Name: Exame de piroptose por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Aprenda a identificar piroptose em células aviárias utilizando citometria de fluxo com dupla marcação para GSDME-NT e iodeto de propídio. Este método oferece uma abordagem precisa para estudar mecanismos de morte celular em espécies aviárias.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Jue Liu por sua gentil assistência. Este estudo foi apoiado por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (nº 2022YFD1800300), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32130105) e do Fundo Destinado ao Sistema de Pesquisa Tecnológica da Agroindústria Moderna (nº. CARS-40), China.

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de amostras de células
<ol><li>Cultura de células DF-1 (fibroblastos de embrião de galinha imortal) em placas de seis poços (5 x 10,5 células por poço) com Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma incubadora de 5% de CO2 a 38 °C.</li>
	<li>Quando as células atingirem 80% de confluência, descarte o meio de cultura celular contendo soro, lave as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, adicione 2 mL de meio de cultura celular sem soro a cada poço.</li>
	<li>Adicione a solução de vírus IBDV (contendo MOI calculado) a cada poço e configure um controle infectado simulado adicionando o volume de DMEM igual ao da solução de vírus.</li>
	<li>Após 1 h de adsorção do vírus, descarte o meio de cultura, lave as células com PBS três vezes, adicione 2 mL de DMEM suplementado com 2% de FBS em cada poço e continue as culturas celulares por 24 h.</li>
	<li>24 h após a infecção por IBDV, realizar tratamento com tripsina (500 μL por poço) por 1 min e posteriormente neutralizar por DMEM suplementado com 10% de FBS (2 mL por poço). Posteriormente, as células devem ser colhidas para preparar suspensões de célula única para citometria de fluxo.</li>
	<li>Centrifugue as células a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet celular em PBS e subtraia suavemente os tubos por 3 s.</li>
	<li>Centrifugue as células conforme descrito na etapa 1.6 (400 x g por 5 min a 2-8 °C).</li>
	<li>Repita a lavagem das células conforme descrito na etapa 1.7 e na etapa 1.8.</li>
	<li>Realize a contagem de células usando um hemocitômetro sob um microscópio. Em seguida, ressuspenda as células em um volume apropriado de tampão de coloração por citometria de fluxo (de modo que a concentração final da célula seja de 1 x 107 células / mL). Agite suavemente as suspensões.</li>
</ol>2. Coloração celular para citometria de fluxo
<ol><li>Adicione 100 μL das suspensões unicelulares da etapa 1.10 em tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 mm × 75 mm). Prepare células infectadas com simulações e IBDV para coloração de anticorpos anti-chGSDME-NT/CT e use IgG normal de camundongo como controle de isotipo. Enquanto isso, prepare o controle em branco e os tubos corados com células infectadas por IBDV.</li>
	<li>Adicione 1 μg de Alexa Fluor 647 marcado com anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb ou IgG normal de camundongo (como controle de isotipo) a tubos infectados por IBDV e controle simulado, respectivamente. Em seguida, agite suavemente os tubos por 3 s.</li>
	<li>Incube as células coradas a 2-8 °C ou no gelo por 30 min no escuro. Suavemente tubos de vórtice a cada 10 min.</li>
	<li>Lave as células com 1 ml de tampão de coloração por citometria de fluxo por centrifugação a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.</li>
	<li>Repita a lavagem das células conforme descrito na etapa 2.4.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo.</li>
	<li>Corar as células do grupo infectado por IBDV e do grupo infectado simulado, bem como os tubos corados com IP simples, com 10 μg/mL de PI por 10 min à temperatura ambiente, seguido pela adição de 400 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo para o ensaio de citometria de fluxo.</li>
</ol>3. Realização do ensaio de citometria de fluxo
<ol><li>Ligue o citômetro de fluxo para inicializar o instrumento e iniciar o software.</li>
	<li>Comece executando o tubo de controle em branco seguido pelos tubos corados individuais para ajustar os parâmetros de tensão e compensação do citômetro de fluxo. Utilize os canais de fluorescência FL3 e FL4, que emitem a 635 nm, para detectar fluoróforos PI e Alexa Fluor 647, respectivamente.</li>
	<li>Depois de configurar todos os parâmetros, execute todos os exemplos sequencialmente.</li>
</ol>4. Análise dos dados de citometria de fluxo
<ol><li>Analise a coloração Alexa Fluor 647 de cada amostra no histograma do canal FL4.</li>
	<li>Para avaliar a proporção de células duplamente positivas em cada amostra, utilize o gráfico de pontos de quatro quadrantes de FL3/FL4.</li>
	<li>Defina limites positivos com base em amostras de coloração dupla IgG/PI de controle de isotipo, garantindo que a proporção de células duplamente positivas permaneça abaixo de 1%. Essa abordagem facilita a medição da proporção de células duplamente positivas em todas as amostras.</li>
</ol>

