Name: Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda imagem de cálcio in vivo em células granulares do giro dentado do hipocampo em camundongos livremente móveis. Este protocolo combina injeção viral e implante de lente GRIN em procedimento único para estudar neuroatividades cognitivas.

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Este trabalho é apoiado pelo Programa Piloto de Xangai para Pesquisa Básica - Universidade Fudan 21TQ1400100 (22TQ019), Projeto Principal de Ciência e Tecnologia Municipal de Xangai, o Laboratório Lingang (concessão nº. LG-QS-202203-09) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32371036).

Imagens em tempo real para atividade de neurônios em células do giro dentado de camundongos 

<ol><li>Scoville, W. B., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).</li>
<li>Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+hippocampal+pathology+impairs+topographical+and+episodic+memory+but+not+visual+pattern+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching.</a> Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neurophysiological+approaches+in+the+study+of+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular neurophysiological approaches in the study of learning.</a> Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).</li>
<li>Zemla, R., Basu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal function in rodents.</a> Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).</li>
<li>Basu, J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corticohippocampal+circuit%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733(2015).</li>
<li>Gobbo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+signature+of+spatial+decision-making+during+navigation+by+freely+moving+rats+by+using+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119(2022).</li>
<li>Schuette, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabaergic+ca1+neurons+are+more+stable+following+context+changes+than+glutamatergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells.</a> Sci Rep. 12 (1), 10310(2022).</li>
<li>Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding%2C+consolidation%2C+and+retrieval+of+contextual+memory%3A+Differential+involvement+of+dorsal+ca3+and+ca1+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions.</a> Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).</li>
<li>Ognjanovski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Parvalbumin-expressing+interneurons+coordinate+hippocampal+network+dynamics+required+for+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation.</a> Nat Commun. 8, 16120(2017).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Yassa, M. A., Stark, C. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the hippocampus.</a> Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).</li>
<li>Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory.+Engram+cells+retain+memory+under+retrograde+amnesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia.</a> Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+investigations+into+the+role+of+histamine+in+the+dentate+gyrus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat.</a> Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).</li>
<li>Kim, S., Jung, D., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+maps+slowly+develop+via+competitive+learning+and+conjunctive+coding+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus.</a> Nat Commun. 11 (1), 4550(2020).</li>
<li>Danielson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dentate+gyrus+mossy+cells+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice.</a> Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+gcamp6m%27s+ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m's ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0170934(2017).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normcorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+ca1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Masala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+Ca2%2B+micro-waves+following+synapsin-dependent+adeno-associated+viral+expression+of+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniscope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Cholvin, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+spatial+representation+by+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 6227(2022).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Aqui descrevemos um procedimento para imagem de cálcio in vivo no GD de camundongos. Acreditamos que este protocolo será útil para pesquisadores que pretendem estudar as funções do DG em vários processos cognitivos, particularmente nos casos em que uma subpopulação geneticamente identificada é de interesse. Aqui explicamos as vantagens do nosso protocolo, enfatizando alguns pontos-chave na cirurgia, e discutimos as limitações desse método.
Testamos vários procedimentos para imagens de DG da literatura disponível e otimizamos os procedimentos experimentais conforme detalhado neste protocolo. Em nossa opinião, as três principais modificações a seguir melhoraram muito a taxa de sucesso do nosso protocolo. Primeiro, combinamos todos os procedimentos cirúrgicos de uma só vez, enquanto muitos estudos de imagem de cálcio para regiões subcorticais realizaram injeção de vírus e implante de lentes em duas cirurgias separadas. Uma das principais vantagens de nossa abordagem é que a expressão do vírus e a recuperação do tecido cerebral estão acontecendo durante o mesmo período, reduzindo o tempo de espera para a preparação do camundongo pela metade, o que geralmente leva meses21. Além disso, cirurgias separadas requerem um reposicionamento preciso do mouse, pois pequenas inclinações com uma incompatibilidade na faixa de 100 μm levarão à falha do procedimento. Para evitar o deslocamento da lente, alguns grupos desenvolveram uma abordagem que conecta o miniscópio à lente e tentaram visualizar a expressão neuronal do sensor durante a cirurgia de implante. Essa solução alternativa requer engenharia não trivial do aparelho estereotáxico comumente usado e é complexa de usar devido à supressão das atividades dos neurônios durante a anestesia. Nosso método não requer o reposicionamento do mouse, reduzindo bastante o tempo e o estresse associados ao procedimento.
