ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
	<li>Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.</li>
	<li>Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.</li>
	<li>Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.</li>
	<li>Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.</li>
	<li>Aviram N, Schuldiner M. Targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum at a glance. J Cell Sci. 2017;130(24):4079-85.</li>
	<li>Dahan N, et al. Peroxisome function relies on organelle-associated mRNA translation. Sci Adv. 2022;8(2):eabk2141.</li>
	<li>Koppers M, et al. Receptor-specific interactome as a hub for rapid cue-induced selective translation in axons. Elife. 2019;8:e48718.</li>
	<li>Hafner AS, et al. Local protein synthesis is a ubiquitous feature of neuronal pre- and postsynaptic compartments. Science. 2019;364(6441):eaau3644.</li>
	<li>Biever A, et al. Monosomes actively translate synaptic mRNAs in neuronal processes. Science. 2020;367(6477):eaay4991.</li>
	<li>Williams CC, Jan CH, Weissman JS. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):748-51.</li>
	<li>Lesnik C, et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria. Nat Commun. 2014;5:5711.</li>
	<li>Gold VA, Chroscicki P, Bragoszewski P, Chacinska A. Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep. 2017;18(10):1786-800.</li>
	<li>Simsek D, et al. The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell. 2017;169(6):1051-65.e18.</li>
	<li>Kondrashov N, et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 2011;145(3):383-97.</li>
	<li>Shi Z, et al. Heterogeneous ribosomes preferentially translate distinct subpools of mRNAs genome-wide. Mol Cell. 2017;67(1):71-83.e7.</li>
	<li>Genuth NR, et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.</li>
	<li>Li H, et al. A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility. Nature. 2022;612(7941):725-31.</li>
	<li>Milenkovic I, et al. Dynamic interplay between RPL3- and RPL3L-containing ribosomes modulates mitochondrial activity in the mammalian heart. Nucleic Acids Res. 2023;51(11):5301-24.</li>
	<li>Sloan KE, et al. Tuning the ribosome: the influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017;14(9):1138-52.</li>
	<li>Simsek D, Barna M. An emerging role for the ribosome as a nexus for post-translational modifications. Curr Opin Cell Biol. 2017;45:92-101.</li>
	<li>Baghirova S, Hughes BG, Hendzel MJ, Schulz R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2015;2:440-5.</li>
	<li>Jagannathan S, Nwosu C, Nicchitta CV. Analyzing mRNA localization to the endoplasmic reticulum via cell fractionation. Methods Mol Biol. 2011;714:301-21.</li>
	<li>Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171-84.</li>
	<li>Jan CH, Williams CC, Weissman JS. Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):1257521.</li>
	<li>Dakshinamurti K, Chalifour L, Bhullar RP. Requirement for biotin and the function of biotin in cells in culture. Ann N Y Acad Sci. 1985;447:38-55.</li>
	<li>Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012;196(6):801-10.</li>
	<li>Branon TC, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-7.</li>
	<li>Rhee HW, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 2013;339(6125):1328-31.</li>
	<li>Benedetti L, et al. Optimized Vivid-derived Magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife. 2020;9:e63230.</li>
	<li>Zhang Z, et al. A subcellular map of translational machinery composition and regulation at the single-molecule level. Science. 2025;387(6738):eadn2623.</li>
	<li>Weinberg BH, et al. High-performance chemical- and light-inducible recombinases in mammalian cells and mice. Nat Commun. 2019;10(1):4845.</li>
	<li>Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1-10.8.11.</li>
	<li>Gravel P. Protein blotting by the semidry method. In: Walker JM, editor. The protein protocols handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 321-34.</li>
	<li>Kirkeby S, Moe D, Bog-Hansen TC, Van Noorden CJ. Biotin carboxylases in mitochondria and the cytosol from skeletal and cardiac muscle as detected by avidin binding. Histochemistry. 1993;100(6):415-21.</li>
	<li>Chandler CS, Ballard FJ. Multiple biotin-containing proteins in 3T3-L1 cells. Biochem J. 1986;237(1):123-30.</li>
	<li>Jaaro H, Rubinfeld H, Hanoch T, Seger R. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3742-7.</li>
	<li>Dang CV, Lee WM. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol. 1988;8(10):4048-54.</li>
	<li>Snaar S, et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol. 2000;151(3):653-62.</li>
	<li>Shibata Y, et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2008;283(27):18892-904.</li>
	<li>Palmer AE, et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 2006;13(5):521-30.</li>
