Name: Entrega consistente de vírus adeno-associado por injeção lateral na veia da cauda em camundongos adultos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprenda a realizar injeções na veia lateral da cauda em camundongos adultos para administração de vírus adeno-associado (AAV). Este protocolo otimizado facilita a terapia gênica em distúrbios neuromusculares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer à equipe da unidade de cuidados com animais do NINDS por seu apoio. Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Pesquisa Intramural do NIH, NINDS (Relatório Anual Número 1ZIANS003129). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Terapias baseadas em AAV via injeção intravenosa em modelos pré-clínicos de camundongos

<ol><li>Tisdale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ideas+initiative%3A+Pilot+study+to+assess+the+impact+of+rare+diseases+on+patients+and+healthcare+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">The ideas initiative: Pilot study to assess the impact of rare diseases on patients and healthcare systems.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 429(2021).</li>
<li>Condo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+monogenic+diseases%3A+Molecular+pathophysiology+and+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rare monogenic diseases: Molecular pathophysiology and novel therapies.</a> Int J Mol Sci. 23 (12), 6525(2022).</li>
<li>Vaisitti, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+rare+and+monogenic+diseases+in+pediatric+organ+transplant+recipients+in+italy%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">The frequency of rare and monogenic diseases in pediatric organ transplant recipients in italy.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 374(2021).</li>
<li>Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+platforms+within+the+gene+therapy+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Viral vector platforms within the gene therapy landscape.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+in+gene+therapy%3A+Where+do+we+stand+in+2023%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Viral vectors in gene therapy: Where do we stand in 2023.</a> Viruses. 15 (3), 698(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+non-viral+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Emerging non-viral vectors for gene delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 272(2023).</li>
<li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl 3rd, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28aav%29+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (aav) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li>
<li>Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+systems+for+gene+therapy%3A+A+comprehensive+literature+review+of+progress+and+biosafety+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biosaf%22%5BJournal%5D)">Viral vector systems for gene therapy: A comprehensive literature review of progress and biosafety challenges.</a> Appl Biosaf. 25 (1), 7-18 (2020).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+and+strategies+for+the+development+of+safe+and+effective+optimized+aav+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized aav vectors for human gene therapy.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).</li>
<li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+animal+models+in+biomedical+research%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">Role of animal models in biomedical research: A review.</a> Lab Anim Res. 38 (1), 18(2022).</li>
<li>Jucker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefits+and+limitations+of+animal+models+for+translational+research+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The benefits and limitations of animal models for translational research in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 16 (11), 1210-1214 (2010).</li>
<li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rodents+as+models+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Bioallied+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of rodents as models of human diseases.</a> J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Anders, H. J., Vielhauer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+validating+novel+targets+with+in+vivo+disease+models%3A+Guidelines+for+study+design%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Identifying and validating novel targets with in vivo disease models: Guidelines for study design.</a> Drug Discov Today. 12 (11-12), 446-451 (2007).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+Routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li>Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aav9+transduction+mediated+by+systemic+delivery+of+vector+via+retro-orbital+injection+in+newborn%2C+neonatal+and+juvenile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice.</a> Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).</li>
<li>Hauff, P., Nebendahl, K. Drug administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHauff%2C+P+%22Small+Animal+Imaging%3A+Basics+and+Practical%22">Small Animal Imaging: Basics and Practical</a>. Kiessling, F., Pichler, B. J., Hauff, P. , Springer International Publishing. Cham. 127-152 (2017).</li>
<li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+best+practice+for+validating+tail+vein+injections+in+rat+with+near-infrared-labeled+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents.</a> J Vis Exp. (146), (2019).</li>
<li>Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+tail-vein+injection+in+mice+using+a+modified+anaesthesia+induction+chamber+versus+a+common+restrainer+without+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia.</a> Lab Anim. 53 (2), 190-201 (2019).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28icv%29+and+intravenous+%28iv%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (icv) and intravenous (iv) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), e2968(2011).</li>
<li>Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+tips+for+intravenous+administration+of+adeno-associated+virus+to+rats+and+evaluation+of+central+nervous+system+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction.</a> J Vis Exp. (126), e55994(2017).</li>
<li>Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contemporary+warming%2Frestraining+device+for+efficient+tail+vein+injections+in+a+murine+fungal+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model.</a> J Vis Exp. (165), e61961(2020).</li>
<li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+tail+vein+metastasis+assays+and+real-time+in+vivo+imaging+to+quantify+breast+cancer+metastatic+colonization+and+burden+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs.</a> J Vis Exp. (154), e60687(2019).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research.+Compound+administration+I%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research. Compound administration I.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Lateral tail vein injection in mice and rats (preferred technique for vascular access in mice. UCSF Office of Research, Institutional Animal Care and Use Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf">https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf</a> (2023).</li>
<li>Jones, K. Tail vein injections in the mouse and rat sop. UBC Animal Care Guidelines SOP: ACC-2012-Tech03. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/ACS-2012-Tech03.pdf">https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/ACS-2012-Tech03.pdf</a> (2012).</li>
<li>Liadaki, K., Luth, E. S., Kunkell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-detection+of+gfp+and+dystrophin+in+skeletal+muscle+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Co-detection of gfp and dystrophin in skeletal muscle tissue sections.</a> Biotechniques. 42 (6), 699-700 (2007).</li>
<li>Burr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allometric-like+scaling+of+aav+gene+therapy+for+systemic+protein+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Allometric-like scaling of aav gene therapy for systemic protein delivery.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 368-379 (2022).</li>
<li>Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+screening+methods+underreport+aav-mediated+transduction+and+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Standard screening methods underreport aav-mediated transduction and gene editing.</a> Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).</li>
<li>Rodriguez-Estevez, L., Asokan, P., Borras, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+optimization+of+aav+vectors+for+human+gene+therapy+of+glaucoma+and+their+reversed+cell+entry+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transduction optimization of aav vectors for human gene therapy of glaucoma and their reversed cell entry characteristics.</a> Gene Ther. 27 (3-4), 127-142 (2020).</li>
<li>Hatakeyama, S., Yamamoto, H., Ohyama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+formation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor formation assays.</a> Methods Enzymol. 479, 397-411 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm divulgações que sejam relevantes para o trabalho publicado neste artigo.

