Name: Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-24T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda o método ALIBi para isolar ribossomos de compartimentos subcelulares específicos usando marcação por biotinilação ativada opticamente. Esta técnica permite analisar tradução localizada de mRNA e composição ribossomal com precisão espacial e temporal.

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<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C armazenamento</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>0,1% gelatina em água</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Unidades de filtro de 0,2 &micro;m</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>0,5% tripsina-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 7,5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>Opcional: para inserir FTA em um locus de proteína ribossômica endógena</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 e 2 mL, autoclavados</td><td></td><td></td><td>Para transfecção</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5, 2 mL e 5 mL de ligação de proteína baixa</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecido de 10 cm</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Concentrado de tampão de corrida Tris/glicina/SDS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecido de 37 &deg;C x 2</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular. Um destes serve como a principal incubadora para cultura celular e iluminação das células transfectadas. Espaço temporário é necessário em um segundo incubadora no dia da ativação ALIBi para abrigar as células transfectadas enquanto se configura o transiluminador na incubadora principal.</td></tr><tr><td>Banho de água de 37 &deg;C</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>50 mM biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Buffer Laemmli 6x</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td></td><td></td><td>Para desinfecção</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Kit de protease AcTEV</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Plasmid de fragmento C-ALIBi</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>Escala midi-prep é necessária para transfecção</td></tr><tr><td>Plasmid de fragmento N-ALIBi</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>Escala midi-prep é necessária para transfecção</td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td></td><td></td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-FLAG</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-mouse</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Rpl12</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Rpl31</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Rpl5</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-V5</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (pequeno) ou DR196 (grande)</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Álbumina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Dicas C18 (dicas OMIX C18)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento de células</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Centrífuga adaptada para tubos cônicos de 15 mL e/ou 50 mL</td><td></td><td></td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Centrífuga para tubos de microcentrífuga de 1,5-2 mL</td><td></td><td></td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade. Deve ser capaz de refrigeração até 4 C e velocidades de até 17.000 g. Idealmente, está localizado em uma sala que pode ser temporariamente escurecida ao transferir tubos para dentro e para fora.</td></tr><tr><td>Kit Clarity ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Tanque de gel Criterion</td><td>Bio-Rad</td><td>1656001</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Gels pré-moldados Criterion TGX, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>5671095</td><td>Para Western blot. Tamanhos e layouts de poços adicionais disponíveis</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7698-5G</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Desoxicolato</td><td>MilliporeSigma</td><td>S1827</td><td>Para lise &amp; purificação por afinidade</td></tr><tr><td>Ditiotritol</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA39255</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>FBS qualificado para ES</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-009-B</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Gold Shield</td><td>412828</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>459828</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>MilliporeSigma</td><td>A117</td><td>Opcional: para preparação de amostra para espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Analisador de tamanho de fragmento

isolamento de subpopulações subcelulares de ribossomo baseado em biotinilação iluminada aprimorada por localização específica de etiquetas peptídicas recombinantes

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Uma técnica para identificar locais de pausa de translação sobre mRNA é descrito. Este procedimento é baseado no isolamento de polipéptidos nascentes que se acumulam nos ribossomas durante in vitro tradução de um ARNm alvo, seguido de análise de tamanho das cadeias nascentes utilizando uma electroforese em gel de desnaturação.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

Descrevemos aqui uma técnica que é rotineiramente usado para isolar estavelmente ligados ribossomo complexos da cadeia nascente (RNC). Esta técnica aproveita a descoberta de que um jovem de 17 aminoácidos longo SECM "seqüência de prisão" pode parar de alongamento de tradução em uma procariótica...

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Técnicas para dissecar os mecanismos subjacentes a secreção de HIV-1 Nef em exosomes são descritos. Pequenos peptídeos específicos derivados da proteína Nef e transfecção foram explorados para determinar a estrutura, função e parceiros de ligação da secreção Modificação Região de Nef. Estes procedimentos têm relevância geral em muitos estudos mecanicistas.

Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Aqui, descrevemos a imunoprecipitação de ribossomos e o RNA associado de populações selecionadas de células de germes de camundongos machos adultos usando o sistema RiboTag. A reprodução estratégica e a imunoprecipitação cuidadosa resultam em resultados limpos e reprodutíveis que informam sobre o traduzo meme das células germinativas e fornecem uma visão dos mecanismos dos fenótipos mutantes.

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

Transferência de energia de fluorescência de molécula única é um método que rastreia a dinâmica do tRNA durante a síntese de proteína ribossômica. Ao rastrear ribossomos individuais, são identificadas populações inhomogêneas, que lançam luz sobre mecanismos. Este método pode ser usado para rastrear mudanças conformacionais biológicas em geral para revelar relações de função dinâmica em muitos outros biossistemas complexos. Métodos de molécula única podem observar etapas limitantes sem taxa e...

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.

Identificação Global de Redes de Interação Co-Translacional por Perfil Seletivo Ribosome

Apresentamos um protocolo em duas etapas para isolamento de mitocôndrias de alta qualidade que é compatível com a descoberta e quantificação de proteínas em escala de proteoma. Nosso protocolo não requer engenharia genética e, portanto, é adequado para estudar mitocôndrias de quaisquer células e tecidos primários.

Isolamento sem etiquetas em duas etapas de mitocôndrias para melhor descoberta e quantificação de proteínas

Aprenda o método ALIBi para isolar ribossomos de compartimentos subcelulares específicos usando marcação por biotinilação ativada opticamente. Esta técnica permite analisar tradução localizada de mRNA e composição ribossomal com precisão espacial e temporal.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

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