Quantificando a piroptose em células DF-1 infectadas pelo vírus da doença infecciosa da bursa

<ol><li>He, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermin+D+is+an+executor+of+pyroptosis+and+is+required+for+interleukin-1%CE%B2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion.</a> Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+Gasdermin+D+for+non-canonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Angosto-Bazarra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+analyses+of+the+Dasdermin+family+suggest+conserved+roles+in+infection+response+despite+loss+of+pore-forming+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality.</a> BMC Biol. 20 (1), 9(2022).</li>
<li>De Schutter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punching+holes+in+cellular+membranes%3A+Biology+and+evolution+of+gasdermins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins.</a> Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+gasdermin+E+is+cleaved+by+caspase+1%2C+3%2C+and+7+and+induces+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis.</a> J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+gasdermin+E+is+a+substrate+of+caspase-3%2F-7+and+an+executioner+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis.</a> Front Immunol. 13, 1078526(2022).</li>
<li>Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+infectious+bursal+disease-the+past%2C+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future.</a> Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).</li>
<li>Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+infectious+bursal+disease+virus+consists+of+two+segments+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA.</a> J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).</li>
<li>Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbated+apoptosis+of+cells+infected+with+infectious+bursal+disease+virus+upon+exposure+to+interferon+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha.</a> J Virol. 92 (11), (2018).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+chicken+microRNA-16-5p+expression+in+DF-1+cells+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+enhances+IBDV-induced+apoptosis+and+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication.</a> J Virol. 94 (2), e01724(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+voltage-dependent+anion+channel+2+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptosis+in+host+cells+via+interaction+with+VP5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5.</a> J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).</li>
<li>Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+induces+apoptosis+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).</li>
<li>Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+cancer+cell+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring cancer cell pyroptosis.</a> Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-d+pore+and+its+morphology+is+different+from+mlkl+channel-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis.</a> Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este artigo descreve um método eficaz para examinar a piroptose usando citometria de fluxo, obtida por meio da coloração dupla de células infectadas com Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT McAb e PI. Essa abordagem também pode ser aplicada em vários tipos de células para diferenciar a piroptose de outros tipos de morte celular, como apoptose e necrose.
A piroptose, um tipo inflamatório de morte celular programada dependente principalmente da formação de poros da membrana plasmática induzida por Gasdermin (GSDM) D em mamíferos 1,2,3, tem sido tradicionalmente avaliada por meio de métodos como liberação de LDH 6,15, características morfológicas16 e detecção de fragmentos de GSDM-NT / GSDM-CT por meio de ensaios Western Blot ou IFA17. No entanto, nenhum desses métodos quantifica com precisão a porcentagem de células piroptóticas. Este estudo aproveita os poros característicos da membrana plasmática em células piroptóticas formadas por fragmentos de GSDM-NT para desenvolver uma estratégia baseada em citometria de fluxo para sua determinação.
Quando as células foram duplamente coradas com chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 e PI e posteriormente analisadas por citometria de fluxo nos canais de fluorescência FL3 e FL4, a piroptose foi discernível por meio de dois parâmetros simultaneamente: coloração chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 indicando formação de poros da membrana plasmática pelo fragmento N-terminal de chGSDME clivado e coloração PI indicando ruptura da membrana plasmática. Os dados demonstram que a proporção de células chGSDME-NT / PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (aproximadamente 33%) foi significativamente maior do que em controles infectados simulados (P < 0,001).
O método experimental requer várias considerações para garantir precisão e confiabilidade. Em primeiro lugar, cada tubo de amostra usado para análise de fluxo deve conter pelo menos 1 x 106 células para manter a precisão da análise de fluxo. Dadas as várias etapas de lavagem no protocolo, é aconselhável aumentar o número inicial de células em cada tubo na etapa 2.1 de acordo, por exemplo, para 2 x 106 células. É crucial lidar com a lavagem e transferência de células com extremo cuidado para evitar interrupções não intencionais da integridade celular. Além disso, lembre-se de que a densidade celular, a concentração de anticorpos e a duração da operação podem influenciar as configurações ideais dos parâmetros. Portanto, é necessário ajustar os parâmetros e configurações do citômetro de fluxo com base nas condições experimentais específicas. Neste estudo, os parâmetros utilizados foram os seguintes: FSC AmpGain foi ajustado para 1,40 e tensão SSC foi ajustada para 490 V. A porta no gráfico FSC / SSC foi definida para cobrir todas as populações de células para análise subsequente de FL3 / 4 canais. As tensões de fluorescência foram ajustadas para 600 V para o canal FL3 (PI) e 600 V para o canal FL4 (Alexa Fluor 647). A compensação foi fixada em 38,0% entre os canais FL4 e FL3. A taxa de fluxo foi definida como 200 eventos/s, com um limite de evento definido em 10.000.
Auxiliada pela nova abordagem, essa compreensão do papel da piroptose mediada por GSDME na resposta do hospedeiro a infecções patogênicas em galinhas e nos mecanismos subjacentes avançou significativamente. Através do uso de anticorpos específicos, pudemos examinar chGSDME-NT formadores de poros via citometria de fluxo, distinguindo células piroptóticas de outras e facilitando a determinação da proporção de células submetidas a piroptose. Como resultado, este método oferece uma vantagem distinta sobre os ensaios Western Blot ou IFA na detecção de células piroptóticas.
No entanto, a limitação deste protocolo reside no uso do fragmento N-terminal de GSDME de galinha em células infectadas por IBDV como um modelo experimental para estudar a piroptose. No entanto, este estudo marca a primeira utilização bem-sucedida da citometria de fluxo para determinar a piroptose.
Em resumo, o método de citometria de fluxo descrito aqui para examinar a piroptose tem grande potencial para avançar nossa compreensão dos mecanismos por trás da piroptose em mamíferos e aves. Este método se destaca como uma ferramenta eficaz que contribui para a pesquisa sobre morte celular em ciências da vida.

