Name: Geração e caracterização de organoides de útero de rato a partir de células-tronco epiteliais endometriais de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprenda a gerar organoides de útero de rato a partir de células-tronco epiteliais endometriais. Este protocolo reprodutível avança a pesquisa em biologia reprodutiva feminina e doenças endometriais.

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<ol><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Anti-CD15 (SSEA-1)</td><td>Abcam</td><td>ab135377</td><td>Coelho, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Receptor Anti-Estrogênio alfa</td><td>Abcam</td><td>ab32063</td><td>Coelho, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-pan Citoqueratina</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>Camundongo, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>Receptor Anti-Progesterona</td><td>Abcam</td><td>ab101688</td><td>Coelho, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab279653</td><td>Mouse, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>A8301</td><td>TargetMol</td><td>909910-43-6</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Merck</td><td>E8875</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Contagem de Células-8</td><td>Beyotime</td><td>C0038</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>BioLegend</td><td>109819</td><td>1:20 (FC), Azul Pacífico</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BioLegend</td><td>101806</td><td>1:20 (FC), FITC</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>303120</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>301703</td><td>1:20 (FC), PE</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>TargetMol</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Solução de colheita de organoides</td><td>R& D Systems</td><td>3700-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 TSA Kit de Sistema de Fluorescência</td><td>APExBIO</td><td>K1051</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 TSA Kit de Sistema de Fluorescência</td><td>APExBIO</td><td>K1052</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>BioLegend</td><td>369803</td><td>1:20 (FC),</td></tr><tr><td>PerCP Fluoresceína TSA Kit de sistema de fluorescência</td><td>APExBIO</td><td>K1050</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coelho IgG/HRP de cabra</td><td>APExBIO</td><td>bs-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Substituição do soro knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix</td><td>Takara</td><td>RR063A</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Merck</td><td>57-83-0</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley rat&nbsp;</td><td>Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>BioLegend</td><td>323047</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>TB Green Fast qPCR Mix</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>TriZOL</td><td>Invitrogen</td><td>15596026CN</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>u-Slide 8 placas de poços</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TargetMol</td><td>146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td><iniciadores > qPCR fortes de genes-alvo&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genes</td><td>Company</td><td>Sequences</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACATGCCGCCTGGAGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH R</td><td>Sangon biotech</td><td>AGCCCAGGATGCCCTTTAGT</td><td></td></tr><tr><td>rat Nanog F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACTAGCAACGGCCTGACTCA</td><td></td></tr><tr><td>rato Nanog R&nbsp;</td><td>Sangon biotech</td><td>CTGCAATGGATGCTGGGATA</td><td></td></tr><tr><td>rat Sox2 F</td><td>Sangon biotech</td><td>ATTACCCGCAGCAAAATGAC</td><td></td></tr><tr><td>rat Sox2 R</td><td>Sangon biotech</td><td>ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>rat Oct4 F</td><td>Sangon biotech</td><td>CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA</td><td></td></tr><tr><td>rat Oct4 R</td><td>Sangon biotech</td><td>ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG</td><td></td></tr></tbody></table>

geração e caracterização de organoides de útero de rato a partir de células-tronco epiteliais endometriais de rato