O segundo ponto-chave de nossa abordagem é que injetamos repetidamente pequenas quantidades do vírus na área-alvo22. Isso leva a mais células infectadas. É importante ressaltar que, em comparação com o aumento da carga viral em um único local de injeção, essa abordagem produziu resultados superiores, pois os locais das células infectadas se espalham uniformemente pelo campo de visão. Outro ponto-chave relacionado é que a diluição do título do vírus melhora a qualidade da imagem de cálcio. Em nossa experiência, uma quantidade excessiva de vírus está associada ao aparecimento de aglomerados de atividades em forma de onda, o que é consistente com um relatório anterior23. Embora inicialmente suspeitássemos que a aspiração de tecido pode levar à eliminação prematura do vírus no local da injeção e expressão insuficiente, não observamos tal fenômeno, e nosso protocolo geralmente produziu infecção robusta da região-alvo. Em comparação com camundongos transgênicos que expressam GCaMP, a abordagem do vírus é inevitavelmente menos consistente, mas oferece um uso mais flexível porque não requer reprodução complicada. No entanto, como a expressão do GCaMP pode se espalhar para estruturas cerebrais adjacentes ou se espalhar de forma desigual na região do cérebro alvo, o exame cuidadoso das posições anatômicas do vírus e do cristalino do tecido fixo é fundamental para a interpretação dos resultados. A combinação de linhas Cre específicas da região ou do tipo de célula com a expressão GCaMP dependente de Cre pode melhorar a especificidade dos sinais de imagem.
O terceiro ponto-chave do nosso protocolo é que, durante a implantação da lente, repetimos a inserção da lente e enxaguamos várias vezes para garantir que não houvesse sangue restante na área de implantação. Esta é uma operação fundamental para facilitar a recuperação do tecido e melhorar a taxa de sucesso do procedimento. Embora o mecanismo exato não seja conhecido, especulamos que a inserção da lente inevitavelmente causará algum dano ao tecido, e a etapa de enxágue eliminaria o sangramento associado a esse dano. Caso contrário, o sangramento associado à inserção pode levar muito tempo para o cérebro desaparecer, o que aumenta a probabilidade de inflamação local e infiltração de macrófagos, o que reduziria a qualidade óptica. Além disso, nas coordenadas que fornecemos neste protocolo, descobrimos que colocar o cristalino um pouco mais perto da sutura sagital geralmente resulta em um número aumentado de células visíveis, embora seja importante evitar perfurar o terceiro ventrículo. Também fornecemos uma lista de problemas comuns para uma melhor solução de problemas desta etapa (Tabela 1).
O mouse deve ser treinado para usar o miniscópio fictício antes de experimentos comportamentais para minimizar o impacto do peso adicional na cabeça. Normalmente, esse treinamento ocorre ~3 dias, com cada sessão durando 20 min. Durante os experimentos comportamentais, a condição física do camundongo deve ser monitorada regularmente. O desempenho comportamental do rato será muito afetado por sua saúde.
Este protocolo contém várias limitações. Em primeiro lugar, deve-se notar que a imagem de cálcio é um substituto da atividade neural, que pode ser influenciada pela expressão dos sensores. Os métodos de imagem de um fóton usando um miniscópio podem levar à sobreposição de sinais de células vizinhas, que requerem desmistura da análise subsequente. Além disso, nosso protocolo envolve cirurgias invasivas. Um pedaço de tecido cerebral é removido durante a etapa de implantação da lente GRIN, geralmente incluindo parte da região CA1, córtex retroesplenial e córtex visual associativo. Isso é necessário devido à limitação da profundidade de imagem proporcionada pela iluminação de um fóton. Em nossas observações, não notamos nenhum déficit comportamental aparente nos camundongos após o procedimento cirúrgico, nem em seus comportamentos gerais e irrestritos nem no aprendizado das tarefas de pista linear (Figura Suplementar S1). Alternativamente, o uso de instrumentos cirúrgicos automatizados para sucção de tecido cerebral pode reduzir os erros associados à operação manual, aumentando assim a precisão do procedimento cirúrgico24. Além disso, nossos dados de imagem de cálcio em geral produziram dinâmica normal do cálcio. O efeito em funções cognitivas mais complexas precisa de uma caracterização mais aprofundada. Um método alternativo para inserção de lentes sem aspiração tecidual foi descrito anteriormente25. Isso é conseguido fazendo um corte no tecido cerebral ao longo do trato de inserção pretendido e colocando a lente diretamente através da abertura. Em nossa experiência, essa abordagem leva a dobras ou outras deformações do tecido cerebral ao longo da via de inserção, que ainda podem ser invasivas. A alta variabilidade da deformação torna essa abordagem menos confiável do que o protocolo que descrevemos. Outra ressalva potencial do nosso protocolo é que o desempenho comportamental do mouse é ligeiramente afetado pelo cabo coaxial que conecta o miniscópio e a caixa de aquisição de dados (DAQ) do miniscópio. Isso não se deve apenas ao fato de os fios se enrolarem após várias voltas, mas também porque o fio pode ser uma distração para o mouse durante a tarefa. A utilização de um miniscópiosem fio 26 resolveria efetivamente esse problema. 
Apesar das limitações existentes, acreditamos que esta metodologia pode ser altamente benéfica para pesquisadores interessados em usar imagens de cálcio in vivo para estudar padrões de atividade neuronal dentro do giro dentado do hipocampo. Por exemplo, esta abordagem de imagem de cálcio in vivo pode ser aplicada para investigar células de lugar especificamente dentro da região do giro denteado. Isso permitiria a exploração de como as células de lugar codificam informações em diferentes áreas do cérebro10,27. Nossa validação indica que esse protocolo é razoavelmente reprodutível, com altas taxas de sucesso, e pode ser aplicado a diferentes regiões cerebrais.

