Name: Monitoramento da atividade de 8 canais (LRRC8/VRAC) de repetição rica em leucina usando transferência de energia de ressonância de Förster de emissão sensibilizada (SE-FRET) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a monitorar a atividade dos canais LRRC8/VRAC usando SE-FRET em células HeLa sob estímulos osmóticos. Este método permite estudar a regulação dinâmica desses canais em compartimentos intracelulares de forma não invasiva.

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<meta charset="utf8"></head><body>Método baseado em FREST para monitorar a atividade do canal LRRC8 sem eletrofisiologia

Canais iônicos compostos por heterômeros de proteínas da família 8 (LRRC8) são encontrados em células de vertebrados, participando de uma ampla gama de funções fisiológicas 1,2. Esses canais LRRC8, identificados pela primeira vez como canais de ânions regulados por volume (VRACs) ou canais de retificação externa sensíveis ao volume (VSOR), desempenham um papel crucial na diminuição do volume regulatório celular 3,4. Eles facilitam a expulsão de íons cloreto e osmólitos orgânicos, que é seguida por efluxo de água em resposta ao inchaço osmótico. Além de seu papel na resposta ao estresse osmótico, seu papel na regulação do volume celular tem sido associado à proliferação e migração celular, apoptose, espermiogênese e integridade epitelial 5,6,7. A alteração do potencial de membrana após a ativação de LRRC8 / VRAC demonstrou contribuir para a diferenciação do miotubo8 e secreção de insulina pelas células β pancreáticas9 , 10 , 11 . Além disso, os canais LRRC8 conduzem uma variedade de osmólitos orgânicos, como as moléculas de sinalização purinérgica ATP e cGAMP ou o aminoácido excitatório glutamato, colocando esses canais na comunicação célula-célula no sistema imunológico ou interação glia-neurônio 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Mesmo os xenobióticos, como o corante fluoresceína, o antibiótico blasticidina S ou a droga anticancerígena cisplatina, são conduzidos pelos canais LRRC8 23,24,25.
Existem inúmeros relatos sobre a transdução de sinal que leva à ativação do LRRC8 / VRAC26 , 27 , 28 . No entanto, o mecanismo permanece obscuro, e a literatura apresenta uma ampla gama de mecanismos potenciais que podem depender do processo fisiológico específico. Isso inclui alterações na força do íon citosólico, interação com o citoesqueleto, composição da membrana, proteínas G, estado redox e cascatas de fosforilação 2,27,29,30,31.
Os canais LRRC8 / VRAC contêm LRRC8A como uma subunidade essencial 3,4 que deve se heteromerizar com pelo menos um de seus parálogos LRRC8B-E para formar canais fisiologicamente funcionais 4,14,32. A composição da subunidade determina as propriedades biofísicas do canal, como retificação e inativação dependente de despolarização 4,29,32,33,34, especificidade do substrato 15,17,20,21,24,35 e algumas vias de ativação 36,37. As estruturas de microscopia crioeletrônica (cryo-EM) mostram que os homômeros LRRC8A, assim como os heterômeros, se reúnem como hexâmeros38,39,40, enquanto as quimeras LRRC8A / LRRC8C que formam canais funcionais são heptâmeros41. A parte N-terminal de todas as proteínas LRRC8 compreende quatro hélices transmembranares, e a parte C-terminal contém um domínio com repetições ricas em leucina (LRRD). As estruturas complexas LRRC8 disponíveis fornecem evidências de que os LRRDs, que se estendem para o citosol 3,4,23, podem sofrer rearranjos conformacionais durante o canal 34,42,43. Essa noção é corroborada pela descoberta de que a fusão C-terminal de proteínas fluorescentes resulta em atividade de canal basal14 e que a ligação de nanocorpos aos domínios pode modular a atividade do canal44. Além disso, alterações conformacionais dos terminais C foram mostradas pela transferência de energia de ressonância de Förster intra-complexo (FRET)45.
O método mais comum para estudar a atividade dos canais iônicos são as medidas eletrofisiológicas46, que foram amplamente aplicadas na investigação de VRACs antes de sua identificação molecular47. No entanto, existem várias maneiras adicionais de monitorar indiretamente a atividade do VRAC, incluindo a medição de seus substratos conduzidos - íons haleto ou osmólitos orgânicos - ou seu efeito no volume celular48. De fato, a identificação de proteínas LRRC8 como VRAC dependeu de um ensaio baseado na extinção de uma proteína fluorescente sensível ao halogeneto49 por iodeto que entra na célula através de VRACs ativados 3,4. Outro método para monitorar a atividade do canal LRRC8 / VRAC faz uso do movimento dos domínios citosólicos que podem ser observados, como em outros canais iônicos 50,51,52,53, por mudanças no FRET45. Para tanto, proteínas fluorescentes que servem como pares FRET, como proteína ciano-fluorescente (CFP)/mCerulean3 como doadora e proteína fluorescente amarela (YFP)/mVenus como aceptor, foram