As terapias baseadas em AAV têm grande potencial para distúrbios monogênicos devido à versatilidade do AAV como vetor de terapia gênica, o que torna possível personalizar os AAVs para atender às várias necessidades de entrega de diferentes distúrbios 4,5,7,9. Os AAVs são comumente administrados por injeção intravenosa em modelos de camundongos pré-clínicos para testar a segurança e a eficácia de possíveis terapias16. Como diferentes doses de AAV injetadas podem resultar em diferenças marcantes nos resultados experimentais, é fundamental que os experimentadores sejam capazes de injetar consistentemente a dose de AAV pretendida para garantir a validade e robustez dos dados in vivo gerados28. As injeções intravenosas são amplamente utilizadas, mas são tecnicamente desafiadoras, exigindo treinamento extensivo e prática contínua para desenvolver e manter um nível de habilidade que garanta injeções consistentemente bem-sucedidas 16,17,18,19. Além de injetar corretamente o AAV, geralmente é desejado usar ensaios para avaliar a biodistribuição do AAV injetado e a eficiência de entrega aos tecidos ou células-alvo29,30.
Este protocolo visa ajudar os experimentadores a realizar facilmente injeções IV com sucesso e consistência, descrevendo minuciosamente os detalhes de um protocolo de injeção IV otimizado para administrar AAV em camundongos não sedados de 7 a 9 semanas de idade. É importante notar que camundongos marcadamente menores ou maiores do que camundongos selvagens na faixa etária usada aqui podem apresentar um desafio maior devido a uma visibilidade reduzida das veias ou incompatibilidade com os contentores usados neste método. Foi relatado anteriormente que as injeções intravenosas de cauda não são apropriadas para administrar reagentes por via intravenosa em camundongos com menos de 6 semanas de idade devido ao pequeno tamanho do vaso31. Embora possível, pode ser difícil injetar consistentemente camundongos com peso inferior a 22,0 g. com sucesso. Os investigadores que usam camundongos de tamanho atípico podem precisar fazer adaptações no procedimento. Este protocolo também descreve vários ensaios que podem ser usados para avaliar a biodistribuição e a eficiência de transdução do AAV.
Alguns pontos críticos precisam ser lembrados ao seguir este protocolo. Durante a injeção, as agulhas 29 G proporcionam maior resistência se a agulha não estiver dentro da veia. Isso reduz o volume perdido pela injeção perivascular acidental da solução durante tentativas de injeção malsucedidas. As seringas de insulina têm volumes mortos menores do que as seringas comuns. Se estiver usando uma seringa e/ou agulha diferente das listadas aqui, pode ser necessário preparar um volume injetado adicional nas etapas 1.1.3.3 do protocolo para levar em conta um volume maior de espaço morto (por exemplo, adicionar 30 μL à dose pretendida em vez de 15 μL).
Se forem formadas bolhas de ar finas causadas por aspiração nas laterais da seringa durante a aspiração da dose de AAV para a seringa, puxe lentamente o injetado para cima na seringa. Isso removerá a maioria das pequenas bolhas de ar. Carregue pelo menos 10-15 μL adicionais de AAV no volume pretendido a ser injetado. Este volume adicional é para contabilizar qualquer volume que possa ser perdido durante a expulsão de bolhas de ar ou possíveis tentativas de injeção malsucedidas. (por exemplo, se o volume alvo a ser injetado for de 150 μL, carregue 165 μL na seringa (a meio caminho entre as marcas de 160 μL e 170 μL na escala da seringa). Se a agulha for colocada corretamente dentro da veia e o volume na seringa estiver em 165 μL imediatamente antes da tentativa de injeção bem-sucedida, administre o reagente até que restem 15 μL na seringa (a meio caminho entre as marcas de 10 μL e 20 μL), fornecendo assim 150 μL (165 μL - 150 μL = 15 μL)). O alinhamento do lúmen chanfrado (chanfro voltado para cima) com a escala da seringa permite rastrear o volume fornecido durante a injeção.
Alguns experimentadores podem preferir colocar o mouse de lado para que uma de suas veias fique reta e facilmente acessível em comparação com um mouse em pé. No entanto, a cauda de um rato de lado será inclinada em ângulos diferentes, dependendo do tamanho do rato, exigindo um ajuste do ângulo de injeção ao injetar ratos de tamanhos diferentes. Isso pode afetar negativamente a consistência do sucesso do procedimento. Durante as tentativas iniciais de prática, os experimentadores podem tentar ambas as orientações de restrição do mouse para determinar sua abordagem preferida. Ter o mouse nos pés permite acesso rápido e fácil a ambas as veias laterais da cauda. Isso reduz o tempo de restrição quando o acesso a ambas as veias é necessário no caso de várias tentativas de injeção malsucedidas.
Se injetar a veia lateral perto da base da cauda (mais perto do corpo do camundongo) (especialmente para camundongos pesando >30 g.), ajuste o ângulo de injeção de paralelo à veia para 5 ° -10 ° para a veia, pois a veia na base da cauda é ligeiramente mais profunda do que distalmente.
Os protocolos de digestão de RNase e verificação de contaminação por RNA listados aqui foram verificados em amostras de DNA isoladas de tecidos hepáticos frescos congelados contendo um total de 175-700 ng de ácidos nucléicos em 20 μL. O protocolo de digestão de RNase também foi testado em amostras de DNA isoladas de tecidos hepáticos recém-congelados e células classificadas por FACS para confirmar a presença do genoma do vetor e do genoma do camundongo após a digestão da RNase. Os resultados foram visualizados usando eletroforese em gel de agarose da amplificação por PCR dos amplicons alvo.
Seguir a metodologia descrita pode reduzir o tempo de treinamento e prática necessário para dominar as injeções IV e resultar em uma maior taxa de injeção bem-sucedida, o que economizaria reagentes. Este protocolo utiliza ferramentas simples e comumente usadas sem a necessidade de equipamentos ou configurações avançadas que podem não estar prontamente disponíveis. Além disso, as etapas de injeção IV listadas aqui podem ser aplicadas a uma ampla gama de injetados que precisam ser administrados por via intravenosa, como oligonucleotídeos antisense (ASOs), com as modificações apropriadas feitas nas etapas de preparação do injetado, dependendo do injetado.

