Name: Isolamento de capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial para medição de rigidez usando microscopia de força atômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprenda a isolar capilares retinianos e matriz subendotelial de camundongos para medição de rigidez com microscopia de força atômica. Este método auxilia pesquisadores a investigar alterações mecânicas vasculares na retinopatia diabética.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (para K.G.), Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (para K.G.), The Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant da W.M. Keck Foundation (para Doheny Eye Institute) e Ursula Mandel Fellowship e UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (para I.S.T.). Este trabalho também foi apoiado por uma bolsa irrestrita da Research to Prevent Blindness, Inc. para o Departamento de Oftalmologia da UCLA. O conteúdo deste artigo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Medição da rigidez em capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial

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<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A AFM tem sido amplamente utilizada para medir alterações associadas à doença na rigidez de vasos maiores, como a aorta e artérias16. Esses achados ajudaram a estabelecer o papel da mecanobiologia endotelial em complicações cardiovasculares, como a aterosclerose17. Com base nessas descobertas, começamos a investigar o papel anteriormente não reconhecido da mecanobiologia endotelial no desenvolvimento de lesões microvasculares da retina no início da RD. O sucesso nessa busca, no entanto, depende da medição precisa das alterações induzidas pelo diabetes na rigidez capilar da retina. Estudos recentes revelaram que, semelhante aos grandes vasos, a rigidez dos capilares retinianos e da matriz subendotelial secretada por CE da retina também pode ser medida de forma direta, precisa e confiável usando AFM 4,5,6.
Essa abordagem envolve o isolamento dos capilares retinianos de camundongos de olhos levemente fixos usando digestão de tripsina. Com base na experiência, essa etapa de fixação leve é necessária, pois os capilares isolados de olhos não fixados (usando o método hipotônico) são frágeis e se fragmentam, tornando-os inadequados para a medição da rigidez do AFM4. Por outro lado, uma fixação mais forte e a consequente necessidade de digestão extensa de tripsina, que foi relatada em outros protocolos de digestão de tripsinaretiniana 18, também podem comprometer a integridade estrutural capilar, conforme julgado pela ruptura de junções apertadas. Assim, a fixação capilar suave e a digestão suave da tripsina empregadas aqui ajudam a reduzir os artefatos de rigidez decorrentes da reticulação excessiva induzida pela formalina e garantem a integridade estrutural dos capilares para uma medição confiável da rigidez do AFM.
Como uma abordagem alternativa, um estudo recente relatou a medição da rigidez AFM dos capilares retinianos de montagens planas de retina levemente fixadas19. Ao realizar recortes de força AFM nos capilares retinianos dentro da retina intacta, essa abordagem permite a medição de rigidez in situ . No entanto, essas medidas de rigidez capilar provavelmente incluem a rigidez da membrana limitante interna. Além disso, essa abordagem é restrita à medição apenas de capilares superficiais que são acessíveis em uma montagem plana da retina, deixando de fora o plexo capilar mais profundo que é especificamente afetado no início do DR20. Esses problemas podem ser resolvidos usando essa abordagem, que extrai os vasos de forma limpa (desprovidos de tecido retiniano residual) de todas as camadas da retina. Atualmente, estamos otimizando este protocolo para isolar vasos coroidais de modelos animais de DMRI precoce. Dito isto, percebemos que a fixação leve de formalina empregada no protocolo pode causar um artefato de enrijecimento associado à reticulação nas medições de AFM. Portanto, seria prudente interpretar os valores de rigidez vascular obtidos usando essa abordagem mais em termos de mudanças relativas na rigidez (entre diferentes grupos experimentais) do que de rigidez absoluta.