fundidas aos terminais C das proteínas LRRC8 (Figura 1). O FRET intracomplexo entre as subunidades LRRC8 foi demonstrado por experimentos de fotobranqueamento aceptor45. Evitando o método de fotobranqueamento destrutivo, as mudanças de FRET ao longo do tempo foram monitoradas por emissão sensibilizada FRET (SE-FRET), onde basicamente é medida a emissão sensibilizada do aceptor após a excitação do doador devido à sobreposição do espectro de emissão do doador com o espectro de excitação do aceptor. A aplicação de hipotonicidade extracelular, um estímulo para a ativação de LRRC8/VRAC, resultou em uma redução reversível na intensidade de SE-FRET45. É importante ressaltar que as medições simultâneas de patch-clamp de células inteiras e o monitoramento de FRET durante o tratamento hipotônico mostraram que essa redução no FRET de fato refletiu a ativação de LRRC8 / VRAC45. Este método, que evita a ruptura da membrana plasmática ou a alteração do ambiente intracelular pela solução de pipeta, oferece uma alternativa para monitorar a atividade do LRRC8/VRAC. É particularmente útil em ambientes fisiológicos onde a manutenção do citosol nativo é crucial, a resolução subcelular é necessária ou a observação prolongada da atividade do canal é necessária.
Aqui, apresentamos um protocolo para estudar LRRC8 / VRAC com essa leitura baseada em FRET. O protocolo descreve como manusear e transfectar células, adquirir amostras e imagens de controle, analisar os dados e calcular os valores de FRET (SE-FRET) de emissão sensibilizada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Esquema do sistema de pares LRRC8 FRET. mCerulean3 é mostrado em ciano, e mVenus é mostrado em amarelo. Após a abertura do VRAC, a distância (e/ou a orientação espacial) entre os fluoróforos muda, resultando em uma transferência de energia reduzida entre o doador (Don) e o aceitador (Acc) e, por sua vez, diminuindo o FRET observado. Criado com BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Câmera DFC9000GTC</td><td>Leica</td><td>11547007</td><td></td></tr><tr><td>CFP-18aa-YFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; Presente de C.F. Kaminski (Universidade de Cambridge, Reino Unido)</td></tr><tr><td>Cicloheximida (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66-81-9</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Manitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Meio de Águia Modificado com Dulbeccos)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Tampão de Fosfato Salino de Dulbecco)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Roda de filtro de emissão (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)</td><td>Leica</td><td>11525480</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Soro Fetal Bovino)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro CYR71010</td><td>Leica</td><td>11525416</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE Promega</td><td></td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de fundo Glas 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td><td>ACC 57</td><td>Carcinoma do colo do útero de mamíferos / Obtido de Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Disch 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>KCl (cloreto de potássio)</td> <td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>LAS X FRET Wizard</td><td>Leica</td><td></td><td></td>11640862</tr><tr><td>Fonte de luz LED8</td><td>Leica</td><td>11504256</td><td></td></tr><tr><td>LRRC8A-mCerulean3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>LRRC8E-mVenus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>Luna-II Automated Cell Counter</td><td>logos biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II Cell Counter Slides</td><td>logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (cloreto de magnésio)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio THUNDER Imager célula viva</td><td>Leica</td><td>11525681</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (cloreto de sódio)</td><td>Carl Roth</td><td>9263</td><td></td></tr><tr><td>Objective HC PL APO 63x/1.40 OIL</td><td>Leica</td><td>11506349</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>gibco</td><td>11058</td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro OM807</td><td>Vogel</td><td>V04807</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (Pen Step)</td><td>gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Fator de necrose tumoral (TNF)-a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94948-59-1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Perfusão por Gravidade Controlada por Válvula</td><td>ALA Instrumentos Científicos</td><td>VC3-4xG</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento da atividade de 8 canais (lrrc8/vrac) de repetição rica em leucina usando transferência de energia de ressonância de förster de emissão sensibilizada (se-fret)