Estudos anteriores descobriram que o hipocampo é uma estrutura cerebral essencial para processar e recuperar memórias. Desde a década de 1950, os circuitos neurais do hipocampo em roedores têm sido um foco no estudo da formação, armazenamento e recuperação da memória3. As estruturas anatômicas dentro do hipocampo incluem as sub-regiões do giro dentado (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 e subículo4. Existem conexões bidirecionais complexas entre essas sub-regiões, das quais DG, CA1 e CA3 formam um circuito trissináptico proeminente que consiste em células granulares e células piramidais5. Este circuito recebe sua entrada primária do córtex entorrinal (EC) e tem sido um modelo clássico para estudar a plasticidade sináptica. Pesquisas anteriores in vivo sobre a função do hipocampo se concentraram principalmente no CA1 6,7 devido ao seu acesso mais fácil. Enquanto os neurônios CA1 desempenham papéis importantes na formação, consolidação e recuperação da memória, particularmente nas células locais para memória espacial, outras sub-regiões do hipocampo também são vitais 8,9. Em particular, estudos recentes destacaram as funções do DG na formação da memória. As células de lugar no DG foram relatadas como mais estáveis do que as do CA110, e suas atividades refletem informações específicas do contexto11. Além disso, a marcação dependente da atividade das células granulares DG pode ser reativada para induzir comportamentos relacionados à memória12. Portanto, para obter uma compreensão mais profunda da codificação de informações em DG, é crucial investigar as atividades da sub-região DG enquanto o animal está realizando tarefas dependentes de memória.
Estudos prévios sobre as atividades de GD utilizaram principalmente eletrofisiologia in vivo 13. No entanto, essa técnica tem algumas desvantagens: primeiro, em gravações elétricas, pode ser difícil identificar diretamente os vários tipos de células que estão gerando o sinal. Os sinais registrados são de células inibitórias e excitatórias. Portanto, outros métodos de processamento de dados são necessários para separar esses dois tipos de células. Além disso, é difícil combinar outras informações de tipo de célula, como subgrupos específicos de projeção ou rotulagem dependente de atividade, com gravações elétricas. Além disso, devido à morfologia anatômica do DG, os eletrodos de registro são frequentemente implantados em uma direção ortogonal, o que limita muito o número de neurônios que podem ser registrados. Assim, é difícil para as gravações elétricas conseguirem monitorar centenas de neurônios individuais da estrutura DG no mesmo animal14.
Uma técnica complementar de registro das atividades dos neurônios no GD é usar imagens de cálcio in vivo 15. Os íons de cálcio são fundamentais para os processos de sinalização celular nos organismos, desempenhando um papel crucial em muitas funções fisiológicas, especialmente no sistema nervoso dos mamíferos. Quando os neurônios estão ativos, a concentração de cálcio intracelular aumenta rapidamente, refletindo a natureza dinâmica da atividade neuronal e da transmissão do sinal. Portanto, registrar as mudanças em tempo real nos níveis de cálcio intracelular nos neurônios fornece informações importantes sobre os mecanismos de codificação neural.
A tecnologia de imagem de cálcio utiliza corantes fluorescentes especializados ou indicadores de cálcio geneticamente modificados (GECIs) para monitorar as concentrações de íons de cálcio nos neurônios, detectando mudanças na intensidade da fluorescência, que podem ser capturadas por meio de imagens microscópicas16. Comumente, a família GCaMP de genes indicadores de cálcio, compreendendo proteínas fluorescentes verdes (GFP), calmodulina e sequências polipeptídicas M13, é empregada. O GCaMP pode emitir fluorescência verde quando se liga a íons de cálcio17, permitindo que as flutuações na fluorescência verde sejam registradas por meio de imagens18. Além disso, para obter imagens nítidas da região alvo do cérebro, uma lente de índice gradiente (lente GRIN) é normalmente implantada acima da região de interesse. A lente GRIN permite a aquisição de imagens da região profunda do cérebro que não pode ser acessada diretamente da superfície.
Essa técnica é relativamente fácil de combinar com outras ferramentas genéticas para rotular diferentes tipos de células. Além disso, como o plano de imagem é paralelo à orientação das células no DG, centenas de neurônios são acessíveis para imagens a cada cirurgia bem-sucedida. Neste trabalho, apresentamos um protocolo cirúrgico completo e detalhado para imagens de cálcio in vivo no giro dentado em camundongos (Figura 1). O procedimento envolve duas operações principais. A primeira é injetar o vírus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f no DG. A segunda operação é implantar uma lente GRIN acima do local da injeção do vírus. Estes dois procedimentos são conduzidos na mesma sessão. Após a recuperação dessas cirurgias, o próximo passo é verificar a qualidade da imagem com microscópios miniaturizados (miniscópios). Se o campo de imagem tiver centenas de células ativas, o procedimento subsequente é anexar a placa de base do miniscópio ao crânio do camundongo usando cimento dentário; O mouse pode então ser usado para experimentos de imagem. Também apresentamos um pipeline de pré-processamento baseado em MATLAB para agilizar a análise dos dados de cálcio coletados.