Em contraste com os capilares retinianos que requerem fixação leve, a matriz subendotelial obtida de culturas de EC retinianas pode ser avaliada sem qualquer modificação. Isso se deve em grande parte à robustez da matriz depositada, que resulta de uma combinação de vários fatores, incluindo a adição de ácido ascórbico no meio de cultura (que aumenta a síntese de colágeno15), modificação química de lamínulas de vidro que evita o descolamento da matriz durante a descelularização e duração prolongada da cultura (10-15 dias). É importante ressaltar que mostramos que o aumento induzido pela hiperglicemia na rigidez da matriz subendotelial in vitro é consistente com o aumento induzido pelo diabetes na rigidez capilar da retina observado in vivo4. Isso não é surpreendente, pois espera-se que um aumento na rigidez da matriz aumente a rigidez dos CEs retinianos sobrejacentes (devido à reciprocidade mecânica) que, juntos, aumentam a rigidez capilar geral. De fato, mostramos recentemente que os CEs da retina tornam-se mais rígidos quando cultivados em condições diabéticas4, provavelmente por meio de um aumento na tensão citoesquelética de actina dependente de Rho / ROCK21. Esses achados também implicam que o enrijecimento da CE da coroide observado no modelo de macaco rhesus da DMRI inicial reflete o aumento da rigidez da matriz subendotelial da coroide e dos vasos intactos12, uma ideia que está sendo testada em estudos em andamento. No geral, o fato de que as alterações de rigidez na matriz subendotelial retiniana não fixada e ECs refletem a tendência observada em vasos retinianos intactos levemente fixados atesta a validade da abordagem de fixação leve.
A medição direta da rigidez dos capilares retinianos a partir de modelos animais de RD não apenas ajuda a estabelecer a mecanobiologia endotelial como um novo alvo terapêutico para o tratamento da RD, mas também fornece uma forte justificativa para desenvolver novas técnicas de imagem sensíveis para avaliação não invasiva da rigidez capilar da retina em pacientes com RD no futuro. Essas técnicas não invasivas podem detectar mudanças sutis no fluxo sanguíneo que devem surgir do enrijecimento capilar, semelhantes às mudanças na velocidade da onda de pulso arterial que são comumente detectadas em doenças cardiovasculares induzidas por diabetes. As medições de rigidez AFM de capilares retinianos isolados de olhos humanos post-mortem de doadores diabéticos fornecerão uma importante prova de conceito a esse respeito. Dado que a rigidez capilar da retina aumenta logo no início do modelo de camundongo (estreptozotocina) do diabetes tipo1 4, o uso bem-sucedido do AFM na validação das modalidades de imagem de medição de rigidez pode levar à identificação da rigidez capilar da retina como um biomarcador clínico para a patogênese precoce da RD.

Os capilares retinianos são essenciais para manter a homeostase retiniana e a função visual. De fato, sua degeneração no diabetes precoce está fortemente implicada no desenvolvimento de complicações que ameaçam a visão da retinopatia diabética (RD), uma condição microvascular que afeta quase 40% de todos os indivíduos com diabetes1. A inflamação vascular contribui significativamente para a degeneração capilar da retina na RD. Estudos anteriores demonstraram um papel importante para pistas moleculares e bioquímicas aberrantes na inflamação vascular da retina induzida por diabetes 2,3. No entanto, trabalhos recentes introduziram um novo paradigma para a patogênese da RD que identifica o enrijecimento capilar da retina como um determinante crucial, mas anteriormente não reconhecido, da inflamação e degeneração vascular da retina 4,5,6.
Especificamente, o aumento da rigidez capilar retiniana induzido pelo diabetes é causado pela regulação positiva da enzima de reticulação do colágeno lisil oxidase (LOX) nas células endoteliais da retina (CEs), que enrijece a matriz subendotelial (membrana basal)4,5,6. O enrijecimento da matriz, por sua vez, enrijece os CEs retinianos sobrejacentes (devido à reciprocidade mecânica), levando ao aumento geral da rigidez capilar da retina4. Crucialmente, esse enrijecimento capilar da retina induzido por diabetes por si só pode promover a ativação da CE retiniana e a morte da CE mediada por inflamação. Essa regulação mecânica dos defeitos retinianos do EC pode ser atribuída à mecanotransdução endotelial alterada, o processo pelo qual pistas mecânicas são convertidas em sinais bioquímicos para produzir uma resposta biológica 7,8,9. É importante ressaltar que pistas mecânicas alteradas da CE e estrutura da matriz subendotelial também foram implicadas na degeneração vascular da coroide associada à degeneração macular relacionada à idade precoce (DMRI)10,11,12, o que atesta as implicações mais amplas da mecanobiologia vascular em doenças degenerativas da retina.