A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada que depende principalmente da formação de poros da membrana plasmática pela Gasdermin (GSDM) D em mamíferos 1,2,3. Devido à deficiência genética de GSDMD em galinhas 4,5, o mecanismo de piroptose em galinhas permanece indefinido. A família Gasdermin compreende proteínas conservadas, incluindo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 3,6. Estudos relataram que o GSDME de peixes teleósteos e patos é clivado por caspase-1/3/7 ou caspase-3/7 para induzir a morte celular piroptótica 7,8. No entanto, o papel da piroptose mediada por GSDME na resposta do hospedeiro a infecções patogênicas em galinhas ainda precisa ser elucidado.
A doença infecciosa da bursa (DII) é uma doença avícola aguda, altamente contagiosa e imunossupressora causada pelo IBDV9. O IBDV, um vírus de RNA de fita dupla (ds) bissegmentado não envelopado, pertence ao gênero Avibirnavirus da família Birnaviridae10. Estudos anteriores de outros e de nosso laboratório mostraram que a infecção por IBDV induz a morte celular em células hospedeiras por diferentes vias 11,12,13,14. Achados anteriores demonstraram que a infecção por IBDV desencadeia a liberação de lactato desidrogenase (LDH), um indicador de morte celular lítica 6,15, sugerindo que a infecção por IBDV induz a morte celular lítica em células hospedeiras. Além disso, os dados mostram que as células infectadas por IBDV exibem características morfológicas de morte celular piroptótica, incluindo inchaço celular com grandes bolhas soprando da membrana plasmática e coloração de iodeto de propídio (PI) positiva, sugerindo que a infecção por IBDV induz piroptose nas células.
Considerando que a formação de poros de membrana em células piroptóticas pelo fragmento N-terminal de GSDM clivado (GSDM-NT) é uma marca registrada da piroptose, teoricamente, as células piroptóticas poderiam ser detectadas por citometria de fluxo examinando GSDM-NT na membrana celular usando anticorpos específicos. Em células piroptóticas aviárias, o fragmento N-terminal de galinha Gasdermin E (chGSDME-NT) forma poros de membrana, permitindo que o iodeto de propídio (PI) passe e se ligue ao DNA. Assim, a proporção de células piroptóticas pode ser detectada por citometria de fluxo, distinguindo assim a piroptose de outras formas de morte celular, como apoptose e necrose. No entanto, o método de exame de células piroptóticas por citometria de fluxo não foi relatado. Neste estudo, as células DF-1 foram infectadas com IBDV, e a citometria de fluxo foi realizada para examinar células piroptóticas usando anticorpos monoclonais (McAb) contra o fragmento chGSDME-NT (ligado à membrana) e coloração PI. Surpreendentemente, as células piroptóticas foram efetivamente detectadas por citometria de fluxo. Além disso, a proporção de células piroptóticas pode ser quantificada. Essas descobertas fornecem um meio poderoso e eficaz para determinar a piroptose.
Este artigo descreve um método para examinar a piroptose em células infectadas por IBDV por citometria de fluxo usando coloração anti-chGSDME-NT McAb e PI. Este método também pode ser estendido a outras células infectadas por patógenos e aplicado para examinar vários tipos de células com piroptose, distinguindo-as de outras formas de morte celular.

