Name: Medições de Microscopia de Força Atômica de Cartilagem em Membros de Axolote Intactos e em Regeneração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a medir propriedades mecânicas da cartilagem de axolote em regeneração usando microscopia de força atômica. Este protocolo garante integridade estrutural para estudos de sinais mecânicos na regeneração tecidual.

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<meta charset="utf8"></head><body>Caracterização mecânica da rigidez tecidual durante a regeneração de membros de axolotes

<ol><li>Mills, L. A., Aitken, S. A., Simpson, A. H. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+non-union+per+fracture%3A+current+myths+and+revised+figures+from+a+population+of+over+4+million+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">The risk of non-union per fracture: current myths and revised figures from a population of over 4 million adults.</a> Acta Orthop. 88 (4), 434-439 (2017).</li>
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<li>Nandra, R., Grover, L., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+non-union+epidemiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trauma%22%5BJournal%5D)">Fracture non-union epidemiology and treatment.</a> Trauma. 18 (1), 3-11 (2016).</li>
<li>Nauth, A., Schemitsch, E., Norris, B., Nollin, Z., Watson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical-size+bone+defects%3A+Is+there+a+consensus+for+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Critical-size bone defects: Is there a consensus for diagnosis and treatment.</a> J Orthop Trauma. 32 (3 Suppl), S7-S11 (2018).</li>
<li>Schemitsch, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+Defining+critical+in+bone+defect+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Size matters: Defining critical in bone defect size.</a> J Orthop Trauma. 31 (10), S20-S22 (2017).</li>
<li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+Salamanders%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: Salamanders.</a> Development (Cambridge). 146 (14), 0-2 (2019).</li>
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<li>Stocum, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+urodele+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of urodele limb regeneration.</a> Regeneration. 4 (4), 159-200 (2017).</li>
<li>Bassat, E., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+signaling+dynamics+of+salamander+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cellular and signaling dynamics of salamander limb regeneration.</a> Curr Opin Cell Biol. 73, 117-123 (2021).</li>
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<li>Godwin, J., Kuraitis, D., Rosenthal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+considerations+for+scar-free+repair+and+regeneration%3A+Insights+from+regenerative+diversity+among+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22International+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix considerations for scar-free repair and regeneration: Insights from regenerative diversity among vertebrates.</a> International J Biochem Cell Biol. 56, 47-55 (2014).</li>
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<li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), aaq0681(2018).</li>
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<li>Currie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axolotl+Digit+Regeneration+Reveals+Spatiotemporal+Choreography+of+Diverse+Connective+Tissue+Progenitor+Pools%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axolotl Digit Regeneration Reveals Spatiotemporal Choreography of Diverse Connective Tissue Progenitor Pools.</a> Dev Cell. 39 (4), 411-423 (2016).</li>
<li>Qin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+novel+mitochondria-related+musculoskeletal+cell+populations+during+adult+axolotl+limb+regeneration+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals novel mitochondria-related musculoskeletal cell populations during adult axolotl limb regeneration process.</a> Cell Death Differ. 28 (3), 1110-1125 (2021).</li>
<li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14, 174-187 (2014).</li>
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<li>d'Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stiffness+in+cell+reprogramming%3A+A+potential+role+for+biomaterials+in+inducing+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The role of stiffness in cell reprogramming: A potential role for biomaterials in inducing tissue regeneration.</a> Cells. 8 (9), 1036(2019).</li>
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<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nat Rev Phys. 1 (1), 41-57 (2019).</li>
<li>El Kirat, K., Burton, I., Dupres, V., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+procedures+for+biological+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Sample preparation procedures for biological atomic force microscopy.</a> J Microsc. 218 (3), 199-207 (2005).</li>
<li>Riquelme-Guzmán, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+development+and+aging+of+the+appendicular+skeleton+in+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Postembryonic development and aging of the appendicular skeleton in Ambystoma mexicanum.</a> Dev Dyn. 251 (6), 1015-1034 (2021).</li>