Notavelmente, o enrijecimento capilar da retina ocorre no início do diabetes, o que coincide com o início da inflamação da retina. Assim, o aumento da rigidez capilar retiniana pode servir tanto como alvo terapêutico quanto como marcador diagnóstico precoce para RD. Para isso, é importante obter medições confiáveis e diretas da rigidez dos capilares retinianos e da matriz subendotelial. Isso pode ser alcançado usando um microscópio de força atômica (AFM), que oferece uma técnica única, sensível, precisa e confiável para medir diretamente a rigidez das células, matriz extracelular e tecidos13. Um AFM aplica a força mínima (nanoNewton-nível) do recorte na amostra cuja a rigidez determina a extensão a que o modilhão de recuo do AFM se dobra - mais dura a amostra, mais o modilhão se curva, e vice-versa. Usamos AFM extensivamente para medir a rigidez de células endoteliais cultivadas, matrizes subendoteliais e capilares retinianos de camundongos isolados 4,5,6,11,12. Essas medições de rigidez do AFM ajudaram a identificar a mecanobiologia endotelial como um determinante chave da patogênese da DR e da DMRI. Para ajudar a ampliar o escopo da mecanobiologia na pesquisa da visão, aqui fornecemos um guia passo a passo sobre o uso de AFM para medições de rigidez de capilares retinianos de camundongos isolados e matriz subendotelial.

<table><tbody><tr><td><forte>Isolamento Capilar da Retina</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtro de seringa de PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>Durapore de baixa ligação a proteínas</td></tr><tr><td>10X Dulbecco's Phosphate Buffered Solução salina sem cálcio % magnésio</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td>Concentração final 1X, pH 7,4</td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Falcon Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>livre de Rnase-Dnase, não pirogênico</td></tr><tr><td>20 mL Seringa Luer-Lok TIP</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 polegadas Descartável Vidro de Borosilicato/Pipeta Pasteur Não Estéril</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Placa de Cultura de Tecidos</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 Pap - Caneta de 13 mL Laboratório de</td><td>Dispositivos Científicos</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de lâmina</td><td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina Cirúrgica de Aço Carbono #10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr> Dental <tr><td>Wax</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina, tamponada neutra, 10%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>Concentração final 5% (v/v)</td></tr><tr><td>Kimwipes - tecido de limpador</td><td>Micro espátula Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Orbital</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 Aço Inoxidável 115mm&nbsp; Pinça</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de fase</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic + Classe II, Gabinete de Biossegurança Tipo A2</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Safe-Lock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope Estereomicroscópio</td> Trinocular Zoom Série <td>AmScope</td><td>SM-3 3.5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscopia Superfrost Plus - Aba branca - Pré-limpa - 25x75x1,0 mm</td><td>FisherBrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer, solução 0,1M, pH 7,4 - Grau de Biotecnologia</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>pH 8 para solução de tripsina</td></tr><tr><td>Tripsina 1:250 em pó Grau de cultura de tecidos</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10% (p/v) solução de tripsina</td></tr> Água <tr><td>Grau de Biologia Molecular</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td><forte>Matriz subendotelial</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X</td><td>PBS Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS com cálcio e magnésio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV anticorpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro (12mm)</td><td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliais da retina humana (HREC)</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131 médio</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliais da retina de camundongo (mREC)</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>AFM Measurement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &micro; Ponta de prova Bruker</td><td></td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>Uma ponta de prova hemisférica de 19 mícrons altos com raio da extremidade de 1 mícron, ponta de prova constante da mola 0.25N/m</td></tr><tr><td>70 nanômetro LC</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>Uma ponta de prova hemisférica alta de 19 mícrons com raio da extremidade 70nm, &nbsp; Constante de mola 0.1N/m</td></tr><tr><td>&nbsp; câmera</td><td>da família XCAM</td><td>Toupcam</td><td>1080P HDMI</td></tr><tr><td>Desktop para executar a câmera</td><td>Asus</td><td>desktop Asus CPU</td><td>Intel i5-6600 , 8GB RAM</td></tr><tr><td>Suporte de prato para lamínula</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mm prato de fundo de vidro com &nbsp; Micro-poço de 14 mm</td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td><td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>Microscópio de força atômica Bioscience montado em um microscópio óptico para medição sensível das propriedades mecanoestruturais (rigidez e topografia) de amostras biológicas moles</td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de fase</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>Microscópio invertido com objetiva de 10X</td></tr></tbody></table>

isolamento de capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial para medição de rigidez usando microscopia de força atômica

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

A degeneração capilar da retina é uma marca clínica dos estágios iniciais da retinopatia diabética (RD). Nossos estudos recentes revelaram que o enrijecimento capilar da retina induzido por diabetes desempenha um papel causal crucial e anteriormente não reconhecido na degeneração dos capilares retinianos mediada por inflamação. O aumento da rigidez capilar da retina resulta da superexpressão da lisil oxidase, uma enzima que reticula e enrijece a matriz subendotelial. Como se espera que o combate à RD no estágio inicial previna ou retarde a progressão da RD e a perda de visão associada, a matriz subendotelial e a rigidez capilar representam alvos terapêuticos relevantes e novos para o manejo precoce da RD. Além disso, a medição direta da rigidez capilar da retina pode servir como uma etapa crucial de validação pré-clínica para o desenvolvimento de novas técnicas de imagem para avaliação não invasiva da rigidez capilar da retina em animais e seres humanos. Com essa visão em mente, fornecemos aqui um protocolo detalhado para o isolamento e medição da rigidez dos capilares retinianos de camundongos e da matriz subendotelial usando microscopia de força atômica.

Capilares da retina de camundongos A medição da rigidez do AFM de capilares retinianos isolados envolve etapas de manuseio de amostras que podem danificar sua integridade mecanoestrutural. Para evitar isso e, assim, garantir a viabilidade, confiabilidade e reprodutibilidade das medições de AFM, os olhos enucleados são fixados em formalina a 5% durante a noite a 4 °C antes do isolamento do vaso. Este protocolo de fixação suave com concentração reduzida de formalina, baixa temperatura de fixação, tempo de fixação limitado e falta de punção da córnea foi desenvolvido para minimizar qualquer potencial artefato de reticulação/endurecimento causado pela fixação química. Como mostrado na Figura 2B, C, essa fixação relativamente leve garante que a vasculatura retiniana isolada seja estruturalmente robusta e suficientemente durável para a medição do AFM. Em contraste, os vasos retinianos isolados de olhos não fixados (usando o método hipotônico)4 ou olhos brevemente fixos (por 8 h) tornam-se fragmentados ou colapsam, tornando-os inadequados para medição de AFM (Figura 2B).