As doenças monogênicas representam 80% das doenças raras, que afetam coletivamente 300 milhões de indivíduos em todo o mundo 1,2. Atualmente, não há terapias curativas aprovadas para a maioria dessas doenças raras altamente debilitantes 1,2,3. No entanto, os distúrbios monogênicos são candidatos ideais para terapias gênicas que podem substituir, suplementar, corrigir ou silenciar genes disfuncionais 4,5. Atualmente, vários vetores estão sendo desenvolvidos e usados para fornecer terapias gênicas a tipos específicosde células 4,6. Um desses vetores é o vírus adeno-associado (AAV). O AAV é um parvovírus não patogênico que está sendo cada vez mais usado como vetor de terapia gênica7. Em comparação com outros vetores virais, o AAV tem menor imunogenicidade, menor potencial de integração ao genoma do hospedeiro e capacidade de transduzir eficientemente células em divisão e não divisão em vários tecidos 7,8. Além disso, várias abordagens foram desenvolvidas para projetar e identificar AAVs com características desejáveis, como tropismo tecidual específico ou imunogenicidade ainda mais reduzida, o que aumenta muito a versatilidade do AAV como vetor viral para diferentes indicações9. Esses fatores tornaram o AAV um vetor de terapia gênica amplamente investigado e levaram ao desenvolvimento de várias terapias genéticas baseadas em AAV aprovadas pela FDA10.
Modelos de camundongos são comumente usados para testar possíveis terapias genéticas in vivo e entender melhor os mecanismos patológicos de distúrbios monogênicos. Isso se deve à recapitulação dos modelos de camundongos das patologias de diferentes condições, à semelhança de seu genoma com o genoma humano e à relativa facilidade de manuseio, manutenção e geração de camundongos 11,12,13. O teste in vivo é particularmente importante ao estudar distúrbios que afetam vários sistemas ou regiões do corpo, como distrofias musculares. Para esses distúrbios, os testes in vitro podem não ser suficientes para avaliar de forma abrangente a segurança, eficácia, farmacocinética e farmacodinâmica da terapêutica destinada a atingir diferentes regiões do corpo após administração sistêmica14.
Várias vias de administração sistêmica podem ser usadas para administrar medicamentos. Cada via tem suas vantagens, desvantagens e grau de compatibilidade com o modelo animal e o medicamento investigado15. A injeção intravenosa (IV) da veia da cauda lateral é uma via comumente usada para a administração sistêmica de AAV em camundongos16. As injeções laterais nas veias da cauda permitem a administração rápida e direta do injetado na corrente sanguínea do camundongo, garantindo alta biodisponibilidade do medicamento na circulação sistêmica17. Eles também exigem ferramentas relativamente simples e comumente disponíveis para serem executadas. No entanto, principalmente devido ao pequeno diâmetro da veia da cauda e à dificuldade de localização da veia, as injeções laterais da veia da cauda são tecnicamente desafiadoras e requerem um alto grau de habilidade e prática constante para evitar tentativas fracassadas de injeção ou administração incompleta da dose 16,17,18,19. Isso pode resultar na perda de reagentes caros ou resultados imprecisos, especialmente se a injeção incompleta não for reconhecida durante a injeção. Nossa experiência resumida aqui é baseada em protocolos relatados em artigos bem documentados que adaptamos para nosso uso, otimizando várias etapas do procedimento de injeção da veia da cauda lateral para garantir injeções consistentemente bem-sucedidas 20,21,22,23,24,25,26,27.
Aqui, descrevemos este protocolo detalhado de injeção de veia da cauda lateral otimizado para administrar AAV em camundongos não sedados de 7 a 9 semanas usando ferramentas simples e comumente disponíveis. Além disso, fornecemos os protocolos para métodos usados para avaliar a entrega e a biodistribuição de AAV. Esses protocolos abrangem coleta de tecido pós-injeção, fixação de tecido, extração de DNA e genoma vetorial de reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) por quantificação do genoma diplóide (vg/dg). O protocolo de injeção IV e as dicas fornecidas aqui visam aumentar a facilidade de realizar com sucesso injeções laterais na veia da cauda. Isso ajudará potencialmente a reduzir o tempo necessário para dominar as habilidades de injeção e, ao mesmo tempo, melhorar a precisão e a consistência das injeções.