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

As reESCs e organoides do útero de ratas foram estabelecidos a partir de seis ratas Sprague-Dawley com peso entre 200 g e 250 g, seguindo o protocolo descrito na Figura 1. Com base no sucesso da cultura de longo prazo de células-tronco epiteliais endometriais humanas, a formulação REEM consistiu predominantemente em Y27632, A8301 e CHIR99021. Para estabilizar as reESCs in vitro, inicialmente isolamos células endometriais do endométrio de ratos usando técnicas enzimáticas e mecânicas. A análise por citometria de fluxo na Figura 2A revelou que as células endometriais primárias compreenderam aproximadamente 50% de células epiteliais expressando CD9 (49,8%), com baixos níveis de EpCAM (4,49%) e CD24 (2,64%). O marcador SSEA-1 para reESCs estava presente em 6,58%, enquanto os marcadores endoteliais CD31 (30,9%) e CD45 (70,3%) estavam relativamente altos.
No entanto, o cultivo em REEM resultou em reESCs P1 exibindo uma morfologia espiralada ou poliédrica uniforme e formando estruturas clonais compactas (Figura 2D). A remoção gradual de fatores individuais do REEM levou a uma diminuição correspondente na capacidade proliferativa das reESCs. O ensaio de formação de clones destacou o papel crítico de Y27632 na cultura estável de reESCs ( Figura 2B , C ). Na terceira passagem, as reESCs exibiram expressão consistente de SSEA-1 e citoqueratina, indicando expansão bem-sucedida de reESCs primárias durante a cultura (Figura 2F). Além disso, as reESCs mantiveram uma capacidade proliferativa robusta e estável mesmo em passagens tardias (Figura 2E), demonstrando seu isolamento e expansão bem-sucedidos no atual sistema REEM.
As culturas organoides foram estabelecidas seguindo um sistema previamente relatado derivado de células-tronco endometriais humanas8. Em 3 dias, as reESCs exibiram rápida auto-organização em estruturas semelhantes a organoides com um centro oco, que posteriormente aumentou em tamanho e espessura (ver Figura 3A). Os resultados típicos da coloração HE que ilustram a formação de organoides por reESCs são apresentados na Figura 3B. Essas culturas organoides podem ser sustentadas por passagem, como evidenciado pela alta viabilidade celular indicada pela coloração Ki67 após ciclos de passagem direta e congelamento e descongelamento. Além disso, a coloração HE foi realizada na 10ª geração de organoides, e os resultados mostraram que a estrutura organoide pode ser mantida intacta (ver Figura 3E). Além disso, os resultados de qPCR indicaram que Nanog, Sox2 e Oct4 foram expressos em níveis comparáveis aos da geração P1 (Figura 3F). Essa descoberta sugere o potencial para a cultura de organoides a longo prazo dentro do sistema atual.
Nosso estudo realizou uma investigação preliminar sobre a resposta de estruturas uterinas de ratos a E2 e P4. A coloração por imunofluorescência na Figura 4A revelou a presença de receptores de estrogênio e progesterona. Após a suplementação de E2 , esses organoides passaram por uma transição de uma forma esférica oca para um padrão de crescimento interno mais densamente povoado ( Figura 4C ). A exposição subsequente ao P4 levou à diminuição da permeabilidade das estruturas densas, resultando em sua desintegração ( Figura 4B ). Esses achados sugerem que o E2 potencialmente impulsiona uma maior diferenciação de estruturas semelhantes ao útero de ratos, enquanto o P4 pode desencadear vias apoptóticas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Procedimentos usados para estabelecer células-tronco epiteliais endometriais de rato e organoides de útero de rato. Abreviatura: SD = Sprague-Dawley. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Geração e cultura a longo prazo de células-tronco epiteliais endometriais de rato in vitro. (A) Análise de citometria de fluxo mostrando a proporção de células positivas no endométrio de rato. (B) Coloração violeta cristalina de clones em REEM com ou sem A8301, Y27632 ou CHIR99021, respectivamente. Barras de escala = 1 cm. (C) Os números de clones em REEM com ou sem fatores. As barras de erro representam o desvio padrão; n = 3 doadores (***, p&lt;0,001). (D) Imagens de microscopia de luz de células-tronco epiteliais endometriais de rato P1 com e sem coloração violeta de cristal. (E) Análises CCK-8 de células-tronco epiteliais endometriais de rato na passagem 1, passagem 7 e passagem 14. As barras de erro representam o desvio padrão, n = 3. (F) Análises de imunofluorescência demonstrando a expressão de citoqueratina e SSEA-1. Abreviatura: REEM = meio de expansão reESCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Geração e cultura de longo prazo de organoides endometriais de ratos in vitro. (A) Imagens de microscopia óptica de organoides endometriais de ratos P1. (B) Coloração H &amp; E para organoides P1 de células-tronco epiteliais endometriais de ratos. (C) Análises de imunofluorescência demonstrando a expressão de citoqueratina e SSEA-1. (D) Análises de imunofluorescência demonstrando a expressão de Ki67 e SSEA-1. (E) Coloração H &amp; E para organoides de ratos P 10. (F) Análises de qPCR para a expressão de Nanog, Sox2 e Oct-4 em organoides endometriais de ratos P1 e P10. Expressão normalizada para GAPDH (n = 3, teste t não pareado bicaudal, n.s. = não significativo). Abreviatura: H&amp;E = hematoxilina e eosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig04.jpg"> 
Figura 4: Cultura sequencial de organoides com E2 e P4. (A) Análises de imunofluorescência demonstrando a expressão do receptor de estrogênio, receptor de progestogênio e SSEA-1. (B) Visão geral das imagens de microscopia de luz de organoides de ratos cultivados em E2 e P4. (C) Imagens de microscopia de luz demonstram a transformação de uma esfera oca em densa dentro da cavidade interna de organoides após serem cultivadas 7 dias em E2. Abreviaturas: ER = receptor de estrogênio; PR = receptor de progestogênio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Geração e caracterização de organoides de útero de rato a partir de células-tronco epiteliais endometriais de rato

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

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