<table><tbody><tr><td>200 &mu; L pontas de pipeta universais</td><td>Transcat Pipetas</td><td>1030-260-000-9</td><td>Para remover o sangue e a solução salina</td></tr><tr><td>25 G luer lock agulha romba (pontas de distribuição pré-dobradas)</td> <td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>Para remover o tecido cerebral</td></tr><tr><td>Tampa protetora impressa em 3D</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Para proteger a lente GRIN</td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co., Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>Para desinfecção e limpeza da superfície da lente GRIN</td></tr><tr><td>AAV2 / 9-CaMKII&alpha; -GCaMP6f vírus</td><td>Brain Case</td><td>BC-0083</td><td>Para injeção viral</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 versão 22.1</td><td>Para desenhar figuras</td></tr><tr><td>Bomba de ar de anestesia</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-30</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Software de controle de câmera</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td><td>Para registrar os dados comportamentais</td></tr><tr><td>Suportes de Cânula/Virola de Cerâmica (suporte de lente GRIN)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>68214</td><td>Para segurar a lente GRIN</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>Para reduzir a dor pós-operatória do mouse&nbsp;</td></tr><tr><td>Cabo Coaxial</td><td>Aberto ephys</td><td>CW8251</td><td>Para conectar o miniscope e a caixa DAQ do miniscope</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Olympus Life Science&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>Para observar as fatias do cérebro</td></tr><tr><td>Cotonete</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co., Ltd</td><td>20202140438</td><td>Para desinfecção</td></tr><tr><td>Placa de cabeça personalizada</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Para segurar o mouse na roda de corrida</td></tr><tr><td>Suporte de placa de cabeça personalizado</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Para segurar a placa de cabeça do mouse</td></tr><tr><td>Base de dentadura matierlals (autopolimerizável)</td> <td>Novo Centry Dental</td><td>430205</td><td>Para anexar o</td></tr><tr><td>miniscope Creme depilatório</td><td>Veet</td><td>ASIN: B001DUUPQ0</td><td>Para remover o cabelo do mouse</td></tr><tr><td>Estereotáxico digital de mesa no instrumento, SGL M</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68803</td><td>Para injeção viral e implantação de lente GRIN</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Para prevenir a inflamação pós-operatória do camundongo</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>Para observar as condições durante as cirurgias</td></tr><tr><td>Recipiente de filtro de gás, grande, pacote de 6</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Lente GRIN</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>Para implantação de lente GRIN</td></tr><tr><td>Lente</td> <td>GRINInFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>Para implantação de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Câmara de indução de mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)</td> <td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>V100</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Câmera industrial</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>Para adquirir os dados comportamentais</td></tr><tr><td>Desinfetante Iodóforo</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co., Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>Para desinfecção</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Tubo de coleta de amostras líquidas (micropipeta de capilares de vidro para Nanoject III)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G / X</td><td>Para injeção viral</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>Para analisar os dados</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>78001</td><td>Para craniotomia</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>Para puxar o tubo de coleta de amostras líquidas</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Para injeção viral</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Software</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>Para registrar os dados de imagem de cálcio</td></tr><tr><td>Miniscope Data Acquisition (DAQ) Caixa (V3.3)</td><td>Open ephys</td><td>V3.3</td><td>Para adquirir os dados de imagem de cálcio</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>Para imagem de cálcio in vivo</td></tr><tr><td>Miniscope V4 placa de base (Variante 2)</td><td>Open ephys</td><td>Variante 2</td><td>Para segurar o</td></tr><tr><td>miniscope nanoject III Injetor de nanolitro programável</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>Para injeção viral</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Cisen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H37022025</td><td>Para manter os olhos úmidos</td></tr><tr><td>Tubo de PCR</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>Para diluir o vírus</td></tr><tr><td>Computador pessoal (ThinkPad)</td> <td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>Para registrar os dados de imagem de cálcio e dados comportamentais</td></tr><tr><td>Roda de corrida</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co., Ltd</td><td>NA-H115</td><td>Para segurar o mouse ao fixar a placa de base</td></tr><tr><td>Chave de fenda (parafusos M1.6)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td> <td>60902</td><td>Para desaparafusar os parafusos M1.6</td></tr><tr><td>Chave de fenda (parafusos de fixação)</td> <td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td> <td>S2</td><td>Para desaparafusar os parafusos de</td></tr><tr><td>fixação Parafuso de fixação</td><td>TBD</td><td>2-56 parafuso de fixação de ponto cônico</td><td>Para prender o miniscópio à sua placa de base</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia para pequenos animais</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R500</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Seringa estéril</td><td>Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD</td><td>20163140236</td><td>Para enxaguar o sangue</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>S14016-13</td><td>Para cortar o cabelo e couro cabeludo</td></tr><tr><td>ThermoStar controlador de temperatura, 69025 almofada incl.</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>69027</td><td>Para manter a temperatura corporal do animal</td></tr><tr><td>Pinça ultrafina</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>F11020-11</td><td>Para remover os detritos ósseos e dura-máter</td></tr><tr><td>Cabo USB 3.0</td><td>Abra ephys</td><td>N / A</td><td>Para conectar a caixa de aquisição de dados do miniscópio e a</td></tr><tr><td>luz UV</td> do computador <td>Jinshida</td><td>66105854002</td><td>Para fixar a lente GRIN no crânio</td></tr><tr><td>Resina UV (adesivo fotopolimerizável)</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>Para fixar a lente GRIN no crânio</td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>Para remover o sangue, a solução salina e o tecido cerebral</td></tr></tbody></table>

imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Abordagens em tempo real são normalmente necessárias em estudos de aprendizagem e memória, e a imagem de cálcio in vivo oferece a possibilidade de investigar a atividade neuronal em animais acordados durante tarefas comportamentais. Como o hipocampo está intimamente associado à memória episódica e espacial, tornou-se uma região essencial do cérebro na pesquisa desse campo. Em pesquisas recentes, células de engrama e células de lugar foram estudadas registrando as atividades neurais na região CA1 do hipocampo usando o microscópio em miniatura em camundongos durante a execução de tarefas comportamentais, incluindo campo aberto e trilha linear. Embora o giro dentado seja outra região importante no hipocampo, ele raramente foi estudado com imagens in vivo devido à sua maior profundidade e dificuldade de imagem. Neste protocolo, apresentamos em detalhes um processo de imagem de cálcio, incluindo como injetar o vírus, implantar uma lente GRIN (Gradient-index) e anexar uma placa de base para obter imagens do giro dentado do hipocampo. Descrevemos ainda como pré-processar os dados de imagem de cálcio usando o MATLAB. Além disso, estudos de outras regiões cerebrais profundas que requerem imagens podem se beneficiar desse método.

A Figura 1 mostra o esquema do procedimento experimental, incluindo injeção de vírus, implante de lente GRIN, fixação da placa de base, imagem de cálcio in vivo por meio de um miniscópio e processamento de dados. Geralmente, todo o procedimento leva 1 mês. A Figura 2 mostra exemplos de procedimentos de injeção de vírus, incluindo o posicionamento do orifício perfurado no crânio e a condição do tecido cerebral antes do implante da lente GRIN.
A Figura 3 mostra o processo de remoção do tecido cerebral, que é crucial para o sucesso desta cirurgia. À medida que mais tecido é aspirado, diferentes camadas de tecido tornam-se visíveis. Esta etapa de sucção pode ser interrompida assim que uma camada cinza reflexiva for observada.
A Figura 4 mostra o procedimento de implantação do GRIN, incluindo a inserção da lente GRIN, a colagem da placa de cabeça no crânio e a cobertura da lente GRIN com uma tampa personalizada. A qualidade da imagem de cálcio in vivo depende do sucesso da injeção do vírus e do implante da lente GRIN.
A Figura 5 mostra quatro tipos de resultados de imagens de cálcio in vivo. A Figura 5A é o resultado malsucedido; Não foram observadas células ativas no campo de visão de imagem. A Figura 5B-D são resultados bem-sucedidos. A Figura 5B tem menos de 10 células ativas, mas não há vasos sanguíneos óbvios. A Figura 5C tem mais de 50 células ativas e vasos sanguíneos visíveis. Na Figura 5D, existem centenas de células ativas no campo de visão da imagem; Ao mesmo tempo, observamos vasos sanguíneos claros. A imagem de cálcio in vivo de alta qualidade normalmente tem centenas de células ativadas. Acredita-se que menos de uma dúzia de células ativadas sejam abaixo do ideal para resultados de imagem. Normalmente, o número de células se correlaciona com o diâmetro da lente GRIN, bem como com a parte da região do cérebro. Um diâmetro de lente GRIN maior e uma região cerebral mais próxima do lado dorsal aumentarão a probabilidade de observar células mais ativas. Também é vital observar que quanto maior o diâmetro da lente GRIN, mais danos ela causa ao cérebro do camundongo; portanto, selecionar o tamanho apropriado é crucial. O implante de uma lente GRIN de 1 mm de diâmetro não afeta a capacidade do animal de adquirir o comportamento de trilha linear (Figura Suplementar S1).
Os dados comportamentais e os dados de imagem de cálcio geralmente são processados separadamente. Os dados comportamentais do mouse podem ser rotulados manualmente ou processados usando software de análise de código aberto. Os dados de imagem de cálcio são processados usando Correção de Movimento Não Rígida (NoRMCorre) e EXTRACT no MATLAB. A Figura 6 mostra as células individuais extraídas sobrepostas ao campo de visão e mostra cinco traços representativos de cálcio de um registro de imagem de cálcio in vivo bem-sucedido. Consulte o Vídeo Suplementar S1 para obter um vídeo representativo dos dados brutos.