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m seringa</td><td>de filtro Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>seringas de insulina de 0,3 mL com agulha 29G</td><td>BD Biosciences</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>Crystalgen</td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>The Warner Graham Company</td><td>201096</td><td></td></tr><tr><td>10x tamponado com fosfato solução salina (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Usado para preparar 1x PBS para fixação de tecido</td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de tubo cônico de 15 mL</td><td>Múltiplas fontes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico à prova de 190</td><td>A Warner Graham Company</td><td>6810-01-113-7320</td><td>Usado para preparar etanol a 70%</td></tr><tr><td>1x PBS Gibco estéril</td><td></td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de armazenamento de tecido de microcentrífuga de 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído a 4% (PFA)</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Vírus adeno-associado (AAV)</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>DNA de fita simples (ssDNA) AAV foi embalado para fornecer Cre recombinase como o transgene impulsionado pelo promotor CMV</td></tr><tr><td>Cotonete com álcool</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de lise de contas</td><td>Next Advance</td><td>GREENE5</td><td></td></tr><tr><td>BsuRI (HaeIII) enzima de restrição</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Liquidificador de bala</td><td>Camundongos</td> derivados de Next Advance <td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>Ai14 da cepa JAX 007914 (fundo genético: C57BL / 6J)</td> <td>N / A</td><td>N / A</td><td>Camundongos contendo o alelo Ai14 Cre-repórter foram adquiridos da JAX (número de catálogo: 007914)</td></tr><tr><td>Almofadas absorventes descartáveis</td> Pinça de dissecação <td>de 1420662</td><td></td><td>Fisherbrand</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools (FST)</td> <td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de degradação de DNA (DNAZap)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Extraction RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Para digestão de RNA durante extração de ácido nucleico</td></tr><tr><td>RNase livre de DNase para limpeza de DNA</td><td>&nbsp;F. Hoffmann-La Roche</td><td>11119915001</td><td>Para digestão de RNA após ácido nucleico kit de PCR de sonda de extração</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>software de dPCRe&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Pacote de software QIAcuity&nbsp;</td></tr><tr><td>Plataforma elevada</td><td>Múltiplas fontes</td><td>N/A</td><td>Uma caixa de pontas de pipeta vazia foi usada para elevar o limitador do mouse durante o aquecimento da cauda</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Múltiplas fontes</td><td>N/A</td><td>Modelo usado aqui: Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>Software de microscópio de fluorescência&nbsp;</td><td>Várias fontes&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Software usado aqui: NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 5350</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade</td><td>Eppendorf</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de metal</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>Metilbutano</td><td>J.T. Baker</td><td>Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>Qualidade da água de grau molecular</td><td>Biológico</td><td>351-029-131</td><td></td></tr><tr><td>Limitador de tubo de rato</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga Myfuge</td><td>Referencial Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador de reação em cadeia da polimerase</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1851148</td><td>Modelo: C1000</td></tr><tr><td>Toalhetes de precisão</td> Touch <td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24 poços</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One dPCR sistema</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blood & Kit de Tecidos</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Usado para extração de DNA de tecidos</td></tr><tr><td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Usado para limpeza de DNA genômico, e o isolamento de DNA de pequenos volumes de sangue prtocotol foi usado para extração de DNA de células classificadas por FACS</td></tr><tr><td>Cone de cone de contenção de roedores</td><td>Braintree Scientific</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>Escala</td><td>Ohaus</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de isopor</td><td>Múltiplas fontes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de superfície e desinfetante</td><td>Peroxigard</td><td>29101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Múltiplas fontes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de transferência</td><td>Ferramentas de Belas Ciências (FST)</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Daigger & Empresa</td><td>22220A</td><td>Modelo: Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