Matriz subendotelial retiniana A rigidez vascular reflete a rigidez combinada das células vasculares e da membrana basal (matriz subendotelial)4. Uma vez que as células se adaptam à rigidez da matriz passando por uma mudança semelhante em sua própria rigidez, um processo denominado reciprocidade mecânica9, rigidez da matriz subendotelial, torna-se um determinante importante da rigidez vascular geral. Para a medição da rigidez da matriz, é importante obter uma matriz subendotelial homogeneamente densa. Para CEs retinianos humanos cultivados em meio de cultura suplementado com ácido ascórbico, isso geralmente leva de 10 a 15 dias (Figura 3A)4,5,6. Essa diferença no período de cultura pode surgir de diferenças de lote para lote em CEs retinianos primários disponíveis comercialmente. Além disso, geralmente descobrimos que os CEs retinianos disponíveis comercialmente de camundongos C57BL / 6 depositam uma matriz mais densa quando comparados com a cultura primária de CE retiniano humano, indicando diferenças específicas da espécie. Conforme mostrado na Figura 3A, as imagens de contraste de fase fornecem apenas uma visão bruta da matriz em uma escala macro. No entanto, a estrutura fibrilar mais fina em nano a microescala torna-se aparente em imagens de fluorescência confocal de alta resolução da matriz imunomarcada com anticorpos contra as proteínas estruturais da matriz colágeno IV e fibronectina (Figura 3B). Deve-se notar que essas proteínas da matriz também fornecem pistas instrutivas para as células endoteliais, ligando-se a receptores específicos de integrina9.
Medição da rigidez do AFM A seleção da rigidez apropriada do cantilever (constante da mola, k) e da dimensão da sonda é essencial para medições confiáveis e sensíveis. Esses parâmetros devem ser escolhidos para corresponder à rigidez e às dimensões da amostra biológica. Depois que o modilhão selecionado foi montado no AFM, o feixe de laser infravermelho deve ser focado na ponta do cantilever, e o ponto de laser refletido deve ser centrado no fotodetector. Este alinhamento a laser garante a detecção precisa e sensível da deflexão do cantilever e, consequentemente, a medição da rigidez. Uma medida da rigidez do AFM começa com o z-piezo que move o modilhão verticalmente para baixo na direção da amostra. Não há deflexão em balanço neste momento, o que produz uma linha de base plana da curva de aproximação (Figura 4A). À medida que a sonda cantilever entra em contato e recua a amostra, a cantilever se dobra, causando deflexão do laser no fotodetector, que é representada pela deflexão vertical da curva de aproximação. Depois de aplicar uma força de indentação predefinida (força de ponto de ajuste) na amostra, o cantilever se retrai para a posição inicial (altura alvo Z) longe da amostra. A curva de retração defletida é então ajustada ao modelo Hertz/Sneddon para calcular o módulo de Young (rigidez) da amostra.
A partir da medição representativa de recuo de força mostrada na Figura 4, fica claro que as curvas de aproximação e retração obtidas de um capilar retiniano isolado de um camundongo diabético (Figura 4B) são substancialmente mais íngremes do que as obtidas de um camundongo não diabético (Figura 4A). A inclinação mais acentuada das curvas de indentação de força indica maior deflexão do cantilever causada pela maior resistência da amostra à indentação de força, o que reflete maior rigidez da amostra13. De fato, a análise subsequente de dados de múltiplas curvas de recuo de força revelou que os capilares da retina de camundongos se tornam significativamente mais rígidos no diabetes4. Deve-se notar também que o contato entre a sonda cantilever e as amostras biológicas geralmente causa adesão superficial inespecífica, o que leva à deflexão negativa do cantilever durante a retração, como visto na extensão da curva de retração além da linha de base (Figura 4B). Além disso, amostras biológicas como células, matriz e vasos sanguíneos são viscoelásticas por natureza e, portanto, podem sofrer alguma deformação permanente e/ou alteração na rigidez aparente após o recuo da força. Nesse caso, isso se refletirá no desalinhamento das curvas de aproximação e retração (histerese). De fato, a comparação da Figura 4A e da Figura 4B confirma a tendência esperada em que o recuo forçado de capilares mais moles em camundongos não diabéticos produz maior histerese do que a observada em suas contrapartes mais rígidas. Como relatado anteriormente 5,6, a rigidez (módulo de Young) de matrizes subendoteliais obtidas de culturas de CE retinianas também é calculada da maneira acima mencionada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg"> Figura 