Verificar se o implante da lente GRIN e a injeção viral ocorrem na região cerebral pretendida é o último passo e também é muito importante para a interpretação dos dados. A Figura 7 é uma fatia de cérebro de camundongo mostrando a posição da expressão de GCaMP6f (a região de fluorescência verde) e o trajeto da lente GRIN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama dos procedimentos de injeção do vírus e implante da lente GRIN. (A) Injete o vírus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f no giro denteado. (B) Implante a lente GRIN acima do giro denteado. (C) Verifique a qualidade da imagem após a cirurgia. (D) Fixe a placa de base do miniscópio após a verificação. (E) O cronograma e o processo de todo o protocolo. Abreviatura: GRIN = Índice de gradiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> Figura 2: Visão cirúrgica representativa durante a injeção do vírus. (A) Coloque o mouse no aparelho estereotáxico. (B) Marque a área de implantação da lente GRIN (a região preta). (C) Craniotomia na área-alvo. (D) Injete 240 nL de vírus no giro denteado. (E) Remova a micropipeta após a injeção. (F) Remova o córtex e parte do tecido cerebral CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> Figura 3: Visão cirúrgica representativa durante a aspiração do tecido cerebral. (A) A região delimitada pelo marcador preto é polida com uma microbroca, deixando para trás (B) tecido cortical parcialmente exposto. A parte esquerda mostra um córtex exposto e a parte direita é coberta por dura-máter e tecido craniano. (C) Imagem representativa durante a aspiração do tecido cerebral cortical. O tecido permanece rosa pálido. (D) A substância branca é visível dentro do campo de visão, conforme indicado pela seta branca. (E) A sucção adicional revelou uma superfície reflexiva cinza-avermelhada escura sob a substância branca. Acredita-se que a região (seta preta) seja a superfície CA1 e a sucção não deve ser mais profunda. (F) Não há mais sangramento visível na região após enxaguar com solução salina várias vezes. Em todos os painéis, os asteriscos indicam instrumentos cirúrgicos: agulha romba 30 G para soro fisiológico e agulha romba 25 G para aspiração de tecido encefálico. Barras de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> Figura 4: Um exemplo de procedimento para implantação de lente GRIN e fixação da placa de base. (A) Implante a lente GRIN no tecido cerebral usando um suporte de lente GRIN. (B) Cole a lente GRIN no local adequado com resina UV; a parte reflexiva representa a resina UV. (C) Prenda a placa de cabeça no crânio do rato usando resina UV. (D) Cubra a lente GRIN com uma tampa protetora impressa em 3D. (E) Verifique a qualidade da cirurgia. O miniscópio foi fixado por um suporte. (F) Aplique os materiais de base da prótese ao redor da placa de base. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> Figura 5: Resultados de imagem bem-sucedidos e malsucedidos. (A) Resultado de imagem de cálcio in vivo malsucedido. Não há células ativas em A e várias regiões têm manchas de sangue escuras, conforme indicado pelas setas pretas. (BD) Resultados bem-sucedidos de imagem de cálcio in vivo . (B) Menos de 10 células ativas podem ser observadas, mas nenhum vaso sanguíneo significativo no campo de imagem. (C) Mais de 50 células ativas e vasos sanguíneos significativos podem ser observados. (D) Centenas de células ativas e vasos sanguíneos mais significativos podem ser observados. Os círculos tracejados representam o campo de visão da imagem. As setas verdes representam as células que expressam GCaMP6f. As setas vermelhas representam os vasos sanguíneos. Barras de escala = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> Figura 6: Dados representativos de imagens de cálcio in vivo de um camundongo correndo na pista linear. (A) O campo de imagem de view registro pelo miniscópio, número total de células = 227. (B) Traços representativos de cálcio. As localizações da célula são mostradas na mesma cor em A. (C) Tarefa comportamental: Trilha linear com recompensas de água em ambas as extremidades. (D) Resultado representativo da análise comportamental da atividade do camundongo; tempo total = 100 s. As linhas verticais azuis indicam os pontos de tempo do comportamento de lamber. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> Figura 7: Seções de tecido cerebral de camundongos após a cirurgia. (A, B) Dois exemplos de tecidos cerebrais de camundongos. As áreas retangulares tracejadas indicam o caminho de implantação da lente GRIN. As linhas curvas representam o giro dentado no hipocampo. Barras de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Problema</td>
			<td>Possível causa</td>
			<td>Solução</td>
		</tr><tr><td>O campo de imagem aparece escuro ou preto.</td>
			<td>Há uma quantidade significativa de sangue residual na parte inferior da lente GRIN.</td>
			<td>Antes de implantar a lente GRIN, a solução salina é usada para lavar continuamente a superfície do local da cirurgia até que não haja mais sangramento observável.</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Existem vasos sanguíneos claramente visíveis presentes no campo de imagem, mas nenhuma atividade neuronal discernível.</td>
			<td>1. A expressão do vírus foi abaixo do ideal ou pobre.</td>