entrega consistente de vírus adeno-associado por injeção lateral na veia da cauda em camundongos adultos

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

Muitos distúrbios afetam vários órgãos ou envolvem diferentes regiões do corpo, por isso é fundamental fornecer terapêutica sistemicamente para atingir as células afetadas localizadas em diferentes locais. A injeção intravenosa é uma via de administração sistêmica amplamente utilizada em estudos pré-clínicos que avaliam tratamentos destinados à administração em todo o corpo. Em camundongos adultos, envolve a administração intravenosa do agente terapêutico nas veias laterais da cauda do camundongo. Quando dominadas, as injeções nas veias da cauda são seguras e rápidas e requerem apenas ferramentas simples e comumente disponíveis. No entanto, as injeções nas veias da cauda são tecnicamente desafiadoras e exigem treinamento extensivo e prática contínua para garantir a entrega precisa da dose pretendida.
Aqui descrevemos um protocolo detalhado, otimizado, de injeção de veia da cauda lateral que desenvolvemos com base em nossa experiência e em recomendações que haviam sido relatadas anteriormente por outros grupos. Além dos aparelhos de retenção de camundongos e seringas de insulina, este protocolo requer apenas reagentes e equipamentos que estão prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios. Descobrimos que seguir este protocolo resulta em uma entrega intravenosa consistentemente bem-sucedida de vírus adeno-associado (AAV) nas veias da cauda de camundongos de 7 a 9 semanas de idade não sedados. Além disso, descrevemos os protocolos otimizados para a detecção histológica de proteínas repórter fluorescentes e quantificação do genoma vetorial por genoma diplóide (vg / dg) usados para avaliar a transdução e biodistribuição de AAV. O objetivo deste protocolo é ajudar os experimentadores a realizar facilmente injeções nas veias da cauda com sucesso e consistência, o que pode reduzir o tempo de prática necessário para dominar a técnica.