	<li>Seth RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF3. Cell. 2005;122(5):669-82.</li>
	<li>Collins JC, et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2. J Biol Chem. 1988;263(23):11280-3.</li>
	<li>Moskowitz M, Cheng DK, Moscatello DK, Otsuka H. Growth stimulation of BHK cells in culture by free biotin in serum. J Natl Cancer Inst. 1980;64(3):539-44.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C armazenamento</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>0,1% gelatina em água</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Unidades de filtro de 0,2 &micro;m</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>0,5% tripsina-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 7,5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>Opcional: para inserir FTA em um locus de proteína ribossômica endógena</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 e 2 mL, autoclavados</td><td></td><td></td><td>Para transfecção</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5, 2 mL e 5 mL de ligação de proteína baixa</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecido de 10 cm</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Concentrado de tampão de corrida Tris/glicina/SDS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecido de 37 &deg;C x 2</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular. Um destes serve como a principal incubadora para cultura celular e iluminação das células transfectadas. Espaço temporário é necessário em um segundo incubadora no dia da ativação ALIBi para abrigar as células transfectadas enquanto se configura o transiluminador na incubadora principal.</td></tr><tr><td>Banho de água de 37 &deg;C</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>50 mM biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Buffer Laemmli 6x</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td></td><td></td><td>Para desinfecção</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Kit de protease AcTEV</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Plasmid de fragmento C-ALIBi</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>Escala midi-prep é necessária para transfecção</td></tr><tr><td>Plasmid de fragmento N-ALIBi</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>Escala midi-prep é necessária para transfecção</td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td></td><td></td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-FLAG</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-mouse</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Rpl12</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Rpl31</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Rpl5</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-V5</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (pequeno) ou DR196 (grande)</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Álbumina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Dicas C18 (dicas OMIX C18)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento de células</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Centrífuga adaptada para tubos cônicos de 15 mL e/ou 50 mL</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Centrífuga para tubos de microcentrífuga de 1,5-2 mL</td><td></td><td></td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade. Deve ser capaz de refrigeração até 4 C e velocidades de até 17.000 g. Idealmente, está localizado em uma sala que pode ser temporariamente escurecida ao transferir tubos para dentro e para fora.</td></tr><tr><td>Kit Clarity ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Tanque de gel Criterion</td><td>Bio-Rad</td><td>1656001</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Gels pré-moldados Criterion TGX, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>5671095</td><td>Para Western blot. Tamanhos e layouts de poços adicionais disponíveis</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7698-5G</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Desoxicolato</td><td>MilliporeSigma</td><td>S1827</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Ditiotritol</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA39255</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>FBS qualificado para ES</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-009-B</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Gold Shield</td><td>412828</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>459828</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>MilliporeSigma</td><td>A117</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Analisador de tamanho de fragmento