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<li>Martin, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+distal+forearm+bone+mineral+density%3A+Can+different+forearm+segments+be+used+interchangeably%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Densitom%22%5BJournal%5D)">Measurement of distal forearm bone mineral density: Can different forearm segments be used interchangeably.</a> J Clin Densitom. 2 (4), 381-387 (1999).</li>
<li>Riquelme-Guzmán, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+mechanical+properties+during+axolotl+development+and+regeneration+using+confocal+Brillouin+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of mechanical properties during axolotl development and regeneration using confocal Brillouin microscopy.</a> Open Biol. 12 (6), 220078(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Affinity Designer</td><td>Afinidade</td><td> versão 1.10.4</td><td>Para montagem de figuras</td></tr><tr><td>Agarose Low Melt</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td>Para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Para manchar tecido</td></tr><tr><td>Axiozoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Para imagem samplea sob o AFM</td></tr><tr><td>Benzocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Para anestesiar os animais</td></tr><tr><td>Butorfanol (+)-tartarato sal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; B9156</td><td>como a seta analgésica</td></tr><tr><td>TL1</td> de <td>NanoWorld</td> do<td>modilhão</td><td>para a</td>instalação das medidas</tr> do <tr><td>recuo Cellhesion 200 do AFM equipada com um motorstage</td><td>JPK/Bruker</td><td></td><td>para a entrada</td></tr><tr><td></td><td></td> das medidas<td>CellSense</td> do recuo do AFM <td>para a imagem latente no estereoscópio Olympus UC90</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Para limpar amostras e seção sob vibratome</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ2)</td><td>https://imagej.net/software/fiji</td><td>versão 2.9.0/1.53t</td><td>Para processamento de imagem</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>(versão 8.4.3)</td><td>Para representar graficamente e analisar estatisticamente os dados</td></tr><tr><td>FBS Gibco</td><td></td><td>10270-106</td><td>inativado por calor Para célula meio de cultura</td></tr><tr><td>Cola de histoacrílico (2-butil-cianoacrilato)</td><td>Braun</td><td></td><td>Para colar amostra em placas de Petri</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>Para corar tecido</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>Para meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Microscópio confocal invertido</td><td>Zeiss</td><td>780 LSM</td><td>Para imagens de seções de tecido</td></tr><tr><td>Microscópio confocal invertido</td><td>Zeiss</td><td>980 LSM</td><td>Para obter imagens de seções de tecido</td></tr><tr><td>JPK/Bruker software de processamento de dados</td><td>JPK/Bruker</td><td>SPM 6.4</td><td>Para analisar curvas de força-distância</td></tr><tr><td>L15 médio (Leibovitz)</td><td>Sigma</td><td>L1518</td><td>Para meio de cultura celular</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Para meio de cultura celular</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Para célula Contas de</td></tr><tr><td>poliestireno de cultura média (20 &micro; m de diâmetro); )</td> <td>micropartículas</td><td></td><td>para medições de indentação AFM</td></tr><tr><td>Pyjibe</td><td>escrito por Paul M & uuml; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe</td><td>0.15.0</td><td>Para análise viscoelástica</td></tr><tr><td>Estereoscópio Olympus SX10</td><td>Olympus</td><td>SX10</td><td>Para amputações de membros e montagem de tecidos</td></tr><tr><td>Estereoscópio Olympus UC90</td><td>Olympus</td><td>UC90</td><td>Para imagens</td></tr><tr><td>Vibratome Leica</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td>Para seccionamento de tecidos</td></tr></tbody></table>

medições de microscopia de força atômica de cartilagem em membros de axolote intactos e em regeneração

Atomic Force Microscopy Measurements of Cartilage in Intact and Regenerating Axolotl Limbs

Usando o protocolo descrito acima, medimos o módulo de Young aparente dos tecidos cartilaginosos dos membros do axolote em condições homeostáticas ("Intactas"), durante a histólise inicial da cartilagem e estágios posteriores de condensação da cartilagem (Figura 1A). Também investigamos as propriedades mecânicas dos elementos esqueléticos em diferentes regiões, incluindo seu centro e periferia, conforme mostrado nas imagens que descrevem a posição do balanço (Figura 1B). Para exibir a arquitetura do tecido e correlacioná-la com as medidas de rigidez, os cortes transversais do tecido ou o bloco de tecido onde as medidas foram realizadas foram fixados e corados para filamentos e núcleos de actina com Alexa Fluor 488 conjugado com Faloidina e Hoechst, respectivamente (Figura 1C). Nos membros íntegros, o rádio é claramente maior que a ulna, mas ambos os elementos esqueléticos cartilaginosos têm morfologia semelhante, com núcleos redondos uniformemente distribuídos no centro, circundados por um anel de núcleos achatados correspondente ao pericôndrio24. Durante a fase de histólise, foram detectadas mudanças dramáticas na arquitetura do tecido, com núcleos desorganizados e menos densamente compactados dentro dos elementos esqueléticos. Na fase posterior de condensação da cartilagem, os núcleos se organizam novamente, com uma delimitação clara entre a cartilagem recém-formada e os tecidos em regeneração circundantes. No entanto, nesta fase, a maioria dos núcleos é achatada e não há diferenças morfológicas claras entre o centro e a periferia.