Camundongos machos de sete a nove semanas de idade foram injetados com AAV por meio de injeção lateral na veia da cauda a 1,5 × 1012 vg / camundongo administrados em 150-200 μL de volume injetado. O ssDNA AAV usado aqui entregou o transgene Cre recombinase impulsionado pelo promotor do CMV. Os camundongos injetados eram homozigotos para o alelo Cre reporter Ai14. Quando expostas à Cre recombinase, as células contendo o alelo Ai14 expressam a proteína fluorescente tdTomato. Como a expressão de tdTomato é causada pela recombinação genômica induzida por Cre, as células que expressam tdTomato indicam células que foram transduzidas diretamente pelo AAV ou eram células de progênie de células transduzidas. Os dados mostrados aqui são de camundongos injetados com AAV9-CMV-Cre a 1,5 × 1012 vg / camundongo administrados em 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg / kg). Os camundongos foram sacrificados 28 dias após a injeção e os tecidos foram coletados conforme descrito acima. Alguns músculos esqueléticos e lobos hepáticos foram digeridos e suas células foram coletadas usando FACS. Alguns lobos do fígado foram congelados imediatamente usando metilbutano pré-resfriado para extração de ácido nucleico. Alguns músculos esqueléticos e lobos hepáticos foram congelados fixos para imagens histológicas de tdTomato fluorescente. O tdTomato foi expresso difusamente em todo o fígado (Figura 2A) e quadríceps (Figura 2C), indicando que o AAV9 atingiu e transduziu amplamente diferentes regiões de ambos os tecidos.
O DNA extraído do fígado fresco congelado e das células classificadas por FACS foi usado para quantificar vg/dg usando dPCR. A quantificação Vg/dg pode ser usada para avaliar a consistência da injeção e a eficiência de transdução do AAV na amostra analisada. Os gráficos de dispersão de gotículas 1D da amostra de tecido hepático recém-congelado e das células classificadas por FACS foram usados para garantir a validade do ensaio ( Figura 3A , C ). O gráfico de dispersão mostrou a presença de partições positivas e negativas, separação clara entre as partições positiva e negativa que permite a determinação precisa do limiar de detecção e a presença de gotículas entre as partições positivas e negativas, o que pode reduzir a precisão do ensaio de dPCR. O cumprimento de todos esses critérios indicou que os resultados do ensaio de dPCR eram válidos. O número de cópias do gene Polr2a em cada amostra foi quantificado para determinar o número de genomas diplóides de camundongo (2 cópias do gene Polr2a/genoma diplóide de camundongo), e primers/sonda contra a sequência do transgene Cre recombinase foram usados para quantificar o genoma viral (1 cópia do transgene/genoma viral, Tabela 1). O valor vg/dg foi quantificado para a amostra de tecido hepático fresco congelado e células classificadas por FACS e mostrou a presença de 187,7 vg/dg e 4,7 vg/dg em cada amostra, respectivamente (Figura 3B,D). Amostras de camundongos injetados com PBS e controles não molde sem ácidos nucléicos foram usados como controles negativos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral da estação de injeção intravenosa. (A) Ferramentas necessárias para realizar a injeção intravenosa. Aqui é mostrado o (1) temporizador, (2) limitador de tubo de mouse, (3) cones de retenção de plástico não cortados e (4) cortados, (5) cotonete com álcool, (6) caixa de pontas de pipeta vazia usada como plataforma para elevar o limitador de tubo de mouse, (7) almofadas absorventes descartáveis, (8) tubo cônico de 