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

Com este método baseado em FRET, a atividade LRRC8 / VRAC pode ser monitorada durante a estimulação osmótica, e a redução no SE-FRET se correlaciona com o grau de hipotonicidade extracelular45. Resultados representativos para a ativação do canal induzida por hipotonicidade também são mostrados aqui (Figura 3 e Figura 4). Além disso, a ativação de LRRC8/VRAC por diferentes estímulos isosmóticos, como a manipulação da sinalização de diacilglicerol45 ou durante a ativação de miócitos56, pode ser observada.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig04.jpg"> 
Figura 4: Traços SE-FRET. (A) Traços SE-FRET aparentes de 5 experimentos independentes. Os dados representam ± DP médio de N = 2 a N = 7 células por campo de visão (FOV). (B) DP médio ± de todas as células (N = 31 células). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como os canais LRRC8 / VRAC também estão envolvidos na diminuição do volume apoptótico24,57, observar a atividade do canal na indução da apoptose seria outra aplicação para o método aqui descrito. Assim, o protocolo para monitorar SE-FRET em células HeLa que expressam LRRC8A-mCerulean3 e LRRC8E-mVenus foi realizado durante a aplicação de drogas indutoras de apoptose mediadas por receptor de morte. O fator de necrose tumoral (TNF)-α e a cicloheximida (CHX) demonstraram evocar correntes VRAC em poucos minutos58. Após a adição de 2 ng/mL de TNF-α e 1 μg/mL de CHX no tampão isotônico, houve uma diminuição robusta no SE-FRET (Figura 5). Substituindo o tampão por um meio hipertônico, embora contendo TNF-α e CHX, os valores de SE-FRET se recuperaram próximos da linha de base (Figura 5A), correspondendo à diminuição das correntes VRAC na solução de banho hipertônico durante o tratamento com ligante Fas indutor de apoptose58. O tratamento das células com DMSO, o solvente para TNF-α e CHX, não resultou em redução de SE-FRET. TNF-α + CHX não afetou SE-FRET de CFP-18aa-YFP, uma construção em tandem EYFP e ECFP como controle FRET59, demonstrando a especificidade para LRRC8 / VRAC ( Figura 5B ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig05v2.jpg"> 
Figura 5: Ativação isosmótica de VRAC por apoptose mediada por receptor de morte. (A) Valores SE-FRET normalizados de células HeLa que expressam LRRC8A-mCer / LRRC8E-mVen (n = 8 pratos, 23 células) ao longo do tempo. Após 15 ciclos em tampão de imagem isotônico (linha de base), a solução de banho foi substituída por tampão isotônico suplementado com 2 ng/mL de TNF-α e 1 μg/mL de cicloheximida (CHX) por 30 ciclos, seguidos por 20 ciclos de tampão de imagem hipertônico com TNF-α e CHX. O valor médio bruto de SE-FRET de cada ROI e ponto de tempo foi normalizado para a média do valor basal (isotônico) para o respectivo ROI. (B) Quantificação de valores SE-FRET normalizados de células HeLa que expressam LRRC8A / E como em A com solução isotônica contendo DMSO como controle veicular para CHX (n = 5 pratos, 12 células) ou tampão isotônico contendo indutores de apoptose como em A (n = 8 pratos, 23 células), ou de células HeLa expressando CFP-18aa-YFP com indutores de apoptose (n = 3 pratos, 9 células). Os dados representam a média dos últimos 10 pontos no tempo no respetivo buffer de células individuais (símbolos) e a média de todas as células ± SD; ** p &lt; 0,01 ANOVA ordinária de uma via seguida do teste post-hoc de comparação múltipla de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig05largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Monitoramento da atividade de 8 canais (LRRC8/VRAC) de repetição rica em leucina usando transferência de energia de ressonância de Förster de emissão sensibilizada (SE-FRET)

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

monitoring-leucine-rich-repeat-containing-8-channel-lrrc8vrac

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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