			<td>1. Seria aconselhável verificar o seguinte:</td>
		</tr><tr><td>2. A localização da expressão do vírus observada não corresponde à posição onde a lente GRIN foi implantada (geralmente, a posição de implantação da lente GRIN é muito rasa em comparação com o local desejado).</td>
			<td>um. Certifique-se de que as condições de armazenamento de vírus sejam apropriadas.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b. Verifique se o local da injeção de vírus está correto.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>c. Confirme se a concentração do vírus é adequada.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2. Durante o próximo procedimento cirúrgico, a profundidade do implante da lente GRIN pode ser aumentada adequadamente, e a profundidade exata deve ser cuidadosamente registrada cada vez que o experimento for realizado.</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">O campo de imagem mostra alguns padrões regionais de atividade neuronal, mas não há atividade claramente visível no nível da célula individual.</td>
			<td>1. O volume de vírus injetado era excessivamente alto.</td>
			<td>1. Dilua o vírus ou reduza o volume da injeção do vírus.</td>
		</tr><tr><td>2. A localização da expressão do vírus não se alinha com a posição da lente GRIN (normalmente, a lente GRIN é implantada em uma profundidade menor do que a posição ideal para a expressão do vírus).</td>
			<td>2. Durante o próximo procedimento cirúrgico, a profundidade do implante da lente GRIN pode ser aumentada adequadamente, e a profundidade exata deve ser cuidadosamente registrada cada vez que o experimento for realizado.</td>
		</tr><tr><td>Existem certas células dentro do campo de imagem que mantêm um sinal de fluorescência consistentemente brilhante em todos os momentos, e não há alteração na intensidade dessa fluorescência.</td>
			<td>O vírus é superexpresso dentro de uma única célula.</td>
			<td>Dilua o vírus ou reduza o volume da injeção do vírus.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Gráfico de solução de problemas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Figura Suplementar S1: Aquisição normal da tarefa de memória espacial por camundongos submetidos a cirurgia. O gráfico mostra a quantificação do número de tentativas concluídas na sessão de 20 minutos a cada dia. Os dados são representados como média ± SEM. N = 3 camundongos no grupo com cirurgia e 4 no grupo sem cirurgia. A ANOVA de duas vias foi usada para comparação estatística. Abreviação: ns = não significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo Suplementar S1: Dados brutos representativos de imagens de cálcio em DG. Este vídeo demonstra a atividade do cálcio durante um período de 5 minutos. O vídeo é reproduzido em 10x a velocidade original. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 1: O design da placa de cabeça. Este arquivo descreve o desenho 2D do design da placa de direção. A produção da placa de cabeça envolve o corte de aço inoxidável de acordo com o desenho. Os dois pequenos orifícios na barra lateral devem ser rosqueados com roscas M1.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2: O design da tampa protetora impressa em 3D. Este arquivo fornece o gcode das fatias da tampa protetora que podem ser usadas com uma impressora 3D. Neste protocolo, utilizamos plástico ácido polilático como matéria-prima para a impressão. Os pequenos orifícios na lateral correspondem às posições dos orifícios roscados na placa de cabeça para instalação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 3: O design do suporte do miniscópio. Este arquivo fornece o gcode das fatias do suporte do miniscope que podem ser usadas com uma impressora 3D. O orifício cilíndrico é usado para instalação em um suporte estereotáxico com um parafuso M4. Os orifícios laterais destinam-se a adicionar parafusos para apertar, mas o suporte pode ser usado sem esse recurso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 4: Código de controle do Arduino e scripts para pré-processamento de vídeo de imagem de cálcio bruto. Este arquivo contém os scripts para controlar o Arduino e o código para pré-processamento de dados de imagem de cálcio. O código do Arduino controla a configuração do comportamento em que o mouse aprende a lamber para obter recompensas de água em extremidades alternadas de uma trilha linear. Ao aprender a tarefa, os ratos correm repetidamente para frente e para trás na pista. O código de pré-processamento de imagens de cálcio executa conversão de formato de arquivo, correção de movimento, redução espacial e extração de sinal de célula a partir dos dados coletados pelo miniscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