isolamento de subpopulações subcelulares de ribossomo baseado em biotinilação iluminada aprimorada por localização específica de etiquetas peptídicas recombinantes

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis buffer, and wash buffers. Using a pipette, mix buffers containing dense or viscous components to ensure even mixing. Chill the prepared buffers on ice before use.Re-suspend the stock bottle of streptavidin beads by gentle pipetting or rocking. Transfer 450 microliters of beads into a protein low binding tube for each 10 centimeter plate of cells. Place the re-suspended beads on the magnetic rack for one minute, or until the beads have fully migrated.Aspirate and discard the bead storage buffer without touching the bead pellet. Wash the beads two times with 900 microliters of RNAs removal buffer. Wash the beads once with 900 microliters of salt wash.Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer. Store the beads in the wash I buffer at four degrees Celsius while performing activation and cell lysis. Add biotin and CHX to the warmed aliquot of media and keep at 37 degrees Celsius until use.Add CHX to the cold DPBS aliquot and keep it chilled until use. Aspirate the media from the transfected plates. Immediately add 10 milliliters of warm media containing CHX with or without Biotin to each plate.Place negative control plates in a dark incubator. Place the remaining plates directly on top of the transilluminator. Turn on the transilluminator and incubate the plates for 15 minutes.Wash each plate two times with the 10 milliliters of cold DPBS containing CHX. Place the plates on ice between and after washes. After aspirating the second wash, tilt the plate and aspirate any residual DPBS.Keeping the plate flat on ice, add two milliliters of ice-cold lysis buffer and incubate the plate on ice for five minutes. Tap the plate two to three times during incubation to dislodge cells. Using a micropipette, pipette the lysate up and down across the plate surface to dislodge any remaining cells.Transfer the lysate to a chilled labeled protein low binding tube. In difficult to lyse organelles, sonicate all samples for 45 seconds at four degrees Celsius. And if required, transfer the lysate into a larger tube before sonication.Transfer the sonicated lysate into a two-milliliter tube. Incubate the lysate on ice for 15 minutes. Centrifuge the lysate at 17, 000 G for three minutes at four degrees Celsius.Transfer the supernatant into a chilled protein low binding tube without disturbing the pellet. Using a magnetic rack, pellet the washed strepped avident beads. Aspirate the wash one buffer.Transfer 1, 200 microliters of clarified lysate to the tube containing the washed beads. Pipette up and down gently to re-suspend the beads. Store the remaining clarified lysate at minus 80 degrees Celsius.Incubate the lysate with the beads at four degrees Celsius in the dark on a tube rotator for one hour. During the incubation, prepare the Tobacco Etch Virus, or TEV elution buffer. Pellet the beads on a magnetic rack.Transfer the supernatant to a chilled protein low binding tube. Store the supernatant at minus 80 degrees Celsius. Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer and once with 900 microliters of wash II buffer.Add 450 microliters of TEV elution buffer to the beads. Incubate the beads in TEV elution buffer for one hour at room temperature on a tube rotator. Pellet the beads on the magnetic rack.Transfer the elute to a protein low binding tube. Store the eluate at minus 80 degrees Celsius if proteomics analysis or Western blot is intended. Cells containing all system components showed a L31-FTA band, which was stronger with full length burray and faint or absent when components were omitted.Endogenous biotinilated carboxylase proteins were detected in all lysates at 70 to 80 kilodaltons and 120 to 130 kilodaltons. ANTV5 probing confirmed expression of the split bore fragments. Biotinillated L31FTA decreased in the flow through relative to the lysate.No biotinillated L31-FTA was present in the eluate following TEV-mediated elution. Anti-flag probing showed a cleaved L31-FTA band at a lower molecular weight than intact L31-FTA ribosomal protein. S12 probing demonstrated the presence of the small ribosomal subunit in the eluate.Anti-V5 probing showed that proteins that do not bind the ribosome were absent from the eluate. When 2.5 fold more lysate was used with the same 450 microliters of streptavidin coated beads, a substantial amount of biotinilated L31-FTA remained in the flow through. Endogenous biotinilated proteins were partially depleted in the flow through.Endogenous biotinillated proteins were absent from the eluet, but were recovered after heating post-dilution beads in lambly buffer. Anti-flag probing detected cleaved L31-FTA at a lower molecular weight than intact L31-FTA. Anti-V5 probing showed that the split burray fragments were absent from the eluate.ALIBi enables the identification of ribosome-bound proteins and mRNAs in specific subcellular regions, revealing differences in translation regulation. The key challenge is maintaining specific proximity labeling through careful control of targeting construct expression and illumination conditions. Following this protocol, affinity purified ribosomes and associated mRNAs can be analyzed using quantitative proteomic and transcriptomic approaches.

isolation-subcellular-ribosome-subpopulations-based-on-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Uma técnica para identificar locais de pausa de translação sobre mRNA é descrito. Este procedimento é baseado no isolamento de polipéptidos nascentes que se acumulam nos ribossomas durante in vitro tradução de um ARNm alvo, seguido de análise de tamanho das cadeias nascentes utilizando uma electroforese em gel de desnaturação.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

Descrevemos aqui uma técnica que é rotineiramente usado para isolar estavelmente ligados ribossomo complexos da cadeia nascente (RNC). Esta técnica aproveita a descoberta de que um jovem de 17 aminoácidos longo SECM "seqüência de prisão" pode parar de alongamento de tradução em uma procariótica...

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Técnicas para dissecar os mecanismos subjacentes a secreção de HIV-1 Nef em exosomes são descritos. Pequenos peptídeos específicos derivados da proteína Nef e transfecção foram explorados para determinar a estrutura, função e parceiros de ligação da secreção Modificação Região de Nef. Estes procedimentos têm relevância geral em muitos estudos mecanicistas.

Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Aqui, descrevemos a imunoprecipitação de ribossomos e o RNA associado de populações selecionadas de células de germes de camundongos machos adultos usando o sistema RiboTag. A reprodução estratégica e a imunoprecipitação cuidadosa resultam em resultados limpos e reprodutíveis que informam sobre o traduzo meme das células germinativas e fornecem uma visão dos mecanismos dos fenótipos mutantes.

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

Transferência de energia de fluorescência de molécula única é um método que rastreia a dinâmica do tRNA durante a síntese de proteína ribossômica. Ao rastrear ribossomos individuais, são identificadas populações inhomogêneas, que lançam luz sobre mecanismos. Este método pode ser usado para rastrear mudanças conformacionais biológicas em geral para revelar relações de função dinâmica em muitos outros biossistemas complexos. Métodos de molécula única podem observar etapas limitantes sem taxa e...

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.

Identificação Global de Redes de Interação Co-Translacional por Perfil Seletivo Ribosome

Apresentamos um protocolo em duas etapas para isolamento de mitocôndrias de alta qualidade que é compatível com a descoberta e quantificação de proteínas em escala de proteoma. Nosso protocolo não requer engenharia genética e, portanto, é adequado para estudar mitocôndrias de quaisquer células e tecidos primários.

Isolamento sem etiquetas em duas etapas de mitocôndrias para melhor descoberta e quantificação de proteínas

Stanford School of Medicine.  A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

Explorar mais vídeos