Quando foram medidos cortes transversais de ambos os elementos esqueléticos presentes na região zeugopodial (rádio e ulna), foram detectados módulos de Young aparentes indistinguíveis em membros íntegros, com valores medianos de 10,95 ± 11,69 kPa e 15,71 ± 6,49 kPa, respectivamente (Figura 2D, esquerda), o que concorda com suas semelhanças anatômicas (Figura 1C). Curiosamente, a análise do centro da cartilagem vs. periferia mostrou que, em condições intactas, os módulos de Young aparentes no centro foram maiores do que na periferia, com valores medianos de 16,48 ± 6,86 kPa vs. 7,53 ± 4,63 kPa, respectivamente (Figura 2E, à esquerda). No 5º dia após a amputação, correspondente à fase de histólise, os módulos de Young aparentes no rádio e na ulna diminuíram consideravelmente (0,03 ± 0,02 kPa e 0,13 ± 0,09 kPa, respectivamente, Figura 2D, à direita), mas também desapareceram as diferenças entre o centro e a periferia, com mediana dos módulos de Young de 0,11 ± 0,07 kPa e 0,27 ± 0,34 kPa, respectivamente (Figura 2E, à direita). Ao analisar as propriedades da cartilagem durante uma fase posterior de regeneração, no momento em que a cartilagem começa a condensar, foi detectado um aumento significativo nos módulos de Young aparentes, atingindo valores intermediários entre as fases intacta e histolítica (0,77 ± 0,29 kPa, Figura 2F).
Como pode ser visto nas curvas de exemplo fornecidas (Figura 2B), a histerese ocorreu entre a maioria dos pares de curvas de aproximação e retração, indicando uma resposta viscoelástica do tecido sob força. Além disso, nos propusemos a analisar as propriedades viscoelásticas dos diferentes tecidos com mais detalhes. Como as medições oscilatórias em múltiplas frequências são demoradas e um tanto críticas no que diz respeito à preservação da integridade do tecido, especialmente durante o mapeamento de várias regiões do tecido, usamos um método publicado anteriormente por Abuhattum et al. que permite ajustar a parte de aproximação das curvas força-distância antes da retração imediata do cantilever26. O modelo é baseado em elementos do modelo de Kelvin-Voigt Maxwell e foi previamente aplicado para a análise das propriedades viscoelásticas de células e hidrogéis26, bem como do tecido pancreático27. Mediana dos módulos não relaxados (Intacto: 23,05 kPa, Histólise: 0,20 kPa e Cartilagem de condensação: 1,60 kPa) e dos módulos de Young aparentes (Intacto: 17,54 kPa, Histólise: 0,07 kPa e Cartilagem de condensação: 1,54 kPa) derivados para tecidos nos diferentes estágios de regeneração revelaram diferenças significativas (Figura 2G-H). No geral, uma resposta predominantemente elástica dos tecidos à deformação foi observada na taxa de deformação escolhida, refletida pela grande semelhança dos módulos elásticos aparentes e não relaxados (Figura 2G,H). Valores medianos de viscosidade aparente significativamente mais baixos foram obtidos para o estágio histolítico (0,72 Pa·s) em comparação com os estágios de cartilagem intacta (2,06 Pa·s) e condensada (2,32 Pa·s) (Figura 2I). Como esperado, os módulos aparentes de Young da análise de PyJjibe (Figura 2H) foram de alta concordância com os valores obtidos pelo software de processamento de dados JPK (Figura 2F).