1: Ilustração esquemática do corte da incisão feito em um olho de camundongo para isolamento da retina. Usando uma pinça para segurar o nervo óptico, um bisturi é usado para fazer uma incisão completa posterior ao limbo para separar a retina do camundongo do cristalino e da câmara anterior. A linha tracejada roxa mostra a localização da incisão vertical. Este esquema foi desenhado usando um software de imagem e ilustração científica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg"> Figura 2: Otimização do protocolo para isolamento de vasos retinianos de camundongos intactos para medição de AFM. (A) A imagem do estereoscópio mostra uma retina intacta isolada de um olho de camundongo levemente fixado antes das etapas de isolamento capilar. Barra de escala: 2 mm. (B) Imagens representativas de contraste de fase com ampliação de 4x mostram vasos retinianos de camundongos obtidos usando os diferentes métodos de isolamento. Comparando a integridade estrutural e a durabilidade dos vasos isolados, descobriu-se que a digestão de tripsina de retinas de olhos enucleados fixados em formol a 5% por 24 h a 4 ° C (caixa vermelha) produz a vasculatura retiniana mais adequada para a medição da rigidez do AFM. Os vasos retinianos isolados usando esse método exibiram uma rede vascular clara que se espalhou uniformemente ao longo da superfície do vidro. Barra de escala: 500 μm. (C) A visão de alta ampliação (20x) de uma rede capilar retiniana intacta, semelhante à mostrada em (B), confirma a alta integridade estrutural dos capilares obtidos de olhos levemente fixos. Barra de escala: 100 μm. Este número foi modificado de4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg"> Figura 3: Matrizes descelularizadas obtidas de culturas primárias de REC humanas e de camundongos. (A) Imagens representativas de contraste de fase com ampliação de 20x mostrando agregados de matriz subendotelial em lamínulas de vidro após descelularização de culturas de 10 dias (10 d) ou 15 dias (15 d) de RECs humanas ou de camundongos. Barra de escala: 100 μm. (B) Imagens representativas de fluorescência confocal de alta ampliação (100x) de matrizes descelularizadas obtidas de culturas de REC humanas de 15 d e marcadas com anticorpos anticolágeno IV e antifibronectina revelam um colágeno IV nanofibrilar denso e matriz de fibronectina. Barra de escala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg"> Figura 4: Curvas de distância de força da medição da rigidez do AFM dos capilares retinianos do rato. Os gráficos de linha indicam uma curva representativa de aproximação (cor clara) e retração (cor escura) a partir de uma única medição de indentação de força em um local de um capilar retiniano de camundongo isolado de um camundongo (A) não diabético ou (B) diabético. As curvas de força obtidas usando uma sonda cantilever hemisférica SAA-SPH de 1 μm de raio traçam a relação entre a distância cantilever-sample (controlada pelo z-piezo) e a força vertical aplicada que causa a deflexão do cantilever. (A) A seta amarela indica a aproximação do cantilever acionado por z-piezo-driven em direção à amostra, a seta branca indica o ponto de contato onde a sonda cantilever faz contato com a amostra e a seta verde indica a deflexão do cantilever até um ponto de ajuste (pico) força de indentação (*). (B) As curvas de aproximação e retração obtidas de um capilar retiniano isolado de camundongos diabéticos exibem uma inclinação marcadamente mais íngreme do que as de suas contrapartes não diabéticas (mostradas em A), o que indica maior rigidez capilar em camundongos diabéticos. A ponta da seta indica uma queda na curva de retração abaixo da linha de base, que reflete a deflexão negativa da sonda cantilever causada pela adesão entre a sonda e a amostra durante o recuo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Recentemente, identificamos o enrijecimento capilar da retina como um novo paradigma para a disfunção retiniana associada ao diabetes. Este protocolo elabora as etapas para o isolamento dos capilares retinianos de camundongos e da matriz subendotelial das culturas endoteliais da retina, seguidas de uma descrição da técnica de medição da rigidez usando microscopia de força atômica.

Isolamento de capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial para medição de rigidez usando microscopia de força atômica

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Isolamento de capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial para medição de rigidez usando microscopia de força atômica

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