<table><tbody><tr><td>Tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 &vezes; 75 mm)</td> <td>Corning Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células de 6 Poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 kits de rotulagem de anticorpos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-CT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)</td> <td>EU0228</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-NT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)</td><td>EU0227</td><td></td></tr><tr><td>Software CellQuest</td> Incubadora de CO2 da <td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de Congelamento Criogênica</td><td></td><td></td> Thermo Fisher Scientific 3100 Meio Eagle Modificado de Dulbecco <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> (DMEM)&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0193-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de Fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Coloração por Citometria de Fluxo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qiu-jing Reagente Bioquímico & Instrument Company (Xangai, China)</td> <td>YX-JSB52</td><td></td></tr><tr><td>IBDV Lx cepa</td><td></td><td></td><td>IBDV Lx cepa foi gentilmente cedida pelo Dr. Jue Liu, Academia de Agricultura e Silvicultura de Pequim, Pequim, China</td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Chongqing Photoelectric Instrument Company</td><td>XDS-1B</td><td></td></tr><tr><td>Normal Mouse IgG</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato salino (PBS)</td><td>M& C&nbsp; Tecnologia gênica</td><td>CC017</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio (PI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,25%</td> <td>M & C&nbsp; Oscilador</td> de vórtice Gene Technology <td>CC008</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MIULAB</td><td>MIX-28+</td><td></td></tr></tbody></table>