O giro dentado do hipocampo desempenha funções essenciais e distintas na aprendizagem e na memória. Este protocolo descreve um conjunto de procedimentos robustos e eficientes para imagens de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado em camundongos em movimento livre.

Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios da raiz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). O vídeo demonstra uma técnica de imagem de cálcio in vivo para monitorar a atividade neuronal nos gânglios da raiz dorsal (DRG) de um camundongo transgênico. Os neurônios DRG expressam um indicador de cálcio que aumenta a intensidade da fluorescência ao se ligar ao cálcio. Estímulos mecânicos ou térmicos aplicados a...

Imagem de cálcio in vivo de conjuntos neuronais nos gânglios intactos da raiz dorsal de um camundongo

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/53330/ imagem de fluorescência e bioluminescência de ca2 subcelular em neurônios do hipocampo envelhecidos '&gt;Calvo-Rodríguez, et al. Imagem de fluorescência e bioluminescência de Ca style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'&gt;2+ em neurônios do...

Imagem de cálcio in vitro em culturas de hipocampo de rato de curto e longo prazo

Fonte: Lee, H. et. al., Imagem de cálcio in vivo bem-sucedida com um microscópio miniaturizado montado na cabeça na amígdala de um camundongo que se comporta livremente. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra imagens de cálcio in vivo em um camundongo usando um índice de refração gradiente, ou lente GRIN, e um microscópio miniaturizado. A configuração combina a fixação da cabeça dentro de um sistema de gaiola móvel sem atrito, estimulando os neurônios e desencadeando o influxo de íons de...

Imagem microendoscópica de cálcio em tempo real em um camundongo que se move livremente

Aqui apresentamos como expor o gânglio geniculado de um rato de laboratório vivo, anestesiado e como usar imagens de cálcio para medir as respostas desses conjuntos desses neurônios a estímulos de sabor, permitindo múltiplos ensaios com diferentes estimulantes. Isso permite comparações profundas das quais os neurônios respondem a quais tastantes.

In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Apresentamos um protocolo para expor o tronco cerebral do rato adulto do lado ventral. Usando uma lente de índice gradiente-refrativo com um microscópio em miniatura, a imagem de cálcio pode ser usada para examinar a atividade de somata neural inferior de oliva in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Miniscópio em imagem de cálcio vivo é uma técnica poderosa para estudar dinâmica neuronal e microcircuitos em camundongos que se comportam livremente. Este protocolo descreve a realização de cirurgias cerebrais para obter uma boa imagem in vivo de cálcio usando um miniscópio.

Injeção viral esteretaxica e implantação de lente de índice de gradiente para imagem de cálcio no cérebro profundo em vivo

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

O presente protocolo descreve imagens de cálcio in vivo para medir as respostas de conjuntos de neurônios lombares-6 DRG a estímulos somáticos e viscerais. Comparações completas podem ser feitas entre neurônios que respondem a diferentes estímulos. Este protocolo é valioso para investigar mecanismos de dor visceral e estimulação somática, como a acupuntura.

in vivo Imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Aprenda imagem de cálcio in vivo em células granulares do giro dentado do hipocampo em camundongos livremente móveis. Este protocolo combina injeção viral e implante de lente GRIN em procedimento único para estudar neuroatividades cognitivas.

Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos

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