15 mL com água morna, (9) suporte de tubo de 15 mL, (10) gaze e (11) seringa de insulina. (B) O mouse é colocado primeiro dentro do limitador do tubo. Em seguida, o cone de retenção cortado é inserido para criar uma luva de retenção ao redor do mouse, se o mouse for muito pequeno para ser restringido apenas pelo limitador de tubo. Certifique-se de que a respiração do mouse não seja obstruída pelos sistemas de contenção. O limitador de tubos é colocado no topo da plataforma elevada para permitir a colocação da cauda do rato em água morna. (C) Posicionamento da cauda do rato e ângulo de retenção da agulha imediatamente antes de realizar a injeção. Puxe a cauda para trás para que a cauda fique esticada e o local da injeção fique completamente horizontal. A agulha é paralela à cauda e à veia, e o chanfro está voltado para cima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Figura 2: Detecção de proteína repórter fluorescente após injeção IV. Camundongos machos de sete a nove semanas de idade com o alelo Cre repórter Ai14 foram injetados por via intravenosa com AAV9-CMV-Cre a 1,5 × 1012 vg/camundongo entregues em 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg) ou PBS. Imagens de fluorescência representativas de seções de fígado de camundongo (A) ou quadríceps (C) após AAV9 administrando injeção de Cre IV. (B) Seções de fígado ou (D) quadríceps de camundongos injetados com PBS foram fotografadas para servir como controles negativos. Os tecidos foram coletados e fixados em congelamento 28 dias após a injeção intravenosa. Pós-exposição a Cre, a proteína fluorescente tdTomato é expressa em células transduzidas e células de progênie de células transduzidas. Seções de 10 μm de espessura foram fotografadas com ampliação de 10x. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Figura 3: Quantificação do genoma vetorial por genoma diplóide (vg/dg). Gráfico de dispersão 1D da quantificação de genomas vetoriais de dPCR em (A) tecido hepático ou (C) células classificadas por FACS coletadas de camundongos injetados com AAV9-CMV-Cre ou PBS. Os gráficos de dispersão mostram as partições de dPCR positivas e negativas, bem como o limite de detecção indicado pela linha horizontal entre as amostras. (B,D) quantificação de vg/dg após quantificar os genomas diplóides de camundongo e genomas vetoriais no (B) tecido hepático ou (D) amostras de células classificadas por FACS. Os resultados mostrados aqui são de um único camundongo injetado com AAV9 e um único camundongo injetado com PBS com uma duplicata técnica de dPCR para cada camundongo. As barras de erro indicam o intervalo de confiança de 95% para cada amostra. Abreviaturas: NTC= Controle sem modelo; dPCR = PCR digital; FACS = classificação de células ativadas por fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cartilha</td>
			<td>Seqüenciar</td>
		</tr><tr><td>Primer Cre para a frente</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Cre primer reverso</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Sonda Cre </td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Primer direto Polr2a </td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Primer reverso Polr2a </td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Sonda Polr2a </td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Sequências de primers e sondas usadas para quantificação de vg/dg. Primers e sonda Cre foram usados para quantificar o genoma do vetor. Primers e sonda Polr2a foram usados para quantificar o genoma diplóide de camundongo.