exame de piroptose por citometria de fluxo

Examination of Pyroptosis by Flow Cytometry

A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada predominantemente impulsionada pela formação de poros da membrana plasmática pelo terminal N gerado a partir das proteínas da família Gasdermin clivada (GSDM). O exame de GSDM-NT ligado à membrana por Western Blot é o método mais comumente usado para avaliar a piroptose. No entanto, é difícil diferenciar células com piroptose de outras formas de morte celular usando este método. Neste estudo, células DF-1 infectadas pelo Vírus da Doença Infecciosa da Bursa (IBDV) foram empregadas como modelo para quantificar a proporção de células submetidas à piroptose por citometria de fluxo, utilizando anticorpos específicos contra o fragmento N-terminal da coloração GSDME de galinha (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI). As células chGSDME-NT-positivas foram prontamente detectáveis por citometria de fluxo usando anticorpos anti-chGSDME-NT marcados com Alexa Fluor 647. Além disso, a proporção de células chGSDME-NT / PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (cerca de 33%) foi significativamente maior do que em controles infectados simulados (P < 0,001). Esses achados indicam que o exame de chGSDME-NT ligado à membrana por citometria de fluxo é uma abordagem eficaz para determinar células piroptóticas entre células submetidas à morte celular.

chGSDME-NT na membrana de células DF-1 com infecção por IBDV pode ser prontamente detectado por citometria de fluxo Uma das características mais importantes das células piroptóticas é a formação de poros de membrana por fragmentos de GSDM-NT gerados a partir da clivagem de Gasdermin. Portanto, as células piroptóticas poderiam teoricamente ser detectadas por citometria de fluxo por meio do exame de GSDM-NT em membranas celulares usando anticorpos específicos. Assim, as células DF-1 foram infectadas com IBDV, e as células piroptóticas foram examinadas por citometria de fluxo usando coloração anti-chGSDME-NT McAb e PI marcada com Alexa Fluor 647. Um número considerável de células positivas para chGSDME-NT foi detectado por citometria de fluxo após a infecção por IBDV (Figura 1). Em contraste, controles simulados ou células coradas com IgG de controle de isotipo mostraram células Alexa Fluor 647-positivas mínimas. Esses achados demonstram a detecção eficaz e específica de chGSDME-NT ligado à membrana por citometria de fluxo. É importante notar que, como os fragmentos C-terminais de chGSDME clivado (chGSDME-CT) foram retidos dentro do citoplasma em vez de translocados para a membrana plasmática como chGSDME-NT, os fragmentos de chGSDME-CT foram quase indetectáveis por citometria de fluxo usando coloração de antígeno de superfície de membrana, o que estava de acordo com o fato de que a piroptose estava associada a fragmentos de chGSDME-NT ligados à membrana.
A piroptose em células DF-1 pode ser determinada por citometria de fluxo usando coloração dupla de células com anti-chGSDME-NT marcado com fluoresceína, McAb e PI Quando as células foram duplamente coradas com Alexa Fluor 647 marcado com anti-chGSDME-NT McAb e PI, seguido de análise de citometria de fluxo nos canais de fluorescência FL3 e FL4, as células piroptóticas puderam ser determinadas pela coloração chGSDME-NT e PI sendo positiva. Como mostrado na Figura 2A,B, um número considerável de células chGSDME-NT positivas com infecção por IBDV foi detectado por ensaios de citometria de fluxo, e a proporção de células chGSDME-NT/PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (cerca de 33%) foi significativamente maior do que a de controles simulados (P &lt; 0,001), sugerindo que a formação de poros de membrana pelo chGSDME-NT foi sincronizado com a ruptura das membranas celulares, fazendo com que essas células infectadas pelo IBDV sofressem morte celular piroptótica. Esses dados mostram claramente que a infecção por IBDV induz piroptose mediada por chGSDME em células hospedeiras. Já as células PI single-positivas podem representar outras formas de morte celular induzida pela infecção por IBDV. Portanto, o exame de chGSDME-NT formador de poros por citometria de fluxo fornece um método valioso para distinguir células piroptóticas daquelas submetidas a outras formas de morte celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig01.jpg"> Figura 1: Exame de células ligadas a chGSDME-NT por citometria de fluxo. As células DF-1 foram simuladas infectadas ou infectadas com IBDV em um MOI de 1. 24 h após a infecção, as células foram colhidas e coradas com Alexa Fluor 647 marcado com Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT McAb ou isotipo controle IgG, e analisadas com citometria de fluxo. A coloração chGSDME-NT positiva no ensaio de citometria de fluxo demonstrou as células chGSDME-NT ligadas à membrana com piroptose induzida por IBDV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig02.jpg"> Figura 2: Exame de piroptose por citometria de fluxo usando coloração dupla com chGSDME-NT e PI. (A) Análise de gráfico de pontos de células piroptóticas por citometria de fluxo. As células DF-1 foram infectadas com IBDV em um MOI de 1. 24 h após a infecção, as células foram colhidas, coradas com Alexa Fluor 647 marcado com anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT McAb e PI e analisadas com citometria de fluxo. (B) A porcentagem de células piroptóticas em cada grupo em (A) foi plotada e analisada estatisticamente. A ANOVA de duas vias foi empregada para analisar a significância estatística. Os dados representaram três experimentos independentes e foram apresentados como médias ± o DP. ***P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este artigo descreve a identificação de células piroptóticas usando citometria de fluxo após coloração dupla com anticorpos contra o fragmento N-terminal de GSDME de frango (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI).

