyme Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra a preparação de uma cultura de Borrelia burgdorferi geneticamente modificada com DNA de bacteriófago dormente carregando um gene de resistência a antibióticos. Após a seleção e incubação de antibióticos, um indutor químico desencadeia danos ao DNA, levando à excisão, replicação e montagem de novos vírions contendo o gene de resistência. Após...

Preparação e Indução de Culturas de Borrelia burgdorferi para Produção de Partículas Virais

Source: Berthold, A., et al. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp.(2022)This video demonstrates the cultivation of pathogenic spirochetes from infected skin tissue to model dermal infection. It highlights their localization in the dermis, interaction with the extracellular matrix, and survival during selective culture conditions.

Cultivation of Pathogenic Spirochetes to Investigate Skin Infection

A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

A capacidade dos bacteriófagos de mover o DNA entre as células bacterianas os torna ferramentas eficazes para a manipulação genética de seus hospedeiros bacterianos. Apresenta-se aqui uma metodologia para induzir, recuperar e utilizar φBB-1, um bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transduzir DNA heterólogo entre diferentes cepas da espiroqueta da doença de Lyme.

Manipulação Genética Mediada por Fagos da Espiroqueta da Doença de Lyme Borrelia burgdorferi

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A eletroporação é um método rápido e amplamente adotado para a introdução de DNA exógeno no gênero Rickettsia. Este protocolo fornece um método de eletroporação útil para a transformação de bactérias intracelulares obrigatórias no gênero Rickettsia.

Um método de eletroporação para transformar Rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos

Este estudo apresenta um protocolo detalhado para a realização de microscopia de expansão ultraestrutural em três estágios do ciclo de vida in vitro do Trypanosoma cruzi, o patógeno responsável pela doença de Chagas. Incluímos a técnica otimizada para proteínas do citoesqueleto e marcação de pan-proteoma.

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