Aqui, detalhamos um protocolo otimizado para injeção de veia da cauda lateral de camundongo para administrar sistemicamente o vírus adeno-associado (AAV) em camundongos adultos. Além disso, descrevemos protocolos de ensaios comumente usados para avaliar a transdução de AAV.

Entrega consistente de vírus adeno-associado por injeção lateral na veia da cauda em camundongos adultos

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Fonte:Pourshafie, N., et al. Entrega sistêmica de microRNA usando vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores. J. Vis. Exp. (2018).Neste vídeo, uma atrofia muscular espinhal e bulbar ou camundongo afetado por SBMA é submetido à injeção na veia da cauda de vetores AAV (vetores adeno-associados) recombinantes que carregam um plasmídeo que codifica microRNA terapêutico. O vetor produz microRNA que se liga ao AR mutante (receptor de andrógeno)-mRNA...

Injetando vetores adeno-associados recombinantes em um modelo de camundongo com atrofia muscular espinhal e bulbar

Fonte: Grames, M. S., et al. Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus adeno-associado a ratos e avaliação da transdução do sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a injeção na veia da cauda do vírus adeno-associado recombinante (AAV) em ratos. Após a injeção na veia lateral da cauda, o vírus entra na corrente sanguínea, circula pelo coração e chega ao cérebro, onde entra nos neurônios e facilita a produção de proteínas-alvo para aplicações...

 Administração intravenosa de vetores virais adeno-associados recombinantes em modelo de rato 

Aqui descrevemos a entrega de microRNA utilizando um vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 em um modelo do rato de uma doença neuromuscular. Uma única administração periférica em camundongos resultou em superexpressão de miRNA sustentada no músculo e neurônios motores, oferecendo uma oportunidade de estudo miRNA função e potencial terapêutico em vivo.

Entrega sistêmica de MicroRNA utilizando vírus Adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores

O objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar a potência e a segurança da entrega de genes mediada pelo vírus adeno-associado à coluna vertebral (AAV9) usando uma nova técnica de entrega de genes subpial em camundongos adultos.

Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos

Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.

Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Neste manuscrito, a injeção subconjuntival é demonstrada como um método de entrega vetorial válido para tecidos oculares em camundongos usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular.

Administração Subconjuntival de Vetores de Vírus Adenoassociados em Modelos de Pequenos Animais

Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.

Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

Aprenda a realizar injeções na veia lateral da cauda em camundongos adultos para administração de vírus adeno-associado (AAV). Este protocolo otimizado facilita a terapia gênica em distúrbios neuromusculares.

Entrega consistente de vírus adeno-associado por injeção lateral na veia da cauda em camundongos adultos

Explorar mais vídeos