Exame de piroptose por citometria de fluxo

Pyroptosis is an inflammatory type of programmed cell death predominantly driven by the formation of plasma membrane pores by the N-terminus generated ...

examination-of-pyroptosis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Apresenta-se um método de citometria de fluxo com base para examinar o desenvolvimento das células...

Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

Este vídeo demonstra a citometria de fluxo para medir a captação microglial de biopartículas fluorescentes após a entrega intravítrea em um olho de camundongo. A citometria de fluxo detecta células vivas que expressam CD11b e distingue células da microglia fagocítica exibindo fluorescência verde de outras células mieloides, incluindo monócitos que expressam Ly6C e neutrófilos que expressam Ly6G.

Medindo a captação microglial de partículas fluorescentes entregues por via intravítrea usando citometria de fluxo

A geração de um modelo de rato ortotópico de mesotelioma pleural maligno por implantação de II-45 células de mesotelioma na cavidade pleural de ratos imuno-competentes é apresentado. Um método de citometria de fluxo para analisar sete subconjuntos de células imunitárias em animais a partir destes uma amostra de sangue de 25 uL é também descrito.

Orthotopic Implantação e Acompanhamento Peripheral Imune celular no Modelo II-45 Rat Singênico mesotelioma

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

O estado de saúde do pulmão é refletido pelo tipo e número de células imunes que estão presentes nos bronquíolos do pulmão. Descrevemos uma técnica de lavagem broncoalveolar que permite o isolamento e estudo de células não aderentes e fatores solúveis do trato respiratório inferior de camundongos.

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

A apoptose pode ser caracterizada pela análise por citometria de fluxo de biomarcadores apoptóticos precoce e tardio. A linhagem celular de câncer cervical, SiHa, foi analisada para biomarcadores de apoptose após tratamento com Actinomicina D usando citômetro de fluxo de bancada.

Análise por citometria de fluxo de biomarcadores apoptóticos em células de câncer cervical SiHa tratadas com Actinomicina D

Este protocolo descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular e a subsequente caracterização de subconjuntos celulares em plataformas citométricas de fluxo padrão.

Análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo

O teor de hidroperóxido lipídico representa o indicador mais comumente usado de morte celular ferroptótica. Este artigo demonstra a análise passo a passo da citometria de fluxo do conteúdo de hidroperóxido lipídico nas células após a indução da ferroptose.

Revelando o fenótipo ferropótico do meduloblastoma

Aprenda a identificar piroptose em células aviárias utilizando citometria de fluxo com dupla marcação para GSDME-NT e iodeto de propídio. Este método oferece uma abordagem precisa para estudar mecanismos de morte celular em espécies aviárias.

Exame de piroptose por citometria de fluxo

Explorar mais vídeos