Em conclusão, a caracterização mecânica reflete a reestruturação dinâmica do tecido durante o processo de regeneração. Essas medidas estão de acordo com as observações anatômicas, onde a rigidez do tecido diminui junto com as alterações observadas na arquitetura do tecido (Figura 1C) e é gradualmente recuperada durante a regeneração.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig01v2.jpg"> Figura 1: Medidas de recuo da cartilagem do membro do axolote durante a regeneração. (A) Representação esquemática dos estágios de regeneração. A linha tracejada indica o local aproximado da seção transversal gerada pelo vibratoma onde as medições foram realizadas. (B) Imagens representativas das medidas do centro (superior) e da periferia (inferior) na cartilagem do membro. A ponta preta é o balanço. Barra de escala: 100 μm. (C) Arquitetura tecidual em membros íntegros (esquerda), tecido em histólise (meio) e cartilagem condensada (direita). Verde: núcleos (Hoechst), magenta: filamentos de actina (Faloidina). Barra de escala: 500 μm. C' Região ampliada delineada no painel. Barra de escala: 100 μm. As grades de indentação de 70 μm x 70 μm são indicadas por quadrados pontilhados brancos (centro) e amarelos (periferia). Nos painéis B e C, as letras R e U indicam o Rádio e a Ulna, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5.jpg"> Figura 2: Medição da rigidez da cartilagem durante a regeneração do membro do axolote com AFM. (A) Esquemas do experimento de indentação do AFM mostrados como força em função do tempo (acima) e força em função da distância entre o penetrador e a amostra (abaixo). As curvas de aproximação e retração são exibidas em azul e vermelho, respectivamente. O ponto de contato é exibido por uma linha tracejada vertical preta. As curvas de força-indentação foram ajustadas dentro da parte de aproximação da curva, usando o modelo Hertz/Sneddon (software de processamento de dados JPK e Pyjibe) ou a extensão do modelo KVM viscoelástico em Pyjibe. (B) Curvas representativas da força-distância das medidas do AFM em membros intactos e em regeneração durante as fases da histolise e da cartilagem de condensação. A porcentagem de curvas analisáveis (ou seja, sem artefatos) é indicada no canto superior direito de cada curva. (C) Exemplos de artefatos típicos em curvas de força-indentação, por exemplo, devido ao contato inadequado do penetrador com a superfície. Os exemplos mostrados correspondem a membros intactos, mas tipos equivalentes de artefatos foram observados em todas as condições. Para B-C: Curvas representativas de força-distância foram ajustadas e exibidas usando Pyjibe. A curva azul clara representa a parte de aproximação da curva e a curva vermelha clara é a parte de retração. A linha azul mais escura é o Hertz / Sneddon aplicado para um penetrador esférico. Os respetivos resíduos do ajuste são mostrados abaixo para as curvas de força-distância inferiores. Os resíduos plotados representam a diferença entre os valores de ajuste e de força real. (D) Módulos aparentes de Young dos centros de rádio e ulna medidos em membros íntegros e submetidos a (E) Módulos aparentes de Young do centro da cartilagem versus periferia (Peri) em membros íntegros e durante a histólise. (F) Módulos aparentes de Young medidos para o centro da cartilagem nos estágios analisados de regeneração. Para DF: Cada ponto é derivado de uma curva de força-distância analisada com sucesso, e pontos maiores correspondem a valores medianos por amostra. Os módulos aparentes de Young foram obtidos usando o ajuste do modelo Hertz/Sneddon do software JPK Bruker. (G-I) Módulo não relaxado (G), módulo de Young aparente (H) e viscosidade aparente (I) calculados usando PyJibe (extensão KVM) a partir de medições do centro da cartilagem nos estágios analisados de regeneração. Cada ponto é derivado de uma curva de força-distância analisada com sucesso. As linhas correspondem aos valores medianos de todas as medições por condição. Para D-I: Kruskal-Wallis com teste de comparações múltiplas de Dunn. Letras diferentes representam condições estatisticamente diferentes entre si (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Medições de Microscopia de Força Atômica de Cartilagem em Membros de Axolote Intactos e em Regeneração

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